東天，朱華，王巍，董穎，田照輝，胡紅霞

(北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所 漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068)

脊椎動(dòng)物卵細(xì)胞被細(xì)胞膜外糖蛋白基質(zhì)包裹，在哺乳動(dòng)物中，稱為透明帶(zona pellucid, ZP)，在鳥(niǎo)類中稱其為卵周膜(perivitelline membrane)，在兩棲類中俗稱卵黃膜(vitelline envelope)，在魚類中則稱之為漿膜(chorion)[1]。1992年，Bork等[2]首次發(fā)現(xiàn)了ZP蛋白家族高度保守的ZP結(jié)構(gòu)域特征，隨后，研究者證實(shí)，ZP蛋白由N端信號(hào)肽序列、ZP結(jié)構(gòu)域、furin蛋白酶切割位點(diǎn)、跨膜功能域(TMD)和C端疏水基團(tuán)等構(gòu)成[3-5]。哺乳動(dòng)物ZP蛋白的功能主要是介導(dǎo)精卵識(shí)別，誘發(fā)頂體反應(yīng)，促使質(zhì)膜融合以防止多精受精，保護(hù)早期未著床胚胎正常發(fā)育等[6]。與哺乳動(dòng)物不同，硬骨魚類ZP蛋白在受精過(guò)程中主要從結(jié)構(gòu)上對(duì)卵細(xì)胞提供了機(jī)械性的保護(hù)：受精時(shí)，ZP蛋白可指引單個(gè)精子穿過(guò)位于動(dòng)物極的卵孔(micropyle)直接進(jìn)入卵膜，同時(shí)形成受精錐(fertilization cone)堵塞在卵孔處以防止多精受精[7-9]。脊椎動(dòng)物ZP蛋白由多個(gè)ZP基因編碼，由于ZP基因的命名相對(duì)混亂，研究人員根據(jù)命名系統(tǒng)及氨基酸序列同源性將其劃分為6個(gè)基因亞家族：ZPA/ZP2、ZPB/ZP4、ZPC/ZP3、ZP1、ZPAX和ZPD亞家族[10]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物基因組中一般包含3～4個(gè)ZP基因，兩棲類及鳥(niǎo)類包含5～6個(gè)ZP基因，魚類至少存在7個(gè)編碼ZP蛋白的基因[5,8,10-11]。

ZP3隸屬卵透明帶家族(zona pellucida superfamily)中的一員，是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞透明帶的主要蛋白成分之一，已被證實(shí)具有結(jié)合精子并引發(fā)頂體反應(yīng)的功能[12-13]。Kanamori[14]對(duì)發(fā)育早期的青鳉Oryziaslatipes胚胎cDNA片段進(jìn)行Southern雜交時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在C端與ZPA結(jié)構(gòu)域高度同源但其余氨基酸序列同源性較低的基因；隨后，Lindsay等[15]在發(fā)育早期的非洲爪蟾Xenopuslaevis胚胎中也檢測(cè)到了具有類似特征的基因，命名為ZPAX基因，該基因與ZPA高度同源，推測(cè)其可能

為ZPA和ZPB基因的祖先。目前，研究者已克隆獲得青鳉、鯉Cyprinuscarpio、斑馬魚Daniorerio、銀鯽Cauratusgibelio、齊口裂腹魚Schizothoraxprenanti等動(dòng)物的ZP3 cDNA序列，并證明ZP3是構(gòu)成魚類卵殼的主要蛋白之一[16-20]。目前，已獲得ZPAXcDNA序列的物種包括熱帶爪蟾Xenopustropicalis、羅非魚Oreochromismossambicus、中華鱘Acipensersinensis、原雞Gallusgallus等動(dòng)物[9,21]。有研究表明，不同物種ZP蛋白的表達(dá)組織不同，哺乳動(dòng)物ZP蛋白主要在卵巢中表達(dá)[5,22]；魚類ZP蛋白表達(dá)的部位略有不同，青鳉、虹鱒Oncorhynchusmykiss、美洲擬鰈Pseudopleuronectesamericanus等魚類ZP蛋白合成發(fā)生在肝臟中[23-25]；而鯉科魚類，如斑馬魚和鯉魚ZP蛋白在卵巢中合成[18，26]。

