鄭 恬，徐修禮，白 露，周 柯，陳 瀟，郝曉柯

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710032）

隨著科技的發(fā)展，臨床基礎(chǔ)檢驗、免疫學(xué)、生物化學(xué)等檢測方法均已實現(xiàn)全自動化樣本前處理，而微生物檢驗卻一直延續(xù)傳統(tǒng)的手工劃線接種方式[1]。微生物全自動前處理系統(tǒng)在微生物檢驗的自動化中發(fā)揮了重要作用，既減少了差錯率，增加了生物安全，為樣本的接種提供了標(biāo)準(zhǔn)化的操作平臺，又減輕了檢驗人員工作強度，使其從重復(fù)、繁瑣的操作中解放出來，致力于檢驗后程序的質(zhì)量控制，保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確和可靠[2-3]。目前，市場上的全自動微生物流水線幾乎均為國外公司生產(chǎn)，如意大利Copan公司的Copan Wasp全自動微生物前處理系統(tǒng)（簡稱Copan Wasp）、法國生物梅里埃公司的PREVI Isola系統(tǒng)及美國BD公司的Innova系統(tǒng)等[4-5]。第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗科于2014年在國內(nèi)率先引進了Copan Wasp，通過自定義系統(tǒng)參數(shù)優(yōu)化設(shè)置樣本處理方案，并接入實驗室信息系統(tǒng)，利用條形碼技術(shù)對樣本進行自動化接種劃線。目前，國產(chǎn)全自動微生物分離培養(yǎng)系統(tǒng)已研發(fā)成功，本研究就該儀器臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)效果與Copan Wasp及手工法進行比對，評估其在臨床中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 收集第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院各病區(qū)的痰樣本和中段尿樣本各50例。

1.1.2 儀器 國產(chǎn)Diascie ProBact全自動微生物分離培養(yǎng)系統(tǒng)（簡稱Diascie ProBact）由武漢迪艾斯科技公司生產(chǎn)，Copan Wasp由意大利Copan公司生產(chǎn)，VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑 痰液消化劑Sputasol由英國Oxoid公司生產(chǎn)，無菌痰管Copan12及挑痰棒由意大利Copan公司生產(chǎn)，VITEK MS基質(zhì)液及靶板由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)，血平板、含萬古霉素巧克力平板和麥康凱平板由鄭州安圖公司生產(chǎn)，專用分離培養(yǎng)裝置由武漢迪艾斯科技公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本的前處理及接種 （1）Diascie ProBact。該系統(tǒng)由自動化樣本預(yù)處理振蕩儀、專用分離培養(yǎng)裝置、自動化細菌分離培養(yǎng)儀組成。首先使用專用樣本采集杯采集樣本，放入樣本預(yù)處理樣本盤內(nèi)，對痰液樣本進行振蕩消化預(yù)處理20 min，中段尿樣本不需特殊處理。然后將預(yù)處理后的樣本懸液轉(zhuǎn)移至專用分離培養(yǎng)裝置（裝置由培養(yǎng)基、培養(yǎng)基架、樣本池和1 μL接種環(huán)組成）內(nèi)，根據(jù)不同樣本類型設(shè)置方案，選擇不同的培養(yǎng)基組合和劃線方式上機進行接種劃線及培養(yǎng)。本研究痰樣本接種選擇血平板、萬古霉素巧克力平板和麥康凱平板的培養(yǎng)基組合，中段尿樣本接種選擇血平板和麥康凱平板的培養(yǎng)基組合。（2）Copan Wasp。在Copan12無菌痰管中各加入1 mL提前配制好的10%溶痰劑，使用挑痰棒挑取痰樣本中可疑部分，放入已加溶痰劑的痰管中，常溫下放置10 min，隨后上機自動依據(jù)設(shè)置的方案進行接種劃線；中段尿樣本則需要倒入特定的尿杯中貼好條碼，再上機進行接種劃線。（3）手工法。該操作由同一位操作熟練的檢驗人員完成。痰樣本用痰消化液常溫下消化10 min，混勻后用無菌棉簽沾取，涂布于血平板第1區(qū)，再用1 μL接種環(huán)進行四區(qū)接種劃線，并以同樣方式接種于含萬古霉素的巧克力平板和麥康凱平板上。使用一次性1 μL接種環(huán)沾取尿液樣本，在血平板上以連續(xù)劃線方式進行接種劃線，以同樣的方式接種于麥康凱平板。嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4版）[6]進行操作。

