崔博，卓炳照，逯曉云，王文，肖冬光，江會鋒

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酶法催化甲醛合成木酮糖

崔博1,2，卓炳照3，逯曉云2，王文3，肖冬光1，江會鋒2

1 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457 2 中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308 3 西北工業(yè)大學，陜西 西安 710072

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學報, 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

木酮糖是生物體內(nèi)的代謝中間產(chǎn)物，是多種稀有糖合成的前體物質(zhì)，因其獨特的生物活性在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本研究旨在從最基本有機原料之一的甲醛出發(fā)，利用生物酶法催化甲醛合成木酮糖。通過來源于惡臭假單胞菌的苯甲酸脫羧酶 (Benzoylformate decarboxylase) 突變體BFD-M3催化甲醛聚合生成羥基乙醛和1,3-二羥基丙酮 (DHA)。通過來源于大腸桿菌的轉(zhuǎn)醛醇酶 (Transaldolase)突變體TalB-F178Y進一步催化羥基乙醛和DHA聚合生成木酮糖，最終實現(xiàn)甲醛到木酮糖的酶法轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率為0.4%。此外，經(jīng)過優(yōu)化甲醛底物濃度，木酮糖轉(zhuǎn)化率達到4.6%，比優(yōu)化前提高了11.5倍。為了進一步提高木酮糖的轉(zhuǎn)化率，采用Scaffold多酶組裝技術(shù)固定BFD-M3、TalB-F178Y蛋白，使木酮糖轉(zhuǎn)化率達到14.02%，較未用Scaffold技術(shù)前提高3倍，為生物法合成稀有糖提供了一種新方案。

木酮糖，甲醛，酶法催化，Scaffold多酶組裝技術(shù)

木酮糖 (Xylulose) 是一種戊酮糖，在自然界中存在但含量極少，屬于稀有糖。木酮糖存在L、D兩種構(gòu)型且在生物體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)換[1-3]，涉及到多種生物學、生理學功能。例如，木酮糖是合成多種稀有糖的前體物質(zhì)[4-6]，是實現(xiàn)稀有糖轉(zhuǎn)化的重要橋梁；在醫(yī)學上，木酮糖能抑制腸道蔗糖酶和麥芽糖酶活性從而抑制餐后血糖升高，成為降血糖食品的理想活性成分[7]；木酮糖還可以與ATP反應(yīng)生成D-木酮糖-5-磷酸進入磷酸戊糖途徑，參與細胞中心代謝途徑[8-9]。

目前木酮糖的合成主要通過化學法和生物法轉(zhuǎn)化糖醇來實現(xiàn)。其中化學法合成木酮糖是利用山梨糖醇作為原料，通過多步催化氧化完成。由于化學法生產(chǎn)工藝復雜且副產(chǎn)物多，木酮糖得率低，因而不利于規(guī)?；a(chǎn)[10]。生物法主要通過木酮糖還原酶 (EC 1.1.1.10或EC 1.1.1.9) 轉(zhuǎn)化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖或D-木酮糖[11-13]，其具有反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)步驟簡單、產(chǎn)品純度高等特點，但生產(chǎn)成本較大。因此，以廉價的原料通過生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)木酮糖已成為生物工程重要研究方向之一。