小體鱘Acipenserruthenus隸屬于硬骨魚綱Osteicthyes、輻鰭亞綱Actinopterygii、鱘形目Acipenseriformes，是目前世界上最古老的魚類之一，具有極高的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)價(jià)值[27]。小體鱘個(gè)體較小、生長(zhǎng)速度快、繁殖周期相對(duì)較短，是研究鱘科魚類生長(zhǎng)和繁殖等經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)控機(jī)制的主要模式物種。目前，ZP基因家族在鱘上的研究尚處于起步階段，其在鱘魚性腺發(fā)育、卵子發(fā)生及精卵結(jié)合等過(guò)程中所發(fā)揮的作用尚不明確，僅有文獻(xiàn)報(bào)道成功克隆出中華鱘AsZP3 3種亞型(AsZP3.1、AsZP3.2、AsZP3.3)、AsZPB和AsZPAX基因cDNA全長(zhǎng)序列，并發(fā)現(xiàn)AsZP3 3種亞型、AsZPB和AsZPAX基因在4齡雌魚卵巢中高表達(dá)，AsZP3 3種亞型在3齡雄魚精巢中高表達(dá)，且AsZP3基因不同亞型之間表達(dá)水平呈現(xiàn)時(shí)空差異[9,11]。本研究課題組前期在小體鱘性腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選到ArZP3及ArZPAX基因具有雌、雄特異表達(dá)特點(diǎn)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究中首次克隆得到小體鱘ArZP3 3種亞型及ArZPAX基因部分cDNA序列，并對(duì)其在各組織中的分布進(jìn)行分析，旨在為研究ZP3及ZPAX基因在小體鱘性腺發(fā)育、卵子發(fā)生等過(guò)程中的作用和機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用小體鱘取自北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所國(guó)家級(jí)鱘良種場(chǎng)。選擇2尾5齡小體鱘(雌、雄各1尾，性腺發(fā)育階段均為Ⅳ期)，取雌魚的卵巢、肝、腦、腸、腎、脾、心、肌肉、皮和鰓，以及雄魚的精巢樣品作為試驗(yàn)材料。其中，卵巢樣品用于基因克隆試驗(yàn)；卵巢、精巢、肝、腦、腸、腎、脾、心、肌肉、皮和鰓等共11種樣品用于組織表達(dá)特異性分析試驗(yàn)，所有樣品均于超低溫冰箱(-80 ℃)中儲(chǔ)藏備用。

RNeasy mini kit RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；Trizol Reagent、DNaseI、RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；pGM-19T Vector 載體連接試劑盒、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、MiniBEST膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；其他常規(guī)試劑由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 引物合成及測(cè)序 借助Primer 3.0、DNAMAN和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)的試驗(yàn)用引物如表1所示。表1中不同基因中間片段引物ArZP3-1-F/R、ArZP3-4-F/R、ArZP3-5-F/R和ArZPAX-F/R，是根據(jù)GenBank上登錄的中華鱘AsZP3 3種亞型(AC054852、AC054853、HM067972)cDNA序列、中華鱘AsZPAX(JF751060)cDNA序列，以及課題組前期性腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果比對(duì)出的小體鱘ArZP3 3種亞型、ArZPAX基因保守片段進(jìn)行設(shè)計(jì)；ArZP3-1-qF/R、ArZP3-4-qF/R和ArZPAX-qF/R為組織表達(dá)特異性分析半定量PCR目的基因引物；18S-qF/qR為組織表達(dá)特異性分析半定量PCR內(nèi)參基因引物。所有引物合成及序列測(cè)定均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)工程有限公司完成。將引物用無(wú)菌水溶解至10 pmol/μL濃度，于4 ℃下過(guò)夜保存后使用。

