馬學(xué)艷，杜興偉，聞海波，金武，徐跑、3，華丹，顧若波、3

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中美淡水貝類種質(zhì)資源保護(hù)及利用國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081)

三角帆蚌Hyriopsiscumingii隸屬于蚌科Unionidae、珠蚌亞科Unioninae、帆蚌屬Hyriopsis，是中國特有種，也是中國主要的淡水優(yōu)質(zhì)育珠蚌之一[1]。三角帆蚌鉤介幼蟲的變態(tài)發(fā)育需要寄生到合適的寄主魚上，從寄主魚體攝取營養(yǎng)物質(zhì)變態(tài)發(fā)育成稚蚌，脫落后營底棲生活[2-3]。研究表明，三角帆蚌鉤介幼蟲在黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco[4]、草魚Ctenopharyngodonidellus[5]、尼羅羅非魚Oreochromisniloticus[6]上的寄生效果較好。

Reuling[7]研究指出，寄主魚的血液營養(yǎng)成分和機(jī)體免疫反應(yīng)可能是鉤介幼蟲能否變態(tài)成功的決定性因素。在鉤介幼蟲寄生過程中，寄主魚的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物對(duì)其發(fā)育起到非常重要的作用[8]。對(duì)淡水蚌類鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育的寄主特異性已有較多研究[9-10]，寄生對(duì)寄主魚營養(yǎng)指標(biāo)的研究僅見本課題組對(duì)三角帆蚌鉤介幼蟲寄生對(duì)羅非魚血漿生化指標(biāo)的研究[6]，初步揭示了寄主魚血漿的主要營養(yǎng)成分變化規(guī)律，以及對(duì)三角帆蚌鉤介幼蟲寄生脅迫對(duì)黃顙魚耗氧率和排氨率的影響進(jìn)行過研究[11]，結(jié)果表明，寄生脅迫對(duì)黃顙魚耗氧率未產(chǎn)生顯著影響，而寄主魚排氨率顯著增加，且鉤介幼蟲寄生數(shù)量與排氨率的增加存在正相關(guān)性，表明寄生導(dǎo)致寄主魚含氮物質(zhì)代謝增加。

基于以上研究，本研究中用三角帆蚌鉤介幼蟲感染黃顙魚，測定寄主魚血漿、肝臟和肌肉組織中糖原、游離脂肪酸、總蛋白、總游離氨基酸的變化，探索鉤介幼蟲寄生對(duì)寄主魚營養(yǎng)指標(biāo)的影響，為篩選幼蟲變態(tài)發(fā)育關(guān)鍵營養(yǎng)因子提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年9月于江蘇太湖采集三角帆蚌親本500只，暫養(yǎng)于淡水漁業(yè)研究中心試驗(yàn)池塘，從3月中旬開始每10 d檢查雌蚌外鰓絲是否有成熟鉤介幼

蟲。試驗(yàn)用寄主魚為黃顙魚，取自江陰市申港三鮮養(yǎng)殖公司，選擇規(guī)格相似、體格健壯、體表無傷的魚作為試驗(yàn)材料，體質(zhì)量為(60.9±2.7)g。寄生前在循環(huán)控溫養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1 周，養(yǎng)殖用水為充分曝氣的自來水，養(yǎng)殖系統(tǒng)水溫為(24.0±0.5) ℃，每日早中晚各投喂黃顙魚配合飼料一次，每晚用虹吸法將底部污物吸出，試驗(yàn)前停喂24 h。

1.2 方法

1.2.1 寄生處理 挑選成熟的孕育蚌30只，清洗蚌殼表面的青苔和污物后，按照白志毅等[5]的方法采苗寄生。取120尾黃顙魚隨機(jī)平分為對(duì)照組和寄生組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾，對(duì)照組不感染鉤介幼蟲，寄生組感染鉤介幼蟲。分別放入循環(huán)控溫養(yǎng)殖系統(tǒng)50 L的玻璃缸中暫養(yǎng)，每天觀察黃顙魚的存活情況，發(fā)現(xiàn)死魚及時(shí)清理。試驗(yàn)開始后在寄生前期(2 d)、寄生中期(5 d)和稚貝脫落后(12 d)，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾魚，每組共9尾魚，分別從尾靜脈采血，用肝素(Heparin)抗凝，將血液在4 ℃下以2500 r/min 離心15 min，取上清液于-70 ℃下保存待測，同時(shí)取肝臟和背部肌肉，于-70 ℃下冷凍保存。以不感染鉤介幼蟲的黃顙魚組作空白對(duì)照，與寄生組平行取樣。

1.2.2 主要營養(yǎng)指標(biāo)的測定 取各時(shí)間點(diǎn)血漿、肝臟、肌肉樣品，測定糖原(glycogen，Gn)、游離脂肪酸(free fatty acid，NEFA)、總蛋白(total protein，TP)和總游離氨基酸(total amino acid，T-AA)含量，Gn(A043)、NEFA(A042)、TP(A045-1)、T-AA(A026)，均采用南京建成生物工程研究試劑盒進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Independent-samples T test法進(jìn)行兩組間比較，采用LSD法進(jìn)行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉤介幼蟲寄生對(duì)魚組織糖原的影響

