劉俊麗 宋淑軍 司少艷 盧偉鵬 郭燕川*

1. 中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所，光化學(xué)轉(zhuǎn)換與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190 2. 解放軍第306醫(yī)院特種醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，北京 100101

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性疾病，其特征是骨形成不足、骨吸收過度而導(dǎo)致骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)的惡化，其后果增加了骨脆性和骨折易感性[1]。全世界骨質(zhì)疏松的發(fā)病率在慢性疾病中已升至第5位，隨著全世界老齡人口的比例增加，骨質(zhì)疏松患者也將大幅增加。由于骨質(zhì)疏松性骨折而導(dǎo)致的慢性疼痛、關(guān)節(jié)變形、抑郁、殘疾甚至死亡，其后果嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者及家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。

膠原蛋白肽是膠原或明膠經(jīng)蛋白酶降解處理后而形成的多肽混合物，富含人體需要的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等，具有較高的消化吸收性及安全性[3]。本研究前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去卵巢大鼠每日灌胃補(bǔ)充不同劑量的骨膠原蛋白肽或骨膠原蛋白肽與檸檬酸鈣混合物，3個(gè)月后雙能X線檢測(cè)結(jié)果表明股骨骨密度與卵巢切除(ovariectomy，OVX)對(duì)照相比顯著增加。Micro-CT檢測(cè)結(jié)果表明，骨膠原蛋白肽可以顯著改善股骨的微結(jié)構(gòu)，并能夠增加膠原合成[4]。但膠原蛋白肽通過腸胃消化吸收入血后促骨活性的作用機(jī)理仍未闡明，目前尚未有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)將研究牛骨膠原蛋白肽(collagen peptides，CP)含藥血清對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞增殖與分化的影響，初步探究牛骨CP的促骨活性機(jī)理，為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3為美國(guó)ATCC公司產(chǎn)品，本室保存。DMEM培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；茜素紅染料(Alizarin red)、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽、二甲基亞砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Genview公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)自華北制藥公司；其他試劑均為市售分析純；牛骨膠原蛋白肽由包頭東寶生物技術(shù)股份有限公司提供。

本實(shí)驗(yàn)所用儀器為HERAcell150型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(賀力氏公司，德國(guó))，IMT-2型倒置顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)，550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-RAD公司，美國(guó))；耗材為培養(yǎng)皿，96孔培養(yǎng)板(Constar公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1牛骨膠原蛋白肽含藥血清的制備：12只3月齡雌性SD大鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組按每千克大鼠體重給予900 mg牛骨CP(相當(dāng)于10 g/70 kg 牛骨CP化合物口服成人每日量)灌胃給藥，對(duì)照組(control，CN)大鼠灌胃給予相同體積的無菌水。一天兩次，連續(xù)7 d，間隔6 h(血清牛骨CP化合物濃度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài))。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每籠飼養(yǎng)4只大鼠。最后一次灌胃給藥2 h后，皮下注射水合氯醛麻醉。大鼠腹主動(dòng)脈取血并分離血清，2 000 r/min離心5 min，分裝保存在-20℃中。