1.2.2 小體鱘ArZP3 3種亞型及ArZPAXcDNA保守片段的克隆

(1)總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。使用Qiagen公司RNeasy mini kit試劑盒提取小體鱘11種組織(卵巢、精巢、肝、腦、腸、腎、脾、心、肌肉、皮、鰓)總RNA，用勻漿儀對(duì)組織充分研磨勻漿，在RNase-Free DNase set柱上處理基因組，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值，保證總RNA樣本的OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.2，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA 的完整性。以提取的總RNA為模板，按照SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)試劑盒說(shuō)明書的步驟，以O(shè)ligo (dT) 20為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR 擴(kuò)增或于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)cDNA保守片段克隆。以雌性小體鱘卵巢總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，使用引物ArZP3-1-F/R、ArZP3-4-F/R、ArZP3-5-F/R和ArZPAX-F/R擴(kuò)增目的基因的保守片段。PCR反應(yīng)體系包括：10×Ex Taq buffer 4 μL，25 mmol/L MgCl23.2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.4 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1.2 μL，5 U/μL Ex Taq 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至40 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性30 s， 退火30 s，72 ℃下延伸2 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用TaKaRa膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物與pMD-19T載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑菌篩選，最后挑取單個(gè)白色菌落過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)菌液鑒定挑選陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序。

表1 試驗(yàn)所用引物序列及相應(yīng)退火溫度

(3) 序列分析、同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。對(duì)測(cè)序正、反向片段進(jìn)行拼接，將拼接結(jié)果在GenBank上進(jìn)行Blast序列比對(duì)，通過(guò)DNAMAN軟件預(yù)測(cè)其氨基酸序列，使用MegAlign軟件進(jìn)行物種間氨基酸序列比對(duì)和同源性分析，采用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法，NJ法)[28]。用于同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的其他物種氨基酸序列包括：人(Homosapiens,HsZP1, NP_997224;HsZP2.1，NP_003451;HsZP2.2,NP_001277033;HsZP3,AAA61336;HsZP4, NP_067009)、小鼠(Musmusculus,MmZP3, NP_035906)、大鼠(Rattusnorvegicus,RnZP1, NP_445961;RnZP2, NP_112412;RnZP3, NP_446214;RnZP4, NP_758833)、鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus,OaZPAX, XP_001514402)、原雞(Gallusgallus,GgZP1, NP_990014;GgZP2, NP_001034187;GgZP3, NP_989720;GgZPB, BAA76739;GgZPD, BAD13713;GgZPAX, NP_001039302)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis,XlZP3, NP_001081657)、熱帶爪蟾(Xenopustropicalis,XtZP2, NP_988855;XtZP3, NP_001107471;XtZPB, AAL86571;XtZPD, AAL86573;XtZPAX, AAL86574)、斑馬魚(Daniorerio,DrZP2, AAD49112;DrZP3, NP_571406;DrZP3a.1, AAI16532;DrZP3a.2, NP_001025291;DrZP3b, AAH67692;DrZP3c1, CAX14369;DrZP3c2,CAP09495;DrZPAX, AAI24758)、羅非魚(Oreochromisniloticus,OnZPAX, XP_003446420)、鯉(Cyprinuscarpio,CcZP2.1, CAA96572;CcZP2.2, CAA96573;CcZP3, CAA88836)、鯽(Carassiusauratus,CaZP2, CAA96576;CaZP3, CAA88838)、青鳉(Oryziaslatipes,OlZPB, AAD38905;OlZPC1, NP_001098218;OlZPC2,AAN31189;OlZPC3, NP_001098219;OlZPC4, NP_001098220;OlZPC5, AAD38910;OlZPAX, AAN31186)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss,OmZP2.3, NP_001118072)、黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas,PpZP3, AAG28398)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis,CsZP3a, ABY81290;CsZP3b, ABY81291)、中華鱘(Acipensersinensis,AsZP3.1, ACO54852;AsZP3.2, ACO54853;AsZP3.3,HM067972;AsZP3.4,AEM- 43808;AsZPB, JF751061;AsZPAX, AEQ59107)。

