談俊曉，趙永強(qiáng)，李來好，楊賢慶，吳燕燕，魏涯，岑劍偉

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306)

南極磷蝦Euphausiasuperba是一種似蝦的無脊椎甲殼綱動(dòng)物，通常是指南極大磷蝦，其形體較小，體長(zhǎng)一般為4～6 cm，生物儲(chǔ)藏量巨大，據(jù)統(tǒng)計(jì)為3.4×108～5.4×108t[1-2]。南極磷蝦不僅蘊(yùn)含豐富的蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素和多種不飽和脂肪酸，如EPA、DHA等，還含有多種活性成分，如酶類、甲殼素和蝦青素等[3]，這些物質(zhì)有利于南極磷蝦高附加值產(chǎn)品的開發(fā)，可極大地提高南極磷蝦資源的綜合利用率。南極磷蝦中蝦青素多為3R，3’R型，主要以酯化形式存在[4]，由于中國存在大量的南極磷蝦加工廢棄物，故南極磷蝦可作為提取蝦青素的有效來源。蝦青素是一種類胡蘿卜素，易溶于丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑，具有3種旋光異構(gòu)體：3S，3’S、3R，3’R和3S，3’R，以及2種順反異構(gòu)體，即Z 型(順式)異構(gòu)體和 E 型(反式)異構(gòu)體[5]。

蝦青素具有多種生理學(xué)活性，包括抗氧化性、抗炎性、提高免疫力、預(yù)防心血管疾病和抗腫瘤等作用[6-10]，因此，在食品飼料、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有重要作用。目前，從水產(chǎn)動(dòng)物中提取蝦青素的方法主要有有機(jī)溶劑法、超臨界萃取法、酶解法，以及其他新技術(shù)輔助法，如超聲波、超高壓等[11-15]。酶解法可將與蝦青素結(jié)合的蛋白質(zhì)降解，易于蝦青素的提取，相對(duì)于其他方法，具有反應(yīng)條件溫和、設(shè)備要求簡(jiǎn)便、用料少等優(yōu)點(diǎn)。由于南極磷蝦個(gè)體較小，且多數(shù)以“蝦磚”的形式貯藏，因此，以南極磷蝦為原料提取蝦青素的關(guān)鍵是蝦肉蛋白質(zhì)的脫除技術(shù)。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用pH調(diào)節(jié)法對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)分離時(shí)效率較低[16]，目前，多采用酶解法(木瓜蛋白酶或Alcalase堿性蛋白酶)從水產(chǎn)動(dòng)物中提取蝦青素[17-18]，主要是由于采用木瓜蛋白酶或Alcalase堿性蛋白酶酶解后，酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)和殼聚糖的回收率高[19-20]，但采用2種酶復(fù)合酶解提取蝦青素的試驗(yàn)還未見報(bào)道。本試驗(yàn)中，以冷凍南極磷蝦為原料，經(jīng)過復(fù)合酶解處理后用無水乙醇對(duì)南極磷蝦中的蝦青素進(jìn)行提取，考察提取工藝參數(shù)對(duì)蝦青素提取率的影響，并通過優(yōu)化試驗(yàn)確定酶解的最優(yōu)條件，旨在為南極磷蝦的開發(fā)及利用加工提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及藥品 試驗(yàn)用冷凍南極磷蝦由上海開創(chuàng)遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司提供(2015年)，-20 ℃下冷凍保存；木瓜蛋白酶(800 U/mg)、Alcalase堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)、蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，以及無水硫酸鈉、氯化鈉均購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司(分析純)；無水乙醇、丙酮、石油醚均購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司(分析純)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 JYL-C022E型料理機(jī)(山東九陽股份有限公司)；GB204型電子天平(瑞士METTLER公司)；SHZ-82A型水浴恒溫振蕩器(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)；3K30型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；MMV-1000W型振搖器(廣州托普儀器有限公司)；UV2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司)。

1.2 方法

1.2.1 南極磷蝦基本成分及總類胡蘿卜素含量測(cè)定 采用直接干燥法(GB/T 5009.3—2016)、高溫煅燒法(GB/T 5009.4—2016)、微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2010)和索氏抽提法(GB/T 5009.6—2010)分別測(cè)定水分、灰分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量。