1.2.2細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)：取凍存的MC3T3進(jìn)行復(fù)蘇，用含100 mL/L胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)生長(zhǎng)情況定期傳代，采用第3～5次傳代后24 h的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT法檢測(cè)膠原蛋白肽含藥血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞增殖：為了明確牛骨CP含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的適宜效應(yīng)濃度，分別將實(shí)驗(yàn)組牛骨CP含藥血清與CN組血清加到無血清的DMEM中配成3%、6%、10%濃度，將MC3T3成骨細(xì)胞放在上述大鼠血清中培養(yǎng)5 d。同時(shí)，將MC3T3成骨細(xì)胞培養(yǎng)在3%大鼠血清培養(yǎng)4 d或5 d。具體步驟如下：將第3次傳代的MC3T3成骨細(xì)胞按每孔4 000個(gè)/100 μL分別接種于3個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按上述分組方案分組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。24 h細(xì)胞貼壁后換液，分別加入上述相應(yīng)藥物置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，分別在所需檢測(cè)的培養(yǎng)孔內(nèi)每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的 MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩 10 min。選擇 490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定膠原蛋白肽含藥血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞周期的影響：為了明確牛骨CP含藥血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞周期的影響，將MC3T3成骨細(xì)胞傳代以3.0×104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔板,將3%牛骨CP含藥血清與CN血清分別作用于MC3T3成骨細(xì)胞，并置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，70%乙醇固定于-20 ℃ 24 h，PBS清洗后，1 000 r/min離心5 min，加入1 mg/mL RNaseA于37 ℃處理30 min后離心，加入10 mg/mL碘化丙啶0.15 mL染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞的礦化：為測(cè)量細(xì)胞外基質(zhì)鈣沉積形成骨結(jié)節(jié)，細(xì)胞基質(zhì)用能夠結(jié)合Ca2+的茜素紅染料染色，茜素紅染色形成的紅色是礦化的指示。成骨細(xì)胞在6孔板中接種密度為8×104/孔，細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)劑(50 μg/mL抗壞血酸磷酸鹽，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，10 nmol/L地塞米松)誘導(dǎo)，每3 d換液1次，21 d天后吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，然后用4%多聚甲醛4 ℃固定30 min，用去離子水沖洗。細(xì)胞用40 mmol/L茜素紅溶液(pH=4.4)染色40 min，在室溫下用去離子水沖洗兩次，染色細(xì)胞的圖像被數(shù)碼相機(jī)(IM50，Leica，Germany)捕獲，用Pro Plus 6圖像軟件定量分析茜素紅染色的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析處理

2 結(jié)果

2.1 CP血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

3%、6%、10%的牛骨CP血清及相應(yīng)的CN血清處理MC3T3成骨細(xì)胞，5 d后MTT結(jié)果表明，3%，6%及10%的CP化合物含藥血清與相應(yīng)的CN血清比較，能夠顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖(P<0.05，圖1 A)。同時(shí)，將3%的CP血清與3%的CN血清分別處理MC3T3成骨細(xì)胞4 d或5 d，MTT結(jié)果表明，CP血清與對(duì)照相比有很好的增殖潛能(P<0.01，圖1B)，進(jìn)一步提示CP血清對(duì)成骨細(xì)胞的增殖起重要作用。

圖1 CP血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞增殖的影響(*P<0.05，**P<0.01)。A：不同濃度；B：不同培養(yǎng)時(shí)間Fig.1 The effect of CP serum on the proliferation of MC3T3 cells(*P<0.05，**P<0.01). A: Different concentration; B: Different culture time

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CP化合物含藥血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞細(xì)胞周期的效應(yīng)

MTT結(jié)果表明，不同濃度的CP血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞的增殖具有顯著促進(jìn)作用。因此，在檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)，將3% CP血清、CN血清分別作用于MC3T3成骨細(xì)胞，然后培養(yǎng) 3 d，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與CN血清相比，3%的CP血清組G1期比例顯著減少，G2/S期比例顯著增加(P<0.01，圖2)，進(jìn)一步說明3%的CP血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞具有顯著促進(jìn)作用，表明牛骨CP血清通過促進(jìn)G2/S期的百分含量而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

圖2 CP血清改變MC3T3成骨細(xì)胞細(xì)胞周期時(shí)相分布(**P<0.01)Fig.2 Alteration of cell cycle distribution of MC3T3 cells by collagen peptides in serum treatment(**P<0.01)

2.3 CP血清促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化

礦化對(duì)骨的形成非常重要。將成骨細(xì)胞分別用3%的CP血清及3%的CN血清處理后，培養(yǎng)21 d，3%的CP血清處理組的茜素紅染色顯著高于3%的CN血清，3%的CP血清處理組約為0.65±0.03，而CN血清組約為0.61±0.01(P<0.05，圖3)，表明CP血清能促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化。

3 討論

目前骨質(zhì)疏松癥主要依靠西醫(yī)化學(xué)合成藥物的治療，但均存在一定的副作用[5]。如雙膦酸鹽增加上下消化道出血、下頜骨潰爛等風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)由于通過抑制吸收過程缺乏替代老舊的，損傷的骨組織而削弱了骨的質(zhì)量[6]。重組人甲狀旁腺激素特立帕肽屬于激素類藥物，其副作用具有增加高鈣血的風(fēng)險(xiǎn)[7]。由于目前可用藥物治療療效有限性，鼓勵(lì)對(duì)疾病進(jìn)行廣泛深入研究，以尋找預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥新的藥物靶點(diǎn)。