1.2.3ArZP3-1、ArZP3-4和ArZPAX組織表達(dá)特異性分析 以小體鱘卵巢、精巢、肝、腦、腸、腎、脾、心、肌肉、皮和鰓等11種組織總RNA(各1 μg)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，使用目的基因引物ArZP3-1-qF/qR、ArZP3-4-qF/qR、ArZPAX-qF/qR和持家基因引物18S-F/R進(jìn)行半定量PCR。反應(yīng)條件如下: 95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性30 s，退火30 s，在72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。利用持家基因18S在各組織器官中的表達(dá)量基本相同這一特性，將其作為各組織半定量PCR產(chǎn)物量的參照，并利用Gel-Pro analyzer 4軟件定量分析ArZP3-1、ArZP3-4和ArZPAX基因在不同組織中的表達(dá)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ArZP3 3種亞型及ArZPAX cDNA保守片段克隆及序列分析

使用DNAstar軟件中的SeqMan II對(duì)正、反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后得到ArZP3 3種亞型和ArZPAX基因cDNA保守片段。其中，ArZP3-1部分cDNA序列長(zhǎng)度為1029 bp，對(duì)應(yīng)編碼342個(gè)氨基酸(圖1)；ArZP3-4部分cDNA序列長(zhǎng)度為1191 bp，對(duì)應(yīng)編碼397個(gè)氨基酸(圖2)；ArZP3-5部分cDNA序列長(zhǎng)度為717 bp，對(duì)應(yīng)編碼238個(gè)氨基酸(圖3)；ArZPAX部分cDNA序列長(zhǎng)度為733 bp，對(duì)應(yīng)編碼243個(gè)氨基酸(圖4)。使用ExPASy分子生物學(xué)服務(wù)器上的Signal Pand Prosite軟件 (http://prosite. expasy.org/)對(duì)氨基酸序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5和ArZPAX氨基酸序列均存在一個(gè)保守的ZP結(jié)構(gòu)域(圖1～圖4虛線部分)。

注：虛線部分表示小體鱘ArZP3-1氨基酸序列上的保守ZP結(jié)構(gòu)域Note：The dotted line represents the conserved ZP domain on the amino acid sequence of ArZP3-1 in sterlet圖1 小體鱘ArZP3-1基因部分cDNA序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)MF785109)Fig.1 ArZP3-1 partial length cDNA sequence and deduced amino acid sequence(GenBank accession No.MF785109) of sterlet Acipenser ruthenus

注：虛線部分表示小體鱘ArZP3-4氨基酸序列上的保守ZP結(jié)構(gòu)域Note：The dotted line represents the conserved ZP domain on the amino acid sequence of ArZP3-4 in sterlet圖2 小體鱘ArZP3-4基因部分cDNA序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)MF785110)Fig.2 ArZP3-4 partial length cDNA sequence and deduced amino acid sequence (GenBank accession No. MF785110) of sterlet Acipenser ruthenus

注：虛線部分表示小體鱘ArZP3-5氨基酸序列上的保守ZP結(jié)構(gòu)域Note：The dotted line represents the conserved ZP domain on the amino acid sequence of ArZP3-5 in sterlet圖3 小體鱘ArZP3-5基因部分cDNA序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)MF785111)Fig.3 ArZP3-5 partial length cDNA sequence and deduced amino acid sequence (GenBank accession No. MF785111)of sterlet Acipenser ruthenus

注：虛線部分表示小體鱘ArZPAX氨基酸序列上的保守ZP結(jié)構(gòu)域Note：The dotted line represents the conserved ZP domain on the amino acid sequence of ArZPAX in sterlet圖4 小體鱘ArZPAX基因部分cDNA序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)KX928953)Fig.4 ArZPAX partial length cDNA sequence and deduced amino acid sequence (GenBank accession No. KX928953)of sterlet Acipenser ruthenus