總類胡蘿卜素含量的測(cè)定參照Niamnuy等[21]的方法略做修改。稱取5 g左右冷凍南極磷蝦樣品，置于50 mL離心管中，加入20 mL丙酮均質(zhì)后于4 ℃下以4000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)4次萃取至上清液基本無色，合并丙酮萃取液于分液漏斗中。向分液漏斗中加入等量的石油醚，充分搖動(dòng)后加入100 mL濃度為1 g/L的氯化鈉溶液，靜置分層后棄去下相，加無水硫酸鈉干燥后過濾，將濾液于40 ℃以下減壓濃縮至干，即得南極磷蝦類胡蘿卜素提取物。將提取物復(fù)溶于50 mL無水乙醇中，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定提取物中類胡蘿卜素的含量。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。

1.2.2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[15]準(zhǔn)確稱取一定量的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于乙醇配制成濃度為1～8 μg/mL的蝦青素乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描最大吸收波長(zhǎng)并測(cè)定各濃度吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定，蝦青素在乙醇中的最大吸收波長(zhǎng)為478 nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線的一次回歸方程為y=0.077x-0.0125，式中x為蝦青素質(zhì)量濃度(μg/mL)，y為對(duì)應(yīng)吸光值OD478 nm，線性回歸相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，說明蝦青素質(zhì)量濃度在1～8 μg/mL范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。

1.2.3 南極磷蝦蝦青素復(fù)合酶法提取工藝 取冷凍南極磷蝦用料理機(jī)攪碎后稱取糊狀濕蝦樣品5 g，按比例加入蒸餾水，升溫至一定溫度后，按比例加入Alcalase堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，恒溫振蕩水浴酶解后，冰水浴冷卻，4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，取離心沉淀物加入無水乙醇振蕩提取后于4000 r/min離心5 min，收集上清液，重復(fù)操作2次，合并所得上清液，用無水乙醇定容后，再用紫外分光光度法測(cè)定蝦青素含量。蝦青素提取率計(jì)算公式為

蝦青素提取率=ma/(c×mf)×100%。

其中：ma為測(cè)定條件下蝦青素的提取量(μg)；c為南極磷蝦中總類胡蘿卜素的含量(μg/g)；mf為南極磷蝦濕質(zhì)量(g)。

1.2.4 復(fù)合酶法提取南極磷蝦蝦青素的單因素試驗(yàn) 由于蝦青素在酸堿環(huán)境中均不穩(wěn)定[22]，因此，單因素試驗(yàn)均在自然pH條件(pH 7.1)下進(jìn)行。以下單因素確定試驗(yàn)中，每組試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行，除要考察的因素重新設(shè)定外，其他因素均設(shè)定一致，即酶底比為0.5%，水料比(mL∶g)為2∶1、酶解時(shí)間為2 h，酶解溫度為55 ℃，無水乙醇料液比(g∶mL)為1∶5，振蕩時(shí)間為5 min，Alcalase堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶比例為3∶2。

這根長(zhǎng)發(fā)絲到底是誰的呢？思雨接觸的妻子之外的女人，只有欣竹身上算是能發(fā)生點(diǎn)聯(lián)想的人。再?zèng)]有別的什么女人可以聯(lián)想了。

(1) 復(fù)合酶比例的確定。在其他因素不變的條件下，分別考察Alcalase堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶單一添加，以及二者的比例為4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4時(shí)對(duì)蝦青素提取率的影響。

(2) 酶底比的確定。在其他因素不變的條件下，考察酶底比為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)對(duì)蝦青素提取率的影響。

(3) 水料比的確定。在其他因素不變的條件下，考察水料比(mL∶g)為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1時(shí)對(duì)蝦青素提取率的影響。

(4) 酶解時(shí)間的確定。在其他因素不變的條件下，考察酶解時(shí)間為1、2、3、4、5、6 h時(shí)對(duì)蝦青素提取率的影響。

(5) 酶解溫度的確定。在其他因素不變的條件下，考察酶解溫度為35、40、45、50、55、60 ℃時(shí)對(duì)蝦青素提取率的影響。

(6) 無水乙醇料液比的確定。在其他因素不變的條件下，考察無水乙醇料液比(g∶mL)為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7時(shí)對(duì)蝦青素提取率的影響。