一碳 (C1) 化合物包括無機CO2和CO，有機甲醇、甲醛等，具有來源廣泛、價格低廉等特點[14]，在工業(yè)生物技術(shù)中具有廣泛的應(yīng)用前景[15-17]。其中甲醛是其他一碳化合物轉(zhuǎn)化為生物利用的中間物質(zhì)[18]。華盛頓大學David Baker教授構(gòu)建了一條以CO2為原料途經(jīng)甲醛合成羥基乙醛以及1,3-二羥基丙酮 (DHA) 的代謝通路，為以甲醛為原料合成大宗化學品提出了一個良好的開端[19]。同時，筆者實驗室也在從事以甲醛為原料形成羥基乙醛的相關(guān)課題。自然界中不存在催化甲醛合成羥基乙醛或DHA的酶，實驗室通過對來源于惡臭假單胞菌的苯甲酸脫羧酶 (Benzoylformate decarboxylase，BFD) 進行定點飽和突變，最終篩選獲得了一個可以高效聚合甲醛分子產(chǎn)生羥基乙醛和DHA化合物的突變體BFD-W86R-N87T-L109G-L110E-A460M (BFD- M3)[20]。此外，相關(guān)研究顯示來源于大腸桿菌的轉(zhuǎn)酮酶 (Transaldolase，TalB) 突變體TalB-F178Y能夠催化非磷酸化底物DHA作為反應(yīng)供體進行醛縮反應(yīng)，如催化DHA與甘油醛、羥基乙醛等縮合合成果糖和木酮糖等[21]。

本研究從甲醛出發(fā)，設(shè)計了一條酶法催化甲醛合成木酮糖的生物途徑，利用BFD-M3和TalB-F178Y一鍋酶法直接催化甲醛合成木酮糖，并對復合酶反應(yīng)體系進行優(yōu)化。以甲醛為原料合成木酮糖，為稀有糖生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展提供了新思路，同時為一碳資源的利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株及質(zhì)粒見表1。

1.1.2 實驗試劑

酵母粉和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司；NaCl、硫酸卡那霉素 (Kanamycin，Kan+)、氨芐青霉素 (Ampicillin，Ampr)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、羥基乙醛、DHA購自北京索萊寶科技有限公司；纖維素 (RAC)、D-木酮糖購自上海源葉生物科技有限公司。

表1 本文所用的菌株及質(zhì)粒

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，用于質(zhì)粒的構(gòu)建、擴增、種子液的培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基 (2YT)：胰蛋白胨16 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，用于蛋白質(zhì)的過表達。

蛋白緩沖液A：50 mmol/L K3PO4，5 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L TPP，pH 7.4。

蛋白緩沖液B：50 mmol/L K3PO4，5 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L TPP，1 mol/L咪唑，pH 7.4。

1.2 方法

1.2.1 酶表達純化

pET28a--M3和pET28a--F178Y質(zhì)粒為本實驗室保存。分別將庫存質(zhì)粒pET28a--M3和pET28a--F178Y轉(zhuǎn)入BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，挑取單克隆接種于含 5 mL LB液體培養(yǎng)基的小試管中，37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，作為種子液。將種子液按 1% (/) 接種量轉(zhuǎn)入 800 mL 2YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至600為0.6–0.8。加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，16 ℃誘導表達16–18 h。5 000 r/min離心10 min后棄上清，30 mL蛋白緩沖液A重懸菌體。

重懸細胞液利用高壓低溫勻質(zhì)破碎儀破碎，(1 200 bar，3次)。15 000 r/min、4 ℃離心50 min去除細胞碎片。取上清液采用鎳親和層析方法純化目的蛋白，不同咪唑濃度洗脫的樣品用10% SDS-PAGE檢測。將收集到的電泳均一性較好的目的蛋白用15 mL Amicon超濾管 (10 kDa，Millipore公司) 離心濃縮 (4 ℃、3 600 r/min)，30 mL蛋白緩沖液A換液確保除去蛋白中的咪唑，得到純化蛋白。采用Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 測定蛋白濃度，純化蛋白于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在上述培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中，視菌株所帶質(zhì)粒情況添加相應(yīng)的抗生素。硫酸卡那霉素和氨芐青霉素的工作濃度為 100 μg/mL。

1.2.2 酶催化反應(yīng)

一鍋酶法催化甲醛合成木酮糖。樣品 (200 μL)：1 mg/mL BFD-M3，1 mg/mL TalB-F178Y，5 g/L甲醛，50 mmol/L K3PO4，5 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L TPP，pH 7.4；對照 (200 μL)：5 g/L甲醛，50 mmol/LK3PO4，5 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L TPP，pH 7.4。上述反應(yīng)于振蕩反應(yīng)器中 300 r/min、37 ℃反應(yīng) 24 h。

