崔培，王景倩，程鎮(zhèn)燕，牟希東，喬秀亭，孫金輝

(1.農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380；2.天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

糖類是廉價且重要的能源物質(zhì)，與陸生動物相比，魚類對糖的利用能力較差[1-2]，能量需求依賴價格昂貴的蛋白質(zhì)提供，不僅導(dǎo)致飼料價格昂貴，還增加了魚體的代謝負擔，加劇氮磷排泄，污染養(yǎng)殖環(huán)境[3-4]。若能利用價格低廉的糖類作為能源物質(zhì)替代部分蛋白質(zhì)，起到“蛋白質(zhì)節(jié)約作用”，不僅可以降低飼料蛋白質(zhì)含量和成本，同時還可以保護漁業(yè)資源，減少養(yǎng)殖過程中氮排泄對水體的污染[5]。

Cr3+是人和動物體必需的一種痕量元素，與機體碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān)。研究證實，Cr3+能夠通過增強胰島素的作用進而提高機體葡萄糖耐量[6-7]。相關(guān)學者發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的Cr3+能夠提高動物機體生長性能[8-9]，降低血糖濃度，改善機體葡萄糖耐量[10-11]，促進機體對糖類的利用能力[12-13]，增強機體的免疫功能和應(yīng)激能力[14-17]。因而，Cr3+作為一種飼料添加劑已被廣泛應(yīng)用在畜禽動物和一些水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中。與無機鉻相比，有機鉻具有更高的吸收率和生物學活性[18]，因此，在畜禽以及水產(chǎn)動物飼料中多以有機鉻形式添加，添加鉻源主要包括吡啶羧酸鉻、酵母鉻、煙酸鉻等。吡啶羧酸鉻因其穩(wěn)定性強、易于吸收且效價最高等優(yōu)勢成為應(yīng)用最為廣泛的鉻源，但吡啶羧酸鉻可能引起DNA的裂解反應(yīng)，從而導(dǎo)致DNA損傷[19]；而煙酸鉻在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性差，在消化吸收過程中容易造成較大損失，煙酸的

化學結(jié)構(gòu)也決定了煙酸同鉻之間的有機螯合度差。故本試驗中選擇易于吸收且具有高生物學活性的葡萄糖酸鉻作為鉻源。

錦鯉Cyprinuscarpio因其體色艷麗、易于飼養(yǎng)而廣受消費者歡迎。目前，有關(guān)Cr3+作為錦鯉飼料添加劑的研究報道較少，本試驗前期曾研究了不同葡萄糖酸鉻含量對錦鯉生長、血液和抗氧化指標的影響[20]，但對于葡萄糖酸鉻影響其糖利用能力等方面的研究尚未見報道。為此，本試驗中在前期研究的基礎(chǔ)上探討了不同葡萄糖酸鉻含量對錦鯉部分激素水平和糖代謝酶活性的影響，旨在為進一步驗證葡萄糖酸鉻可否作為錦鯉配合飼料添加劑來使用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗中，以天津市天祥水產(chǎn)有限責任公司提供的天祥585飼料為底料(蛋白質(zhì)含量32%，脂肪含量5%)，配制7種不同葡萄糖酸鉻含量的試驗飼料，添加量分別為0(對照)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/kg(以Cr3+計)。飼料中采用原子吸收光譜法(石墨爐原子化法)測定Cr3+含量，實測值分別為0.74、0.86、0.95、1.15、1.59、2.40、4.01 mg/kg。葡萄糖酸鉻購自湖北拓楚慷元醫(yī)藥化工有限公司，有效含量為97.87%，Cr3+含量為8%。飼料底料經(jīng)多功能粉碎機粉碎后，用制粒機擠壓成直徑為1.5 mm 的顆粒料，在烘箱 (DK400, YAMATO)(40 ℃)中烘干2 h，取出后自然風干至水分約12%，于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 試驗魚購自天津精武鎮(zhèn)觀賞魚養(yǎng)殖基地，運送至天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室后進行兩周暫養(yǎng)馴化，期間投喂對照組飼料，待試驗魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后，選取大小基本一致、初始體質(zhì)量為(4.18±0.38)g的健康試驗魚525尾隨機分為7組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)25尾魚。每日于8:30和16:30表觀飽食投喂1 h后吸去水槽底部的殘餌和糞便。每天換水1次，換水量約為總水量的1/3～1/2，養(yǎng)殖容器為21個300 L藍色塑料水槽，試驗用水為曝氣24 h以上的自來水，試驗期間水溫為(28.0±1.0)℃，pH為(7.0±0.2)，氨氮≤0.05 mg/L，溶解氧≥5.0 mg/L。飼養(yǎng)周期為8周。

