張東升，葛紅生，石澤陽，周瑋

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

因益生菌能改善水質(zhì)[1-2]，提高養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)量[3]、免疫力[4-5]和餌料利用率[1]，從而被水產(chǎn)養(yǎng)殖者廣泛使用[1]。根據(jù)功能不同，水產(chǎn)益生菌分為用于提高水生動(dòng)物生長、免疫和餌料利用率的飼料補(bǔ)助劑，以及用于改善水質(zhì)的水質(zhì)改良劑。用來改善水質(zhì)的益生菌通常采用潑灑[6-8]方式。國內(nèi)用于改善池塘水質(zhì)的益生菌一般先用池塘水加紅糖或麥麩的方式活化5～6 h[3,7]，而國外則使用滅菌的純凈水在27～32 ℃下活化益生菌和酶制劑16～18 h[1]，再將活化菌潑灑在池塘中。但也有部分芽孢桿菌生產(chǎn)商提供的芽孢菌按比例可直接潑入養(yǎng)殖池塘中。目前，對使用芽孢還是活化后的營養(yǎng)細(xì)胞，哪一種更有利于益生菌在池塘中的生長尚無文獻(xiàn)報(bào)道。此外，國內(nèi)外益生菌的生產(chǎn)與實(shí)際使用往往脫節(jié)，生產(chǎn)廠商常根據(jù)益生菌產(chǎn)量最大化原則選擇培養(yǎng)基里的碳、氮源和環(huán)境條件培養(yǎng)益生菌，往往不考慮益生菌使用場所的營養(yǎng)和環(huán)境，當(dāng)益生菌培養(yǎng)基和使用場所的營養(yǎng)環(huán)境差異較大時(shí)，是否會影響益生菌的生長目前尚無報(bào)道。

前期試驗(yàn)中，作者從大連市某刺參池塘中分離出一株高效降解刺參池塘有機(jī)質(zhì)的益生印度芽孢桿菌L15菌株[9]，并研究了發(fā)酵培養(yǎng)L15菌株的海水、淡水發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[10]，淡水發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株可以獲得較好的芽孢產(chǎn)量，其降解刺參底泥有機(jī)質(zhì)提取液COD的能力與海水發(fā)酵培養(yǎng)基相近[10]。為考察用淡水培養(yǎng)基培養(yǎng)L15菌株幾代后，在海水環(huán)境中的生長和功能是否發(fā)生了變化，本試驗(yàn)中測定了用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株5代后的芽孢和營養(yǎng)細(xì)胞接種在不同營養(yǎng)和環(huán)境培養(yǎng)基后的生長情況，旨在為L15菌株今后的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)，也為其他益生菌株的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基原料 芽孢桿菌L15菌株取

自大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心。培養(yǎng)基原料麥麩、豆粕購買于大連市某飼料廠，培養(yǎng)基其他成分均為化學(xué)分析純試劑。

1.1.2 培養(yǎng)基及其配制

2216E培養(yǎng)基(Z)：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，F(xiàn)ePO40.01 g/L，陳海水1000 mL，pH 7.0～7.5。

海水發(fā)酵培養(yǎng)基(S)：豆粕2.5 g，麥麩2.5 g，陳海水1000 mL，pH 7.0～7.5。

淡水發(fā)酵培養(yǎng)基(F)：豆粕2.5 g，麥麩2.5 g，純水1000 mL，分別加入1 mL 0.025 mg/mL的MgCl2、MnCl2、CaCl2，pH 7.0～7.5。

將上述各種培養(yǎng)基配好后，分別裝到50 mL的大試管中，每管裝10 mL，于121 ℃下滅菌20 min，冷卻待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞和芽孢懸液的制備 將L15菌株分別接種于2216E(Z)、淡水(F)、海水(S)的固體發(fā)酵平板培養(yǎng)基上，于25 ℃下培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)接到各自同樣的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，重復(fù)3次，最后各自接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，于冰箱(4 ℃)中保存，冷藏1個(gè)月后，用接種針分別劃線接種在各自原培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h，然后用接種環(huán)刮下，懸浮在滅菌海水中，作為L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞用于試驗(yàn)。