從表1可見：在黃顙魚肝臟中，對(duì)照組糖原含量在寄生中期(5 d)、寄生后期(12 d)顯著低于寄生前期(2 d)(P<0.05)，寄生中期與寄生后期間無顯著性差異(P>0.05)；寄生組在寄生中期、寄生后期顯著低于寄生前期(P<0.05)，且寄生后期顯著低于寄生中期(P<0.05)；寄生組與對(duì)照組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)糖原含量均無顯著性差異(P>0.05)，推測對(duì)照組與寄生組肝臟中糖原降低的原因可能是饑餓導(dǎo)致。在肌肉中，寄生組糖原含量與對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 鉤介幼蟲寄生對(duì)黃顙魚肝臟和肌肉中糖原含量的影響

注：同列中標(biāo)有不同大寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，同行中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同

Note:The means with different capital letters within the same column are significantly different in the groups (P<0.05)，the means with different letters within the same line being significantly different in the groups(P<0.05), and the means with the same letters are not significant differences in the groups(P>0.05), et sequentia

2.2 鉤介幼蟲寄生對(duì)魚組織游離脂肪酸的影響

從表2可見：在黃顙魚血漿中，對(duì)照組和寄生組游離脂肪酸含量無顯著性差異(P>0.05)；在肝臟中，對(duì)照組游離脂肪酸含量在寄生中期、寄生后期顯著增加(P<0.05)，但這兩個(gè)時(shí)期之間無顯著性差異(P>0.05)，而寄生組游離脂肪酸含量在寄生中期顯著增加(P<0.05)，寄生后期則無明顯變化(P>0.05)，寄生后期對(duì)照組游離脂肪酸含量顯著高于寄生組(P=0.022)，推測鉤介幼蟲寄生可能導(dǎo)致肝臟中游離脂肪酸分解加快，含量降低；在肌肉中，寄生組游離脂肪酸含量與對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 鉤介幼蟲寄生對(duì)魚組織總蛋白的影響

從表3可見：在黃顙魚血漿中，寄生組與對(duì)照組總蛋白含量均無顯著性差異(P>0.05)；在肝臟中，寄生組、對(duì)照組總蛋白含量在寄生中期、寄生后期顯著下降(P<0.05)，但這兩個(gè)時(shí)期間無顯著性差異(P>0.05)，同一時(shí)間點(diǎn)下寄生組與對(duì)照組間無顯著性差異(P>0.05)；在肌肉中，寄生組總蛋白含量與對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 鉤介幼蟲寄生對(duì)魚組織游離氨基酸的影響

從表4可見：在黃顙魚血漿中，對(duì)照組、寄生組總游離氨基酸含量在寄生中期、寄生后期均顯著高于寄生前期(P<0.05)，而寄生組寄生前期與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)，寄生中期、寄生后期均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在肝臟中，對(duì)照組、寄生組在不同時(shí)間點(diǎn)游離氨基酸含量均無顯著性差異(P>0.05)，寄生組在寄生前期、中期與對(duì)照組間無顯著性差異(P>0.05)，寄生后期則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在肌肉中，寄生組游離氨基酸含量與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

表2 三角帆蚌鉤介幼蟲寄生對(duì)黃顙魚血漿、肝臟和肌肉游離脂肪酸含量的影響

表3 三角帆蚌鉤介幼蟲寄生對(duì)黃顙魚血漿、肝臟和肌肉中總蛋白含量的影響

表4 三角帆蚌鉤介幼蟲寄生脅迫對(duì)黃顙魚血漿、肝臟和肌肉中游離氨基酸含量的影響

3 討論

3.1 鉤介幼蟲寄生對(duì)寄主魚肝臟、肌肉中糖原的影響

魚類體內(nèi)的碳水化合物主要以糖原形式存在于肝臟和肌肉中，測定肝糖原與肌糖原的變化能夠反映魚體的能量代謝規(guī)律及自身能源物質(zhì)的利用情況[8]。研究表明，魚類在饑餓時(shí)其糖原分解代謝明顯提高[12]。肝臟是中間代謝的主要器官，在饑餓條件下，肝臟內(nèi)儲(chǔ)藏的脂肪和糖原被消耗，導(dǎo)致肝臟的體積和重量減小，肝指數(shù)下降[13-14]。許氏平鲉Sebastesschlegeli幼魚饑餓10～15 d后，肝糖原極顯著下降，同時(shí)肌糖原也出現(xiàn)相似的變化，下降明顯[15]。本試驗(yàn)中，寄生組與對(duì)照組在寄生中期(5 d)、寄生后期(12 d)肝糖原顯著下降，但在同一取樣時(shí)間兩組無顯著性差異，表明寄生脅迫未對(duì)寄主魚肝糖原和肌糖原含量產(chǎn)生顯著影響，而肝糖原顯著下降，可能與試驗(yàn)魚在饑餓脅迫下的能量供給有關(guān)。