1.2.2 樣品采集 8周飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，試驗魚禁食24 h，用MS-222(40 mg/L)將魚麻醉后，每槽隨機選取20尾試驗魚并從尾部采血，于4 ℃下以4000 r/min離心5 min，取上清液。取血后的試驗魚迅速于冰盤上解剖取其肝胰臟，取出后用4 ℃去離子水沖凈，并按質(zhì)量與體積比為1∶9加入預(yù)冷的雙蒸水，使用玻璃勻漿器制成體積分數(shù)為10%的組織勻漿液，取上清液于4 ℃下以3000 r/min離心10 min。所有樣品處理后均轉(zhuǎn)入超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 試驗指標的測定 采用ELISA試劑盒測定血清胰島素(Insulin, INS)、胰高血糖素(Glycogen, GC)、胰島素受體(Insulin Receptor, ISR)、皮質(zhì)醇(Cortisol)。INS、GC試劑盒均購自Assay Designs(美國)，COR、ISR試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)、琥珀酸脫氫酶(Succinic acid dehydrogenase, SDH)、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase, MDH)活性，采用美國Assay Designs 公司的ELISA試劑盒測定葡萄糖激酶(Glucokinase, GK)、磷酸烯醇式丙酮酸激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose 6-phosphatase dehydrogenase, G6PDH)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6P)活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan氏法進行多重比較分析，顯著性水平設(shè)為0.05，試驗結(jié)果均用平均值±標準差(mean ± S.D.) 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Cr3+添加量下錦鯉血清激素水平的變化

從表1可見：在飼料中添加Cr3+后能顯著降低錦鯉血清皮質(zhì)醇含量(P<0.05)；胰島素水平隨Cr3+添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，最高值出現(xiàn)在Cr3+添加量為0.8 mg/kg組，且顯著高于對照組(P<0.05)，其他各組間均無顯著性差異(P>0.05)；胰島素受體水平在Cr3+添加量≥0.4 mg/kg時顯著高于對照組及0.1 mg/kg組(P<0.05)；而不同Cr3+添加量未對胰高血糖素造成顯著影響(P>0.05)。

表1 不同葡萄糖酸鉻添加量對錦鯉血清4種激素水平的影響

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 不同Cr3+添加量下錦鯉肝胰臟代謝酶活力的變化

從表2可見：GK活性在Cr3+添加量為0.2～3.2 mg/kg時均顯著高于對照組(P<0.05)，最高值出現(xiàn)在0.8 mg/kg組，顯著高于其他各組(P<0.05)；PK活性除Cr3+添加量為3.2 mg/kg組外，其他Cr3+添加組均顯著高于對照組(P<0.05)；添加葡萄糖酸鉻后，各組試驗魚G6P活性均低于對照組，Cr3+添加量≥0.2 mg/kg時，各添加組G6P活性均顯著低于對照組(P<0.05)；PEPCK活性則在Cr3+添加量為0.1～1.6 mg/kg時顯著低于對照組(P<0.05)；G6PDH活性隨葡萄糖酸鉻添加量的增加呈先升高后降低的趨勢及Cr3+添加量為0.4～0.8 mg/kg時，G6PDH活性顯著高于對照組及Cr3+添加量為0.1、1.6、3.2 mg/kg組(P<0.05)；SDH活性在Cr3+添加量≥0.8 mg/kg時，均顯著高于對照組(P<0.05)；除Cr3+添加量為3.2 mg/kg組MDH活性顯著高于對照組(P<0.05)外，其余Cr3+添加組MDH活性均與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

表2 不同葡萄糖酸鉻添加量對錦鯉肝胰臟中糖代謝酶活力的影響

3 討論

3.1 葡萄糖酸鉻對錦鯉血清激素水平的影響

Cr3+通過增強胰島素的作用進而發(fā)揮其生物學功能。有關(guān)補鉻對動物體胰島素影響的研究結(jié)果不盡一致。Sahin等[19]發(fā)現(xiàn)，補鉻未對懷孕、新生及斷奶兔子血清中胰島素水平產(chǎn)生影響。對大鼠[21]的研究顯示，補鉻能有效降低血清中胰島素水平。推測其原因可能是鉻以活性形式增強機體胰島素的內(nèi)化率，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取，使得血液循環(huán)中胰島素和血糖含量降低[22]。而Kim等[23]對肉仔雞的研究發(fā)現(xiàn)了與上述研究相反的結(jié)果，補充鉻能顯著提高血清胰島素水平。目前，有關(guān)Cr3+影響魚類胰島素水平的報道較少，Liu等[24]在草魚Ctenopharyngodonidellus飼料中添加不同水平的吡啶羧酸鉻(CrPic)，結(jié)果顯示，適量吡啶羧酸鉻能顯著提高草魚血清胰島素水平。本試驗結(jié)果與Liu等[24]研究結(jié)果相類似，在飼料中添加葡萄糖酸鉻后，試驗魚血清胰島素水平均有所升高，其中，Cr3+添加量為0.8 mg/kg組的試驗魚血清胰島素水平最高且顯著高于對照組，證實了鉻作為胰島素輔因子來協(xié)同胰島素功能的生理學作用。有研究報道，Cr3+是通過增加胰島素受體數(shù)量或促進胰島素和細胞膜上的受體IR結(jié)合，從而提高細胞對葡萄糖敏感性[7]，本試驗中胰島素受體水平在Cr3+添加量為0.4～3.2 mg/kg后顯著升高，也證實了上述觀點。本試驗中，在飼料中添加了葡萄糖酸鉻后錦鯉血清皮質(zhì)醇含量均顯著降低，說明葡萄糖酸鉻對提高錦鯉抗應(yīng)激作用具有明顯效果，這也與Ahmed等[9]對鯉CyprinuscarpioL.和Castro等[15]對羅非魚Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus的研究結(jié)果相一致。此外，本試驗中錦鯉胰島素水平與皮質(zhì)醇含量呈反向相關(guān)這一結(jié)果反映出典型的胰島素(合成代謝)與皮質(zhì)醇(分解代謝)間的代謝關(guān)系，而葡萄糖酸鉻的添加未改變這種相關(guān)性。