同時(shí)，將上述冷藏的L15菌株用接種環(huán)刮下置于滅菌的海水中，搖勻，作為L15菌株芽孢用于試驗(yàn)。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，通過稀釋使試管中的營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢量相近，最終稀釋至密度為(1.1～1.2)×107cell/mL。

1.2.2 培養(yǎng)基變化對L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞和芽孢生長的影響試驗(yàn) 將上述制備好的L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞和芽孢各 0.01 mL 分別接種到Z、F、S培養(yǎng)基中，共18個(gè)組合(表1)，每組重復(fù)3次，然后，從每組中取出3 mL培養(yǎng)液于比色皿(直徑為1 cm的玻璃比色皿)中，在721分光光度計(jì)(波長 600 nm)下測定原始菌液吸光度值OD0。然后將這些試管放于25 ℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別培養(yǎng)72、96 h時(shí)取出，靜止10 min，取出3 mL培養(yǎng)液分別測定每支試管中菌液的吸光度值OD72 h、OD96 h，用OD72 h-OD0、OD96 h-OD0分別表示L15菌株在72 h和96 h的生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件對不同培養(yǎng)基上的細(xì)菌細(xì)胞生長數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design

注：在試驗(yàn)組中第二個(gè)下標(biāo)字母Z、F、S分別表示后培養(yǎng)基，CZ、CF、CS分別表示來自前培養(yǎng)基Z、F、S培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞;SZ、SF、SS分別表示來自前培養(yǎng)基Z、F、S培養(yǎng)的芽孢

Note:The second subscript letters Z,F and S in the experimental groups represent different follow media， respectively. CZ,CFand CSrepresent vegetative cells in the former culture media Z, F, S culture， respectively. SZ, SFand SSrepresent spores from the former media Z, F and S culture， respectively

2 結(jié)果與分析

2.1 接種營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢對L15菌株生長的影響

從圖1可見：培養(yǎng)到72 h時(shí),18組中有6組接種營養(yǎng)細(xì)胞的L15菌株增長量大于接種芽孢的增長量，占接種營養(yǎng)細(xì)胞的2/3；而培養(yǎng)到96 h時(shí)，只有4組接種營養(yǎng)細(xì)胞的L15菌株增長量大于接種芽孢的增長量，說明有些芽孢組在72 h 后仍繼續(xù)生長，其中，接種由S培養(yǎng)基培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞后的細(xì)菌增長量均高于接種相同培養(yǎng)基培養(yǎng)的芽孢后的增長量。72 h時(shí)，只有一組接種由F培養(yǎng)基培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞后的細(xì)菌增長量大于接種相同培養(yǎng)基培養(yǎng)的芽孢后的細(xì)菌增長量；但96 h時(shí)，接種由F培養(yǎng)基培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞后的細(xì)菌增長量均小于接種相同培養(yǎng)基培養(yǎng)的芽孢后的增長量。而接種由Z培養(yǎng)基培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢后的細(xì)菌增長量無明顯規(guī)律。說明并非接種營養(yǎng)細(xì)胞的L15菌株增長量總是高于接種芽孢的增長量。

2.2 培養(yǎng)基對L15菌株生長的影響

從培養(yǎng)基的碳、氮源分子量大小分析，Z培養(yǎng)基的碳、氮源分子量較小，可以被細(xì)菌細(xì)胞直接吸收，而S培養(yǎng)基和F培養(yǎng)基的碳、氮源由大豆和麥麩組成，分子量較大，需要酶降解后才可吸收。從環(huán)境上分析，Z培養(yǎng)基和S培養(yǎng)基均由海水配制，F(xiàn)培養(yǎng)基由蒸餾水配制。