2.2 同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

使用DNAMAN和MegAlign軟件，對(duì)小體鱘ArZP3不同亞型物種間氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，ArZP3 3種亞型間對(duì)應(yīng)保守區(qū)段氨基酸序列一致性為71.37%,且在5′端保守性較低，3′端保守性較高；與中華鱘AsZP3 3種亞型對(duì)應(yīng)保守性區(qū)段氨基酸序列相比，ArZP3 3種亞型與AsZP3.1一致性較高，為80%～95%，與AsZP3.2及AsZP3.3一致性較低，為20%～30%；與其他物種對(duì)應(yīng)氨基酸區(qū)段的同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ArZP3 3種亞型與哺乳類動(dòng)物、鳥(niǎo)類、兩棲類及其他魚類ZP3氨基酸序列一致性為40%～50%。對(duì)小體鱘ArZPAX物種間氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析(圖6)發(fā)現(xiàn)，ArZPAX與中華鱘AsZPAX對(duì)應(yīng)保守區(qū)段的氨基酸序列一致性最高，達(dá)到65.54%；與斑馬魚、羅非魚和青鳉等魚類ZPAX對(duì)應(yīng)保守氨基酸區(qū)段一致性較高，達(dá)到50%；與哺乳類、鳥(niǎo)類和兩棲類動(dòng)物ZPAX一致性較差，僅為30%～35%。

使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行ZP家族物種間氨基酸序列比對(duì)和同源性分析，用 Bootstrap驗(yàn)證重復(fù)1000次。從圖7可見(jiàn)，哺乳類、鳥(niǎo)類、兩棲類和魚類的ZP蛋白清晰地聚為6大支，分別為ZP2、ZP1、ZPB/ZP4、ZPAX、ZPD 和 ZPC/ZP3。其中，小體鱘ArZPAX先與中華鱘AsZPAX聚為一支，然后再與高等魚類、哺乳類、兩棲類和鳥(niǎo)類的ZPAX聚為一支。小體鱘ArZP3-1與ArZP3-4、小體鱘ArZP3-5與中華鱘AsZP3.1先分別聚為一支，然后再與鯉科魚類、哺乳類、鳥(niǎo)類、兩棲類聚為一大支。

2.3 ArZP3-1、ArZP3-4和ArZPAX半定量PCR組織表達(dá)特異性分析

對(duì)ArZP3 3種亞型中的ArZP3-1、ArZP-4和ArZPAX基因進(jìn)行11種組織(卵巢、精巢、肝、腦、腸、腎、脾、心、肌肉、皮和鰓)半定量PCR，組織表達(dá)特異性分析，電泳結(jié)果如圖8所示

圖5 小體鱘ArZP3 3種亞型與其他物種氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果Fig.5 Alignment results of amino acid sequences in three subtypes of ArZP3 between sterlet Acipenser ruthenus and other species

圖6 小體鱘ArZPAX與其他物種氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果Fig.6 Alignment results of amino acid sequences in ArZPAX between sterlet Acipenser ruthenus and other species

圖7 小體鱘與其他物種ZP家族氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類分析Fig.7 Cluster analysis of phylogenetic tree of ZP family amino acid sequence between sterlet Acipenser ruthenus and other species

(以Ar18S為空白對(duì)照)。其中，持家基因Ar18S擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在200 bp左右，在11種組織中均有表達(dá)，且條帶亮度基本一致，可作為持家基因使用；目的基因ArZP3-1、ArZP3-4和ArZPAX擴(kuò)增片段

注：M為DL2000 DNA Marker；O為卵巢；T為精巢；L為肝臟；I為腸；K為腎臟；S1為脾臟；H為心臟；WM為肌肉；S2為皮；G為鰓；B為腦；C為空白對(duì)照Note: M,DL2000 DNA Marker; O,ovary; T,testis; L,liver; I,intestine; K,kidney; S1,spleen; H,heart; WM,white muscle; S2,skin; G,gill; B,brain; C,blank control圖8 小體鱘ArZP3-1、ArZP3-4、ArZPAX組織表達(dá)特異性分析結(jié)果(Ar18S為空白對(duì)照)Fig.8 Tissue expression distribution of ArZP3-1, ArZP3-4 and ArZPAX(Ar18S as RT-PCR control)