1.2.3 多酶組裝技術(shù)

該技術(shù)[22]的原理是通過人工合成的支架固定催化反應(yīng)中的酶，縮短酶與酶的空間距離，在底物通道效應(yīng)的基礎(chǔ)上提高了底物與酶的反應(yīng)效率。Scaffold蛋白支架上帶有若干個相鄰的受體結(jié)合位點，可以與帶標簽的不同蛋白結(jié)合。同時，蛋白支架上還有一個CBM蛋白，可以與RAC結(jié)合。與RAC結(jié)合后的蛋白經(jīng)過高速離心，即可快速得到酶復合體，Scaffold多酶組裝原理如圖1所示。

1.2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建

以構(gòu)建pET28a--M3-ctdoc重組質(zhì)粒為例。設(shè)計對應(yīng)引物，分別以pET28a--M3、pET20b--ctdoc為模板，PCR擴增獲得線性pET28a--M3和ctdoc片段，將PCR產(chǎn)物消化、純化后采用Gibson連接方法[23]連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，在含有Kan+的LB平板上過夜培養(yǎng)。挑選單克隆，進行菌落PCR驗證，驗證正確的克隆提取質(zhì)粒測序，將測序正確的質(zhì)粒置于–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 復合酶組裝

在BL21 (DE3) 中分別過表達BFD-M3- CtDoc、TalB-F178Y-CcsDoc、CBM-Scaffold蛋白 (方法1.2.1)，各取100 mL培養(yǎng)液，5 000 r/min離心10 min收集細胞。分別用10 mL蛋白緩沖液A重懸細胞，細胞懸液等體積混合，利用高壓低溫勻質(zhì)破碎儀破碎。細胞破碎液15 000 r/min離心30 min，收集上清液，即獲得粗酶液。30 mL粗酶液和50 mg RAC纖維素凝膠混合，室溫靜置5 min，使其充分結(jié)合后離心棄上清，蛋白緩沖液A洗2次后重懸于10 mL蛋白緩沖液A。利用Pierce BCA Protein Assay Kit測定復合酶濃度。

圖1 Scaffold多酶組裝原理圖[22]

1.2.6 酶組裝催化反應(yīng)

酶復合體催化甲醛合成木酮糖。樣品 (500 μL)：復合酶濃度為2 mg/mL，6–16 g/L梯度甲醛濃度，50 mmol/L K3PO4，5 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L TPP，pH 7.4。反應(yīng)在振蕩反應(yīng)器進行，300 r/min， 37 ℃反應(yīng)24 h。

1.2.7 目標產(chǎn)物木酮糖檢測

木酮糖檢測采用高效液相色譜法 (HPLC)。取200 μL反應(yīng)液12 000 r/min離心2 min，所得上清液用0.22 μm濾器過濾后，進行HPLC檢測。

HPLC檢測條件：檢測器為Agilent Technologies 1260 RID (Refractive index detector)，色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H Column (300 mm× 7.8 mm)，進樣量20 μL，流動相為5 mmol/L H2SO4，柱溫35 ℃，流速 0.6 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛合成木酮糖催化途徑的設(shè)計