圖3 CP血清促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化(*P<0.05)Fig.3 CP Serum promotes mineralization in osteoblasts(*P<0.05)

Nomura等[8]的研究表明，每天服用150 mg/kg及500 mg/kg CP的去卵巢大鼠長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月后，與對(duì)照組相比，CP阻止去卵巢引起的骨損失，改善去卵巢大鼠椎骨組成特點(diǎn)和生物力學(xué)強(qiáng)度，顯著增加腰椎的骨小梁數(shù)目及骨體積比，顯示骨保護(hù)效果。水解豬皮膠原蛋白(<3 kDa)可以阻止大鼠因去卵巢導(dǎo)致的骨質(zhì)流失，能夠改善腰椎的微觀結(jié)構(gòu)[9]。

由于CP是由膠原或明膠經(jīng)蛋白酶降解處理后制成的相對(duì)分子質(zhì)量不同的肽混合物，成分復(fù)雜，經(jīng)過胃腸消化吸收后，肽混合物有可能會(huì)被分解，直接用于體外藥理實(shí)驗(yàn)時(shí)，它的雜質(zhì)成分以及本身的酸堿度都影響體外細(xì)胞的生存環(huán)境，造成一些假陰性或假陽性結(jié)果出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)所用的口服圓素牌膠原肽是中科院理化研究所研發(fā)，包頭東寶生物技術(shù)公司生產(chǎn)的相對(duì)分子質(zhì)量為600～2500 D的不同混合物, 平均相對(duì)分子質(zhì)量為1000道爾頓優(yōu)質(zhì)膠原蛋白肽，這個(gè)分子量范圍的膠原蛋白活性最強(qiáng)，使用后吸收效果也是最好，單獨(dú)服用CP能顯著抑制治療組OVX大鼠股骨BMD的降低[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，將膠原肽灌胃給大鼠取其血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，比較接近藥物體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過程，其原有成分或在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性成分或代謝后失活，或本身無作用但經(jīng)代謝后產(chǎn)生作用，或通過第二信使而間接起作用都可通過血清藥理學(xué)反映出來，理論上更具備科學(xué)性、真實(shí)性，比較接近大鼠灌胃CP化合物作用在體內(nèi)產(chǎn)生藥理環(huán)境的實(shí)際過程。因此，本研究進(jìn)行實(shí)驗(yàn)闡明CP化合物含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響。

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是骨代謝的兩種主要細(xì)胞，其中成骨細(xì)胞在骨代謝過程中起著非常重要的作用，成骨細(xì)胞不僅負(fù)責(zé)骨的形成，而且負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成和活性。人體口服試驗(yàn)表明，每天攝入10 g藥物級(jí)別的水解膠原減少膝關(guān)節(jié)或髖關(guān)節(jié)等骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛，血液中的羥脯氨酸含量增加[11]。對(duì)于骨質(zhì)疏松癥患者而言，降鈣素加藥物級(jí)別的水解膠原比單獨(dú)使用降鈣素更能抑制骨膠原蛋白的分解，尿吡啶交聯(lián)的下降，表明水解膠原蛋白在治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥的潛在效用[12]。因此本實(shí)驗(yàn)以此劑量為基礎(chǔ)制備了CP血清，本研究選擇了一系列不同的牛骨CP血清濃度，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CP血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞的增殖具有顯著地促進(jìn)作用。本研究進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CP血清對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞細(xì)胞周期的效應(yīng)，表明CP血清通過促進(jìn)G2/S期的百分含量而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。因?yàn)镸C3T3具有成骨能力，茜素紅礦化染色后能夠形成紅色。研究數(shù)據(jù)表明，牛骨CP血清不僅增加成骨細(xì)胞的增殖，而且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化基質(zhì)的形成。這些研究結(jié)果表明膠原蛋白肽阻止去卵巢引起的骨損失至少部分是由于其促成骨細(xì)胞或前成骨細(xì)胞的增殖與分化功能所致。在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步從蛋白水平及RNA水平明確牛骨膠原蛋白肽促進(jìn)MC3T3成骨細(xì)胞增殖的分子機(jī)理，這為牛骨CP作為骨健康基本補(bǔ)充劑，用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。

綜上所述，不同濃度的牛骨CP血清不僅能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，增加G2S期的百分含量，而且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化基質(zhì)的形成，從而為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。