從圖2、圖3可見，由營養(yǎng)易被細(xì)菌直接吸收的Z培養(yǎng)基培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞CZ轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)不易被直接吸收的F和S培養(yǎng)基后，L15菌株增長量降低，且前培養(yǎng)基Z和后培養(yǎng)基F鹽度差異大時(shí)，鹽度和營養(yǎng)兩因素對L15菌株生長的協(xié)同作用較大，因此，相比S培養(yǎng)基，CZ接種到F培養(yǎng)基里的L15菌株增長量最小。當(dāng)由營養(yǎng)不易被直接吸收的F和S培養(yǎng)基培養(yǎng)的CF和CS轉(zhuǎn)移到易被直接吸收的Z培養(yǎng)基時(shí)，L15菌株增長量增大，且前培養(yǎng)基F和后培養(yǎng)基Z鹽度差異大時(shí)，營養(yǎng)和鹽度兩因素對L15菌株生長的協(xié)同作用較小。這表明，前后培養(yǎng)基營養(yǎng)的難易吸收性決定了接種L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞的生長速率。

圖1 接種營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢對L15菌株生長的影響Fig.1 Effect of vegetative cells and spores on growth of L15 strain

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖2 接種營養(yǎng)細(xì)胞的L15菌株在72 h的增量Fig.2 Increase in number of L15 strain in 72 h by inoculation vegetative cells

圖3 接種營養(yǎng)細(xì)胞的L15菌株在96 h的增量Fig.3 Increase in number of L15 strain in 96 h by inoculation vegetative cells

從圖4、圖5可見，由Z培養(yǎng)基培養(yǎng)的SZ接種到F和S培養(yǎng)基后，或由F和S培養(yǎng)基培養(yǎng)的SF和SS接種到Z培養(yǎng)基后，L15菌株的生長情況與上述接種營養(yǎng)細(xì)胞的生長情況類似，但與接種營養(yǎng)細(xì)胞的L15菌株相比，接種芽孢的L15菌株由Z培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到F和S培養(yǎng)基后前后培養(yǎng)基鹽度和營養(yǎng)的差異并沒有體現(xiàn)出較大的協(xié)同作用，L15菌株在F培養(yǎng)基中的增加量并沒有降低，反而比轉(zhuǎn)移到S培養(yǎng)基中增長量要大，表明接種芽孢后的L15菌株增長量更依賴于營養(yǎng)直接吸收性的難易，鹽度協(xié)同作用較小。

2.3 鹽度對L15菌株生長的影響

S和F培養(yǎng)基的碳、氮源組成一致，但S培養(yǎng)基液體成分為海水，F(xiàn)培養(yǎng)基液體成分為淡水。同一種培養(yǎng)基(F或S)培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)移到F和S培養(yǎng)基里，培養(yǎng)72 h時(shí)生長差異不顯著(P>0.05)(圖2)，但培養(yǎng)到96 h時(shí)，在F培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長均顯著高于在S培養(yǎng)基上的生長(P<0.05)(圖3)。同樣條件下，接種L15菌株芽孢，在F和S培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h時(shí)，L15菌株增長量差異也不顯著(P>0.05)(圖4)，但培養(yǎng)到96 h時(shí)，接種SF芽孢在F培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長顯著大于在

圖4 接種芽孢的L15菌株在72 h的增量Fig.4 Increase in number of L15 strain in 72 h by inoculation spores

圖5 接種芽孢的L15菌株在96 h的增量Fig.5 Increase in number of L15 strain in 96 h by inoculation spores

S培養(yǎng)基上的生長(P<0.05)，但接種SS芽孢在F和S兩種培養(yǎng)基上的生長差異不顯著(P>0.05)。這說明無論接種的是營養(yǎng)細(xì)胞還是芽孢，鹽度對L15菌株穩(wěn)定期之前的生長影響不顯著，但較高鹽度縮短了L15菌株對數(shù)生長期時(shí)間，尤其縮短了L15菌株由F培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到S培養(yǎng)基后的對數(shù)生長時(shí)間。