1.2.2 細菌培養(yǎng) （1）Diascie ProBact。該系統(tǒng)為接種與孵育一體化裝置，痰樣本孵育環(huán)境為35 ℃ 5% CO2孵育箱，中段尿樣本孵育環(huán)境為35 ℃普通孵育箱。（2）Copan Wasp。該系統(tǒng)連接有Copan WaspLab模塊的孵育和鏡像系統(tǒng)，承接通過軌道直接送入的接種好的平板。設(shè)置痰樣本孵育環(huán)境為35 ℃ 5% CO2孵育箱，中段尿樣本孵育環(huán)境為35 ℃普通孵育箱。（3）手工法。痰樣本消化接種后置35 ℃ 5%CO2孵育箱內(nèi)進行孵育培養(yǎng)，而中段尿樣本置35 ℃普通孵育箱內(nèi)孵育培養(yǎng)。

1.2.3 菌落鑒定 采用VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對形成的菌落進行鑒定。

1.2.4 判讀標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng)24 h后，中段尿樣本和痰樣本分別按定量方式與半定量方式進行判讀。痰樣本判斷標(biāo)準(zhǔn)為：一區(qū)＜10個菌落記為≤10×103cfu/mL；一區(qū)＞10個菌落且二區(qū)＜5個菌落記為100×103cfu/mL；一區(qū)＞10個菌落且二區(qū)＞5個菌落、三區(qū)＜5個菌落記為1 000×103cfu/mL；一區(qū)＞10個菌落且二區(qū)＞5個菌落、三區(qū)＞5個菌落記為≥10 000×103cfu/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。收集50例痰樣本和50例中段尿樣本的分離菌種、細菌生長量及有效單個菌落的數(shù)據(jù)，并保存平板上菌落分離效果圖像。有效單個菌落以±s表示。采用多樣本χ2檢驗對3種接種劃線方法的不同菌落種屬數(shù)量、不同細菌生長量進行比較，采用單因素方差分析對3種不同方法的有效單個菌落數(shù)量進行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離菌種數(shù)量

2.1.1 痰樣本 Diascie ProBact接種后分離出0（無細菌生長）、1、2及≥3種菌的樣本分別為1、16、8和25例，Copan Wasp為1、14、10和25例，手工法為2、14、9和25例，3種方法之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.987）。三者檢出有意義致病菌分別為21、20和19例。

2.1.2 中段尿樣本 Diascie ProBact接種后分離出0（無細菌生長）、1、2及≥3種菌的樣本分別為20、16、8和6例，Copan Wasp分別為18、17、9和6例，手工法分別為19、18、7和6例，3種方法之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.998）。

2.2 細菌生長量

50例痰樣本及50例中段尿樣本3種接種方法的細菌生長量結(jié)果見表1和表2。在痰樣本和中段尿樣本中，3種方法之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 有效單個菌落

50例痰樣本及50例中段尿樣本不同方法間有效單個菌落統(tǒng)計結(jié)果見表3。3種方法間痰樣本和中段尿樣本的有效單個菌落數(shù)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），三者中以Copan Wasp為最多。平板分離效果見圖1和圖2。Diascie ProBact與Copan Wasp菌落分區(qū)生長明顯，單個菌落邊界清晰，而手工法菌落生長略顯密集，可能是手工用力不均所致。

3 討論

目前，在檢驗其他專業(yè)都普及全自動流水線的情況下，大部分實驗室的微生物檢驗仍采用傳統(tǒng)的手工方法對臨床微生物樣本進行接種劃線、培養(yǎng)、分離。然而手工方法因不同工作人員的手法、接種習(xí)慣和熟練程度不同，會對樣本的分離效果產(chǎn)生直接而明顯的影響，而且在樣本接種時常發(fā)生“張冠李戴”的情況，同時在生物安全方面也存在著一定的隱患。全自動微生物分離培養(yǎng)流水線系統(tǒng)的研制成功及其在臨床中的應(yīng)用極大地改善了上述問題，可對樣本的劃線接種進行統(tǒng)一、規(guī)范的操作[7]，而且，由于全自動微生物流水線連接自動數(shù)字讀板系統(tǒng)，附帶條碼識別功能，增強了樣本的溯源性，避免了人為差錯和手工的繁瑣勞動，提高了樣本的接種效率和菌落分離效果，可減少再次分離次數(shù)，為臨床報告節(jié)省了時間，同時可實現(xiàn)微生物培養(yǎng)的實時監(jiān)控，第一時間為臨床提供早期實驗室微生物檢測信息[8-9]。