(7) 振蕩時(shí)間的確定。在其他因素不變的條件下，考察振蕩時(shí)間為5、10、15、20、25、30 min時(shí)對(duì)蝦青素提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合各單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)蝦青素提取效果有顯著影響的3個(gè)因素：酶底比(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)為自變量，以蝦青素提取率(Y)為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平設(shè)置見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦基本成分含量及總類胡蘿卜素含量

經(jīng)測(cè)定，南極磷蝦基本營養(yǎng)成分(以濕質(zhì)量計(jì))分別為水分79.81%±0.08%、灰分3.06%±0.01%、粗蛋白質(zhì)12.31%±0.13%、粗脂肪3.41%±0.13%，總類胡蘿卜素含量為(69.59±3.72)μg/g濕質(zhì)量。各成分含量與宋翔[23]報(bào)道的結(jié)果差別不大。其中粗脂肪含量略高，粗蛋白質(zhì)含量略低，這是由于南極磷蝦的生長(zhǎng)容易受時(shí)間和地域的影響，不同季節(jié)南極磷蝦體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)含量往往不同，且兩者呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[24]。

2.2 復(fù)合酶法提取南極磷蝦蝦青素單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶種類和復(fù)合酶比例對(duì)蝦青素提取率的影響 從表2可見：與空白組相比，分別使用Alcalase堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)南極磷蝦進(jìn)行酶解處理后，均可提高蝦青素的提取率，但用木瓜蛋白酶提取時(shí)對(duì)蝦青素的提取率較對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)，而用Alcalase堿性蛋白酶提取時(shí)蝦青素提取率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說明Alcalase堿性蛋白酶的酶解效果優(yōu)于木瓜蛋白酶；進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)合酶酶解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加酶量一定時(shí)，蝦青素提取率在Alcalase堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶比例為3∶2時(shí)達(dá)到最大且顯著高于該兩種酶單獨(dú)作用的結(jié)果(P<0.05)，這可能是由于一定比例的兩種酶復(fù)合具有協(xié)同酶解的作用，從而提高了酶解效果。因此，后續(xù)試驗(yàn)均以Alcalase堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶比例為3∶2進(jìn)行。

表2 不同酶種類和復(fù)合比例下蝦青素提取率

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences

2.2.2 酶底比對(duì)蝦青素提取率的影響 從圖1可見:不同酶底比對(duì)蝦青素提取率影響較大，南極磷蝦蝦青素提取率隨酶底比的增大呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì);當(dāng)酶底比為1.5%時(shí)，蝦青素提取率達(dá)到最高且顯著高于其他各組(P<0.05)，繼續(xù)增加酶底比時(shí)，蝦青素提取率顯著下降(P<0.05)。這可能是由于當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，隨著酶用量的增加，酶解反應(yīng)速度加快，蝦青素提取率呈明顯上升趨勢(shì)；而當(dāng)酶用量超出了一定范圍后，由于酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)，加大酶底比反而會(huì)抑制酶解作用[25]，從而導(dǎo)致蝦青素提取率下降。因此，使用1.5%的酶底比為較適添加量。

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖1 酶底比對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme-substrate ratio on the extraction rate of astaxanthin

2.2.3 水料比對(duì)蝦青素提取率的影響 從圖2可見：南極磷蝦蝦青素提取率隨水料比的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)水料比(mL∶g)為4∶1時(shí)，蝦青素提取率達(dá)到最高，當(dāng)水料比(mL∶g)為4∶1、5∶1、6∶1時(shí)，蝦青素提取率之間無顯著性差異(P>0.05)，但繼續(xù)增大水料比，蝦青素提取率顯著降低(P<0.05)。這是因?yàn)楫?dāng)水料比太小時(shí)，樣品流動(dòng)性較差，酶解作用時(shí)復(fù)合酶與樣品不能充分接觸，從而使反應(yīng)不易進(jìn)行，但當(dāng)水料比過大時(shí)，雖然樣品流動(dòng)性更好，但復(fù)合酶和底物的濃度都下降，從而使酶解效果減弱。因此，選擇水料比(mL∶g)為4∶1時(shí)為較適工藝參數(shù)。

圖2 水料比對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.2 Effect of water-substrate ratio on the extraction rate of astaxanthin