3.2 寄主魚血漿、肝臟、肌肉中游離脂肪酸的變化

當(dāng)肌肉活動(dòng)所需能源肝糖消耗量較大時(shí)，組織中脂肪會(huì)分解中性脂肪成為游離脂肪酸來充當(dāng)能源使用[16]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)寄生蟲寄生寄主后，寄主血漿游離脂肪酸的變化研究較少，而對(duì)脂類代謝中甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)、膽固醇及高密度脂肪酸和低密度脂肪酸的研究較多[16-17]。以甘油三酯形式存儲(chǔ)的脂肪酸是禁食魚類能量需求的主要來源之一[18]。聞海波等[6]研究顯示，鉤介幼蟲寄生導(dǎo)致羅非魚血漿中甘油三酯顯著下降，并推測可能是分解為甘油和脂肪酸。Gatenby等[19]認(rèn)為，影響剛脫落稚貝成活率的限制因子可能是多不飽和脂肪酸。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在寄生后期，寄生組肝臟中游離脂肪酸顯著低于對(duì)照組，血漿與肌肉中無顯著變化，推測寄主魚肝臟中游離脂肪酸被分解轉(zhuǎn)運(yùn)至血液中，保持血液中較高濃度，從而滿足鉤介幼蟲寄生變態(tài)發(fā)育營養(yǎng)需求。游離脂肪酸可能是鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵因子之一。這與馬學(xué)艷[20]的研究結(jié)果一致。

3.3 寄主魚血漿、肝臟、肌肉中總蛋白、游離氨基酸的變化

蛋白質(zhì)為生物大分子，不能被寄生的鉤介幼蟲變態(tài)、發(fā)育直接利用。寄主魚體內(nèi)蛋白要先分解為短肽或氨基酸，才能繼續(xù)氧化分解、轉(zhuǎn)化或被寄生的鉤介幼蟲攝取[21]。氨基酸的最大吸收率與血液中氨基酸的濃度有關(guān)[22]。通過研究3種寄生蜂：澳洲赤眼蜂TrichogrammaconfusumViggiani、松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimiMatsumura和玉米螟赤眼蜂T.ostriniae寄生對(duì)米娥卵CorcyracephalonicaStainton氨基酸含量的影響，表明未被寄生的米娥卵內(nèi)游離氨基酸總量是逐漸降低的，而被寄生的卵則出現(xiàn)先上升后下降的變化[23]。菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis寄生小菜蛾P(guān)lutellaxylostella之后，經(jīng)離子色譜法測定菜蛾血淋巴中游離氨基酸的變化，結(jié)果表明，小菜蛾幼蟲血淋巴中游離氨基酸總量顯著增加，推測是由菜蛾盤絨繭蜂寄生誘導(dǎo)所致[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，血漿及肌肉中總蛋白含量無顯著變化，肝臟中總蛋白含量在寄生中期顯著減少，血漿中游離氨基酸含量顯著增加，但同一時(shí)間寄生組顯著低于對(duì)照組，而對(duì)照組肝臟中游離氨基酸含量在寄生后期顯著降低，這表明鉤介幼蟲在寄生期間從寄主魚血漿中攝取大量的游離氨基酸。因此，推測蛋白分解產(chǎn)物(短肽或氨基酸)是鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育必需的營養(yǎng)因子。但本試驗(yàn)中未對(duì)血漿中游離氨基酸的種類進(jìn)行定量分析，究竟哪些氨基酸是幼蟲變態(tài)發(fā)育的限制因子還有待進(jìn)一步研究。

3.4 寄主魚能量代謝規(guī)律

魚體在單位時(shí)間內(nèi)消耗氧氣的摩爾數(shù)除以排出氨氮的摩爾數(shù)值定義為O∶N，能夠反映魚體生命過程中的能量來源情況[25]。Mayzand[26]認(rèn)為，完全以蛋白質(zhì)氧化供能時(shí)O∶N值為7～10；Iieda[27]認(rèn)為，以蛋白質(zhì)和脂肪供能時(shí)O∶N值為24左右，隨著脂類和碳水化合物被利用比例的增高，其O∶N值逐漸增大[28]。根據(jù)杜興偉等[11]研究結(jié)果，未寄生組O∶N值介于49.82～72.52之間，輕度寄生組與重度寄生組在幼蟲脫落前，O∶N值均顯著下降至最低，分別為29.64、27.22，接近于蛋白質(zhì)和脂肪功能的比值24。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，寄生脅迫導(dǎo)致黃顙魚肝臟游離脂肪酸含量顯著下降，肝臟總蛋白、血漿及肝臟中游離氨基酸含量顯著降低，表明寄生脅迫會(huì)消耗魚體部分蛋白質(zhì)、脂肪，這可能是導(dǎo)致寄生組魚O∶N值比對(duì)照組低的原因，本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了呼吸代謝變化規(guī)律。