3 討論

3.1 接種營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢對L15菌株生長的影響

細(xì)菌轉(zhuǎn)入新環(huán)境中生長的快慢，除了受細(xì)菌遺傳因子影響外，還受培養(yǎng)基營養(yǎng)組成和培養(yǎng)條件的影響，如碳、氮源的種類和數(shù)量[11-12]、pH、溫度[13]、溶氧、氧化還原電位、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、接種體積[14]、接種量[11,15-16]，以及接種細(xì)菌所處狀態(tài)等。本研究中通過測定不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞或芽孢轉(zhuǎn)入與原培養(yǎng)基相同或不同培養(yǎng)基后的生長狀況，對指導(dǎo)益生菌使用和研究益生菌的培養(yǎng)均具有重要意義。

一般認(rèn)為，接種營養(yǎng)細(xì)胞后的細(xì)菌增長量高于接種芽孢后的增長量，主要是因?yàn)橹笖?shù)期細(xì)菌處于生長旺盛期，接入新培養(yǎng)基后其停滯期較短，而芽孢生長需要萌發(fā)時(shí)間，萌發(fā)后細(xì)胞需要較長時(shí)間的物質(zhì)積累才能進(jìn)入分裂期。但本研究中發(fā)現(xiàn)并非如此，接種由S培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞后的細(xì)菌增長量小于接種芽孢后的細(xì)菌增長量，而接種由F培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞后的細(xì)菌增長量卻低于接種芽孢后的細(xì)菌增長量，接種芽孢后的細(xì)菌增長量大于接種營養(yǎng)細(xì)胞后的增長量的機(jī)理有待進(jìn)一步驗(yàn)證，但可對益生菌使用提供借鑒，并不是改善池塘水質(zhì)用益生菌均需要活化，而要根據(jù)益生菌發(fā)酵培養(yǎng)基和使用環(huán)境進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以便確定使用該益生菌的營養(yǎng)細(xì)胞還是芽孢。

3.2 培養(yǎng)基物質(zhì)組成對L15菌株生長的影響

細(xì)菌可以直接吸收小分子物質(zhì)，大分子物質(zhì)則必須通過細(xì)菌分泌的胞外酶將其降解成小分子物質(zhì)后才可被吸收，因此，細(xì)菌在小分子環(huán)境中的生長速度高于在大分子物質(zhì)環(huán)境中的生長速度。本研究中的結(jié)果與此相同，但當(dāng)L15菌株從小分子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到大分子培養(yǎng)基(2216E)后，其生長速度有時(shí)低于原來一直由大分子培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長速度，這可能是細(xì)菌需要一個(gè)適應(yīng)過程，因此，生產(chǎn)益生菌時(shí)，應(yīng)盡量選用培養(yǎng)基碳氮源組成與使用場所營養(yǎng)組成相近的碳氮源。

3.3 鹽度對L15菌株生長的影響

鹽度影響細(xì)菌生長和代謝，環(huán)境中的鹽度在細(xì)菌生長最適范圍外時(shí)，細(xì)菌生長和新陳代謝活性降低，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致細(xì)胞脫水最后發(fā)生質(zhì)壁分離，甚至死亡[17],L15菌株最適生長鹽度為15～20[9],在淡水和海水中生長稍差，但在淡水中生長略高于海水，因此，當(dāng)由F培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株接種到S培養(yǎng)基時(shí)，生長率略有降低，培養(yǎng)到72 h時(shí)，生長差異不顯著，但培養(yǎng)到96 h時(shí)，接種到S培養(yǎng)基中的L15菌株生長顯著降低，而接種到F培養(yǎng)基中的L15菌株仍在繼續(xù)生長，由此可見，在F、S培養(yǎng)基中的生長出現(xiàn)了顯著差異，但是將S培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞接種在F和S培養(yǎng)基后，在96 h時(shí)都在繼續(xù)生長，因此，在海水環(huán)境中使用L15菌株時(shí)，最好使用S培養(yǎng)基培養(yǎng)的營養(yǎng)細(xì)胞為好。因?yàn)橛玫l(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)第5代的L15菌株轉(zhuǎn)移到F和S培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，其生長不如在海水發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)的L15菌株，因此，如果用淡水發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)L15菌株進(jìn)行使用的話，應(yīng)以培養(yǎng)第一代的L15菌株為好。