表1 50例痰樣本不同方法的細菌生長量 （例）

表2 50例中段尿樣本不同方法的細菌生長量 （例）

表3 痰樣本和中段尿樣本不同方法有效單個菌落數(shù)量（±s）

表3 痰樣本和中段尿樣本不同方法有效單個菌落數(shù)量（±s）

樣本類型 Diascie ProBactCopan Wasp 手工法痰樣本 9.78±5.37 10.48±5.59 8.82±5.31中段尿樣本 8.78±4.38 9.74±4.49 7.33±5.03

圖1 痰樣本3種方法的分離效果

圖2 中段尿樣本3種方法的分離效果

本研究結(jié)果顯示，在痰樣本中，手工法無細菌生長2例，多于Diascie ProBact和Copan Wasp；檢出細菌19例，低于Copan Wasp的20例和Diascie ProBact的21例，這可能是由于痰樣本在前處理過程中Diascie ProBact及Copan Wasp均進行10～20 min的震蕩消化，使其充分液化，均質(zhì)性高，使得細菌得以完全釋放，提高了培養(yǎng)陽性率，而手工接種法則是在常溫下無震蕩液化10 min，消化效果不及前二者，但總體比較，3種方法之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明3種方法在痰樣本分離菌落種屬上性能基本一致，與文獻報道[10]有所不同。而在中段尿樣本中，Diascie ProBact無細菌生長20例，分別多于Copan Wasp的18例和手工法的19例，Diascie ProBact假性結(jié)果略高于后二者，其原因需進一步探討。

在細菌生長量方面，Diascie ProBact在痰樣本中分離出高濃度菌（≥10 000×103cfu/mL）33例，高于Copan Wasp的31例和手工法的27例。除了上述的可能原因之外，Diascie ProBact有接種與孵育一體化的裝置，在接種劃線完畢后無需轉(zhuǎn)移平板，直接于孵育箱中按設(shè)置的條件進行孵育。Copan Wasp雖然自動化程度高，接種劃線在儀器內(nèi)完成，但平板仍需通過軌道運輸進入孵育箱，而手工法劃線后則需要人工將平板放入孵育箱，可能會對細菌培養(yǎng)產(chǎn)生一定的影響，尤其不利于苛氧菌的培養(yǎng)。然而，3種方法在痰樣本和中段尿樣本中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究有效單個菌落生長情況及數(shù)量結(jié)果表明，手工法菌落生長相對集中且密集，分離度稍差。無論在痰樣本還是中段尿樣本中，Copan Wasp的有效單個菌落平均數(shù)量都最高，其次為Diascie ProBact，均優(yōu)于手工法。提高有效單個菌落的分離數(shù)量，可以減少再次分離次數(shù)，以便盡早進入菌落鑒定及體外藥物敏感性試驗步驟，從而縮短報告時間[11-12]，盡快為臨床提供準(zhǔn)確的診斷數(shù)據(jù)。

盡管Diascie ProBact較手工法具有一定的優(yōu)勢，但仍然存在一些問題有待解決與完善：（1）痰樣本采用四區(qū)的連續(xù)劃線方式，從而導(dǎo)致從原區(qū)到第4區(qū)菌落數(shù)不是呈遞減分布，這也是其單個菌落分離數(shù)量雖優(yōu)于手工法，但不及Copan Wasp的原因所在；（2）接種環(huán)外周與平板的接觸面積過大，導(dǎo)致接種樣本懸液量較多，對細菌生長量有一定影響，故其計數(shù)均大于Copan Wasp和手工法；（3）培養(yǎng)基的垂直放置培養(yǎng)，可導(dǎo)致樣本懸液沿平板流散，同樣可導(dǎo)致菌量增多；（4）缺少條形碼掃描系統(tǒng)，降低了樣本的溯源性，易引起人工差錯，增加出錯率。

綜上所述，國產(chǎn)Diascie ProBact體積小，占用空間小，費用經(jīng)濟，主要性能指標(biāo)優(yōu)于手工法，預(yù)處理裝置可充分將痰液液化，勻質(zhì)性好，提高了檢測陽性率和效率，縮短報告時間，實現(xiàn)微生物接種劃線的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，可替代手工法廣泛應(yīng)用于臨床微生物實驗室。