糖類是含醛基或酮基的多羥基化合物及其衍生物的總稱。從簡單醛酮類化合物出發(fā)合成重要糖類及其衍生物，一直以來受到人們的高度關(guān)注。如以羥基乙醛和甲醛為原料合成葡萄糖、木糖和艾杜糖[24]；以甲酸為原料途經(jīng)甲醛合成糖異生的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮[19]；以DHA和甘油醛或羥基乙醛為原料合成果糖、木酮糖[25]等。本研究基于已有研究基礎(chǔ)，設(shè)計了一條以最簡單醛類化合物甲醛為原料合成木酮糖的生物途徑。首先BFD-M3聚合2分子甲醛形成1分子羥基乙醛，羥基乙醛繼續(xù)結(jié)合1分子甲醛形成DHA，TalB-F178Y進一步催化羥基乙醛和DHA合成木酮糖 (圖2)。為了評價途徑的可行性，利用熱力學分析工具eQuilibrator (http://equilibrator. weizmann.ac.il/) 對途徑中各反應(yīng)吉布斯自由能變ΔGm進行計算 (表2)，ΔGm依次為–27.9、–17.7、15.9 kJ/mol。而最終5分子甲醛生成1分子木酮糖總反應(yīng)的ΔGm為–57.6 kJ/mol (<0)，說明在熱力學上該反應(yīng)路線是可行的。

圖2 甲醛到木酮糖催化途徑示意圖

表2 途徑各步反應(yīng)吉布斯自由能變

2.2 甲醛合成木酮糖催化途徑的構(gòu)建

為了能夠?qū)崿F(xiàn)甲醛到木酮糖的途徑，首先將本實驗室?guī)齑尜|(zhì)粒pET28a--M3與pET28a--F178Y分別轉(zhuǎn)入BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，在大腸桿菌中表達并純化蛋白 (方法1.2.1)。SDS- PAGE檢測結(jié)果 (圖3) 表明，BFD-M3、TalB-F178Y蛋白的分子量與理論大小一致，且純度較高，電泳專一性達95%以上，因此可用于催化反應(yīng)。

其次我們采用一鍋酶法實現(xiàn)甲醛直接合成木酮糖的生物途徑 (甲醛到木酮糖合成途徑涉及的單步催化反應(yīng)均可實現(xiàn)[20-21])。HPLC結(jié)果顯示，實驗組與對照組相比檢測到有新峰出現(xiàn)，且新峰出峰位置與目標產(chǎn)物木酮糖出峰位置一致，表明BFD-M3和TalB-F178Y兩酶可以催化甲醛合成木酮糖。雖然可以成功檢測到目標產(chǎn)物木酮糖的生成，但是產(chǎn)量并不高。在5 g/L甲醛濃度下，只有20 mg/L木酮糖生成，轉(zhuǎn)化率為0.4%。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，已報道的TalB-F178Y催化D,L-甘油醛和DHA生成D-果糖時m>120 mmol/L[21]，推測TalB-F178Y對DHA較低的親和力是限制甲醛合成木酮糖的主要原因。

圖3 鎳親和層析純化BFD-M3和TalB-F178Y

2.3 木酮糖合成途徑底物濃度的優(yōu)化

為了檢測甲醛底物濃度對反應(yīng)的影響并提高催化效率，后續(xù)的實驗中設(shè)置了12個甲醛濃度梯度進行測試。HPLC檢測結(jié)果如圖4所示：隨著甲醛底物濃度的升高，木酮糖轉(zhuǎn)化率整體呈上升趨勢；當甲醛濃度為20 g/L時，木酮糖轉(zhuǎn)化率達到4.6%，比5 g/L甲醛濃度的轉(zhuǎn)化率提高11.5倍。實驗結(jié)果與預(yù)期分析一致，高濃度甲醛在BFD-M3催化下生成濃度較高的羥基乙醛和DHA，從而促進后續(xù)反應(yīng)的進行。但甲醛濃度增加到25 g/L時，轉(zhuǎn)化率有所下降，分析原因可能是更高濃度甲醛抑制途徑酶活性，從而影響反應(yīng)速率。另外，由于甲醛對酶的毒性，催化反應(yīng)選擇20 g/L以內(nèi)甲醛底物濃度較為合適。