3.2 葡萄糖酸鉻對錦鯉肝胰臟糖代謝酶活性的影響

糖酵解是葡萄糖分解產(chǎn)生能量的一個重要過程，而葡萄糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解途徑中重要的限速酶。GK也被稱為Ⅳ型己糖激酶，是糖酵解過程中的第一個限速酶，催化葡萄糖磷酸化生成G6P。當機體GK缺乏或活性較低時，會導(dǎo)致魚體對飼料中糖的利用能力降低。PK催化的反應(yīng)是葡萄糖生成丙酮酸的最后一步反應(yīng)，即催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸。研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒Oncorhynchusmykiss、金頭鯛Sparusaurata、鯉[25]、青魚MylopharyngodonpiecesRichardson和南方鲇Silurusmeridionalis[26]等的GK、PK活性受到飼料糖水平的調(diào)控，高糖飼料能夠誘導(dǎo)GK、PK活性增強。而本試驗中在飼料中添加葡萄糖酸鉻后均能誘導(dǎo)錦鯉肝胰臟GK和PK活性增強，說明葡萄糖酸鉻具有促進錦鯉糖酵解過程的作用。

磷酸烯醇式丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸酶是糖異生途徑的關(guān)鍵限速酶。其中，PEPCK催化糖異生作用的第一步，將草酰乙酸鹽轉(zhuǎn)變成磷酸烯醇式丙酮酸鹽，對能量代謝具有重要的意義[4]。G6P則催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，這一反應(yīng)是糖異生作用對糖酵解的不可逆作用的一種迂回方式。Kramer等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鉻通過在動物體內(nèi)形成核酸衍生物進而直接抑制PEPCK活性。此外，Gardner等[28]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素自身通過抑制其PEPCK的表達從而抑制PEPCK活性，因此，鉻的補充能夠通過加強胰島素作用進一步間接抑制PEPCK活性。本試驗中，在Cr3+添加量≥0.2 mg/kg時，錦鯉G6P和PEPCK活性均有顯著降低，與上述研究相類似。此外，喬偉[29]對大鼠的研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。

磷酸戊糖途徑是機體糖分解代謝的另一條重要途徑，此過程能夠提供大量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，參與機體許多代謝反應(yīng)。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，它促使磷酸戊糖核酸、NADPH的合成反應(yīng)并維持細胞的氧化還原狀態(tài)。本試驗中，在飼料中Cr3+添加量為0.4～0.8 mg/kg時能顯著提高G6PDH活性。而Pan等[30]對羅非魚的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加吡啶羧酸鉻2 mg/kg時未對其G6PDH活性產(chǎn)生顯著影響，其原因可能與試驗對象、所用鉻源、鉻離子添加水平、飼料糖源及養(yǎng)殖條件不同有關(guān)。

三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑。蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的重要脫氫酶。有研究表明，補充吡啶羧酸鉻能有效提高肉雞和豬的MDH 活性，從而對糖代謝進行調(diào)控[31]。而對于魚類而言，Pan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加吡啶羧酸鉻未對羅非魚MDH活性產(chǎn)生顯著影響。本試驗與上述結(jié)果相類似，在飼料中添加葡萄糖酸鉻未對錦鯉肝胰臟中MDH活性產(chǎn)生顯著影響。鉻是琥珀酸-細胞色素脫氫酶、葡萄糖磷酸變位酶等酶系的必需微量元素，它參與機體糖、脂代謝過程。喬偉[29]對大鼠的研究表明，在日糧中添加小肽鉻能顯著提高三羧酸循環(huán)途徑中SDH 活性，促進機體葡萄糖分解供能。本試驗結(jié)果顯示，Cr3+添加量≥0.8 mg/kg時，錦鯉肝胰臟SDH活性顯著升高，此結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)語

葡萄糖酸鉻能夠提高錦鯉胰島素和胰島素受體水平，降低皮質(zhì)醇含量，同時，還能誘導(dǎo)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)途徑酶活性，抑制糖異生途徑酶活性，從而提高自身糖利用能力，建議錦鯉飼料中葡萄糖鉻添加量為0.8 mg/kg(以Cr3+計)。