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響 從圖3可知見：蝦青素提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間為1、3、4、5 h時(shí)，蝦青素提取率間無顯著性差異(P>0.05)，當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，蝦青素提取率顯著提升至最高(P<0.05)，當(dāng)酶解時(shí)間為6 h時(shí)，蝦青素提取率降低至最低(P<0.05)。這種變化趨勢(shì)可能是由于在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解反應(yīng)越完全；超出一定范圍后，酶解時(shí)間的延長(zhǎng)反而會(huì)抑制酶活力的發(fā)揮，加上蝦青素在提取液中不穩(wěn)定而引起分解，從而導(dǎo)致了蝦青素提取率下降。因此，選擇酶解時(shí)間為2 h較佳。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of astaxanthin

2.2.5 酶解溫度對(duì)蝦青素提取率的影響 不同酶解溫度對(duì)蝦青素提取率的影響較大，Vieira等[26]關(guān)于利用蛋白酶水解蝦廢物生產(chǎn)具有清除自由基活性的肽和回收總類胡蘿卜素的研究中也表示，溫度對(duì)不溶性部分中總類胡蘿卜素的回收有顯著影響。從圖4可見，蝦青素提取率隨酶解溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，并在50 ℃時(shí)達(dá)到最高。這是由于在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高酶活性增強(qiáng)，酶解效果好，蝦青素提取率也隨之增高；但超過50 ℃后，高溫會(huì)使酶變性失活，導(dǎo)致酶解作用減弱，因此，選擇酶解溫度為50 ℃左右較好。

圖4 酶解溫度對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of astaxanthin

2.2.6 料液比對(duì)蝦青素提取率的影響 從圖5可見：蝦青素提取率隨提取劑用量的增加呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，可能是由于在一定范圍內(nèi)隨著提取劑的增加，蝦青素溶解越來越充分；蝦青素提取率在料液比(g∶mL)為1∶7時(shí)達(dá)到最高，為72.56%±1.17%，但與料液比(g∶mL)為1∶4、1∶5、1∶6時(shí)相比，蝦青素提取率無顯著性差異(P>0.05)，此結(jié)果與宋素梅[27]分析料液比對(duì)蝦青素提取效果的結(jié)果基本一致。據(jù)此，從經(jīng)濟(jì)實(shí)際出發(fā)，選擇料液比(g∶mL)1∶4為適宜工藝參數(shù)。

圖5 料液比對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.5 Effect of substrate-ethanol ratio on the extraction rate of astaxanthin

2.2.7 振蕩時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響 采用機(jī)械震蕩提取，可有效促進(jìn)提取物質(zhì)與提取劑的充分接觸，大大縮短提取時(shí)間，且不需要進(jìn)行加熱[28]。從圖6可見：蝦青素提取率隨振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)振蕩時(shí)間為10、15、20、25 min時(shí)，蝦青素提取率無顯著性差異(P>0.05)，當(dāng)振蕩時(shí)間延長(zhǎng)至30 min時(shí)，蝦青素提取率較10、20 min時(shí)顯著降低(P<0.05)。可能是由于時(shí)間過短時(shí)，提取劑與樣品接觸不充分，蝦青素不能充分溶解在提取劑中，但時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，蝦青素易降解導(dǎo)致提取效果降低。因此，選擇振蕩時(shí)間為10 min較佳。

圖6 振蕩時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.6 Effect of oscillation time on the extraction rate of astaxanthin

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 模型建立及方差分析 由單因素試驗(yàn)可知，不同因素對(duì)蝦青素提取率影響程度不同，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇出影響較大的3個(gè)因素：酶底比(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)，作為自變量，并固定水料比(mL∶g)為4∶1、料液比(g∶mL)為1∶4、振蕩時(shí)間10 min，以蝦青素提取率為響應(yīng)值，自變量因素和水平設(shè)置如表1所示，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，各因素的試驗(yàn)組合及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)多元回歸擬合，得到蝦青素提取率的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=90.83+0.93A+0.40B+2.03C-0.19AB+0.37AC+0.42BC-2.51A2-1.72B2-5.83C2。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化結(jié)果的確定 響應(yīng)面是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，因素對(duì)響應(yīng)值影響越大，曲面坡度越大。而等高線的形狀則可以反映兩兩因素間交互作用的顯著程度。橢圓形表示兩因素交互作用顯著，近似圓形則表明交互項(xiàng)的影響不顯著[29]。各因素交互作用對(duì)蝦青素提取率的影響如圖7～圖9所示，可以看出，酶解溫度對(duì)蝦青素提取率的影響最大，其次為酶底比和酶解時(shí)間；酶底比與酶解時(shí)間交互作用對(duì)蝦青素提取率影響不顯著(P>0.05)，酶底比與酶解溫度、酶解時(shí)間與酶解溫度交互作用對(duì)蝦青素提取率影響顯著(P<0.05)，且酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用影響大于酶底比與酶解溫度的交互作用，與方差分析結(jié)果一致。