長(zhǎng)度與預(yù)期長(zhǎng)度相同，不同目的基因在11種組織中的表達(dá)情況不同。使用Gel-Pro analyzer 4軟件對(duì)電泳條帶亮度進(jìn)行分析處理，將所得目的基因與內(nèi)參基因的亮度比值作為目的基因不同組織間相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析。從圖9可見(jiàn)：ArZP3-1在性腺中的表達(dá)量較高，且在卵巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于精巢，在雌魚肝、腦、腎、心、肌肉、鰓中也有不同程度的表達(dá)，在腸、脾和皮中幾乎不表達(dá)；ArZP3-4僅在卵巢和精巢中表達(dá)，且在卵巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于精巢，在其他組織中幾乎不表達(dá)；ArZPAX在性腺中表達(dá)量最高，且在卵巢中的表達(dá)量略高于精巢，在雌魚肝、腦、腸、腎、脾、心和鰓中也存在一定量的表達(dá)，在肌肉和皮中幾乎不表達(dá)。從目的基因間的表達(dá)情況來(lái)看，ArZPAX更具有表達(dá)的廣泛性，ArZP3-1在性腺上的表達(dá)量最高。

圖9 小體鱘ArZP3-1、ArZP3-4及ArZPAX基因的組織相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression levels of ArZP3-1, ArZP3-4 and ArZPAX in tissues detected by RT-PCR

3 討論

3.1 序列分析及基因進(jìn)化

本研究中成功克隆獲得小體鱘卵透明帶家族ArZP3基因3種亞型(ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5)的cDNA部分序列。通過(guò)物種間氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ArZP3 3種亞型中ArZP3-1和ArZP3-4間的同源性較高，ArZP3-5與其他亞型同源性相對(duì)較低。Li 等[11]在對(duì)中華鱘ZP3的研究中也發(fā)現(xiàn)其存在3個(gè)亞型，并命名為AsZP3.1、AsZP3.2、AsZP3.3，其中，AsZP3.2和AsZP3.3的同源性較高，其序列一致性為82%，而AsZP3.3與其他兩個(gè)亞型的同源性僅在20%左右。本研究中，小體鱘ArZP3 3種亞型與中華鱘AsZP3.1同源性最高，為80%～95%，與AsZP3.2及AsZP3.3的一致性較低，為20%～25%，由此推測(cè)小體鱘ArZP3基因可能存在更多的亞型，且功能不盡相同。目前，研究人員發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚、半滑舌鰨、青鳉等高等魚類中ZP3/ZPC基因也存在多個(gè)亞型，而在鳥(niǎo)類、哺乳類動(dòng)物中ZP3/ZPC基因的多個(gè)亞型現(xiàn)象還未見(jiàn)報(bào)道[25，29-30]。

本研究中成功克隆獲得小體鱘卵透明帶家族ArZPAX基因的cDNA部分序列。通過(guò)物種間氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ZPAX氨基酸序列在物種間的一致性較低，其中，小體鱘ArZPAX與中華鱘AsZPAX氨基酸序列保守性較高，約52%，與兩棲類、禽類及高等魚類ZPAX氨基酸序列保守性為20%～30%。Yue等[9]成功克隆獲得中華鱘AsZPAX的完整cDNA序列，發(fā)現(xiàn)物種間ZPAX氨基酸序列的ZP結(jié)構(gòu)域上存在10個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基(Cys residues)，其中，本研究中克隆得到的小體鱘ArZPAX基因編碼的部分氨基酸序列中找到相對(duì)應(yīng)的8個(gè)(圖6)。哺乳動(dòng)物ZP蛋白C末端存在一個(gè)富含疏水氨基酸的跨膜功能域(TMD)，它可以將ZP蛋白錨定到卵膜表面[31]。與哺乳動(dòng)物相比，硬骨魚類ZP蛋白在C端缺少跨膜功能域(TMD)結(jié)構(gòu)，ZP蛋白前體可以在沒(méi)有TMD結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)入卵殼，推測(cè)在大多數(shù)硬骨魚類卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，TMD并非為必要的結(jié)構(gòu)[32-33]。本研究中，ArZPAX氨基酸序列C端同樣缺少TMD結(jié)構(gòu)，這與已報(bào)道的中華鱘AsZPAX蛋白結(jié)構(gòu)具有相同特點(diǎn)[9]。