通過響應(yīng)面軟件分析，得出復(fù)合酶解南極磷蝦提取蝦青素的最優(yōu)工藝條件：A=1.60，B=2.13，C=50.93，即酶底比為1.60%、酶解時(shí)間為2.13 h、酶解溫度為50.93 ℃、水料比(mL∶g)為4∶1、料液比(g∶mL)為1∶4、振蕩時(shí)間為10 min，在此條件下，蝦青素提取率的理論值為91.13%。

圖7 酶底比與酶解時(shí)間交互作用對(duì)蝦青素提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interactive effect of enzyme-substrate ratio and enzymolysis time on the extraction rate of astaxanthin

圖8 酶底比與酶解溫度交互作用對(duì)蝦青素提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the interactive effect of enzyme-substrate ratio and enzymolysis temperature on the extraction rate of astaxanthin

圖9 酶解時(shí)間與酶解溫度交互作用對(duì)蝦青素提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of the interactive effect of enzymolysis time and temperature on the extraction rate of astaxanthin

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Tab.4 ANOVA for response surface quadratic model

注：*表示有顯著性影響(P<0.05),**表示有極顯著影響(P<0.01)

Note: *means significant effect(P<0.05)，** means very significant effect(P<0.01)

2.3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn) 為驗(yàn)證該模型對(duì)蝦青素最大粗提取率的預(yù)測(cè)是否準(zhǔn)確，結(jié)合實(shí)際操作情況，將最佳工藝條件修正為酶底比為1.6%、酶解時(shí)間為2.1 h、酶解溫度為51 ℃、水料比(mL∶g)為4∶1、料液比(g∶mL)為1∶4、振蕩時(shí)間為10 min，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，蝦青素提取率平均為90.42%±0.39%，與理論值相對(duì)誤差約為0.79%，說明模型是準(zhǔn)確有效的。與宋素梅[27]對(duì)酶解后的蝦殼殘?jiān)统恋矸謩e提取蝦青素的研究相比，本研究中蝦青素提取率與宋素梅分別采用丙酮提取酶解后的蝦殼殘?jiān)?15.6%)與乙醇提取酶解后的沉淀(73.7%)之和相當(dāng)，但是大大簡(jiǎn)化了提取工藝，縮短了酶解時(shí)間和提取時(shí)間，一定程度上提高了提取效率，并且通過對(duì)Alcalase堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶兩者復(fù)配，酶解溫度也得到了下降，有利于保證蝦青素不被熱降解并節(jié)約能源；與翁婷等[30]采用超臨界CO2萃取法提取南極磷蝦中蝦青素的研究中蝦青素提取率(84.4%)相比，本研究中最終提取率略高，但同時(shí)相比于超臨界CO2萃取技術(shù)，酶解法提取產(chǎn)物的純度可能會(huì)略低，因此，本研究中所得產(chǎn)物為蝦青素粗提物，還需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化研究。

3 結(jié)論

本研究中通過采用復(fù)合酶酶解的方法，將Alcalase堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)配，對(duì)南極磷蝦進(jìn)行酶解處理后，有效提高了南極磷蝦蝦青素的提取效率。以蝦青素提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定復(fù)合酶法提取蝦青素的最佳工藝條件為酶底比為1.6%、酶解時(shí)間為2.1 h、酶解溫度為51 ℃、水料比(mL∶g)為4∶1、料液比(g∶mL)為1∶4、振蕩時(shí)間為10 min，在此條件下蝦青素提取率為90.42%±0.39%，與預(yù)測(cè)值接近，說明響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶酶解南極磷蝦提取蝦青素工藝條件的優(yōu)化是可行的。