目前，有研究人員提出，ZP家族可能是由一個(gè)共同的ZP3/ZPC祖先基因衍變而來(lái)，ZP3/ZPC祖先基因序列的一次加倍產(chǎn)生了ZP3/ZPC基因，隨后又復(fù)制過(guò)多次并逐漸進(jìn)化成為其他ZP基因的前體，包括ZPA/ZP2、ZPB/ZP4、ZPD、ZP1和ZPAX基因[34-35]，本研究中構(gòu)建的物種間ZP家族氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，基本符合了上述假設(shè)(圖7)。ZP3在許多物種上都有多種亞型，從本研究中構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果上看，同一物種ZP3的不同亞型親緣關(guān)系不同。其中，小體鱘ArZP3 3種亞型均與中華鱘AsZP3.1聚為一支，親緣關(guān)系最近，而與中華鱘另外兩種亞型(AsZP3.2、AsZP3.3)未直接聚在一起，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，斑馬魚DrZP3的3種亞型也存在此現(xiàn)象(圖7)，推測(cè)ZP3不同亞型間可能具有功能差異。另外，小體鱘ArZPAX首先與中華鱘AsZPAX聚為一支，隨后再與高等魚類、哺乳類、兩棲類和鳥(niǎo)類的ZPAX一起聚為ZPAX亞家族，最終與ZP2亞家族、ZPB/ZP4亞家族、ZP1亞家族和ZPD亞家族聚為一大亞支(圖7)，推測(cè)這些亞家族親緣關(guān)系較近，可能擁有相同的祖先。

3.2 組織分布及表達(dá)分析

近些年，有研究人員發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨CsZP3兩種亞型在許多組織中廣泛分布，其中，CsZP3a基因mRNA在雌魚卵巢及腎臟中高表達(dá)，在肌肉和脾臟中低表達(dá)；CsZP3b基因mRNA在雌魚卵巢、腎、心、腦、肌肉、脾、鰓和腸等8種組織及雄魚精巢和腎臟中表達(dá)[30]。中華鱘AsZP3基因3種亞型也有類似的現(xiàn)象，其中AsZP3.1基因mRNA在卵巢、肝臟、腎、脾、心等5種組織中廣泛表達(dá)，而AsZP3.2及AsZP3.3基因mRNA僅在卵巢中高表達(dá)[11]。本研究中，小體鱘ArZP3-1基因mRNA在卵巢、精巢、肝、腦、腎、心、肌肉、皮、鰓等組織中廣泛表達(dá)，而ArZP3-4基因mRNA僅在卵巢和精巢組織中表達(dá)，與中華鱘AsZP3基因不同亞型的表達(dá)譜結(jié)果相似，而ArZP3兩個(gè)亞型mRNA在卵巢中的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于精巢的結(jié)果，推測(cè)ArZP3基因可能在雌魚性腺發(fā)育及卵子成熟過(guò)程中發(fā)揮一定的功能，但仍需進(jìn)一步研究。Yue等[9]通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了中華鱘AsZPAXmRNA在不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AsZPAX僅在雌性卵巢及肝臟中表達(dá)，且在卵巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于肝臟。與中華鱘不同的是，本研究中檢測(cè)到小體鱘ArZPAXmRNA具有在多組織中廣泛表達(dá)的特點(diǎn)(圖8、圖9)，在卵巢和精巢中表達(dá)量最高，在肝、腸、腎、脾、心、鰓和腦中也存在一定量的表達(dá)，推測(cè)小體鱘的ZPAX基因可能具有更多方面的作用，仍需進(jìn)一步地深入研究。