圖4 一鍋酶法在不同的甲醛濃度下合成木酮糖

2.4 結(jié)合多酶組裝技術(shù)合成木酮糖

為進一步提高木酮糖的產(chǎn)量，本研究結(jié)合Scaffold多酶組裝技術(shù)，利用Scaffold蛋白支架固定BFD-M3、TalB-F178Y蛋白，得到反應(yīng)復合酶體系。Scaffold多酶組裝技術(shù)的使用，理論上可以提高復合酶體系催化中心局部羥基乙醛和DHA濃度，進而提高木酮糖轉(zhuǎn)化率。首先，分別在BFD-M3、TalB-F178Y蛋白C端添加Scaffold配體，所構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a--M3-ctdoc、pET28a--F178Y-ccsdoc、pET20b--見圖5，然后利用復合酶組裝技術(shù)獲得復合酶反應(yīng)液 (方法1.2.5)。利用等同濃度的復合酶催化6–16 g/L梯度濃度的甲醛，進行HPLC檢測，結(jié)果如圖6所示。隨著甲醛濃度的升高，木酮糖產(chǎn)量逐漸提高；當甲醛濃度為16 g/L時，木酮糖產(chǎn)量達到2.20 g/L，木酮糖轉(zhuǎn)化率為13.75%；當甲醛濃度為14 g/L時，甲醛到木酮糖的產(chǎn)量為1.96 g/L，低于16 g/L甲醛濃度的產(chǎn)量，但此時轉(zhuǎn)化率卻達到最高，是未固定化前最高轉(zhuǎn)化率的3倍，達到14.02%。酶的特性是影響途徑反應(yīng)速率的核心因素，本研究通過將酶組裝固定間接提高催化中心局部底物濃度的策略，使得反應(yīng)效率明顯提高。因此要獲得更高的木酮糖產(chǎn)量，需進一步對關(guān)鍵酶進行改造，提高對底物親和性。

圖5 重組質(zhì)粒圖譜(Scaffold配體)

圖6 多酶組裝技術(shù)在不同的甲醛濃度下合成木酮糖

3 結(jié)論

一碳化合物作為很有應(yīng)用前景的綠色能源物質(zhì)，從一碳化合物出發(fā)合成多碳有機分子得到越來越多的關(guān)注。甲醛作為最基本有機原料之一，來源廣泛且容易獲得。木酮糖是生物體中間代謝產(chǎn)物，其獨特的生物活性在不同領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。鑒于此，以甲醛為底物設(shè)計一條新的甲醛-木酮糖生物合成途徑具有重要的意義。本研究設(shè)計的甲醛到木酮糖的新途徑通過兩酶催化底物實現(xiàn)：首先BFD-M3催化甲醛生成羥基乙醛和DHA，TalB-F178Y再將羥基乙醛和DHA聚合形成木酮糖。通過在大腸桿菌中過表達BFD-M3和TalB-F178Y兩個蛋白，采用一鍋酶法催化甲醛生成木酮糖，但轉(zhuǎn)化率只有0.4%左右。經(jīng)過對甲醛底物濃度進行優(yōu)化，木酮糖轉(zhuǎn)化率提高了11.5倍，達到4.6%。為進一步提高木酮糖轉(zhuǎn)化率，采用Scaffold多酶組裝技術(shù)將兩個蛋白BFD-M3、TalB-F178Y組裝固定后進行催化反應(yīng)。當甲醛濃度為14 g/L時，木酮糖轉(zhuǎn)化率達14.02%，較固定化之前最高轉(zhuǎn)化率提高3倍。前期研究表明TalB-F178Y與底物DHA親和力很低 (約120 mmol/L)[21]，可能是限制木酮糖轉(zhuǎn)化的主要原因之一。為了進一步提高木酮糖轉(zhuǎn)化率，在后續(xù)的研究中，可以通過酶定向進化的方法，提高酶對底物親和性。

本研究中的合成木酮糖新途徑，較已有的合成方法更加簡單、方便，節(jié)約成本和時間，為其他稀有糖的合成提供新思路。途徑設(shè)計以甲醛為底物，為一碳資源的利用和新途徑的設(shè)計奠定一定的理論基礎(chǔ)，同時也為生物制造原料來源提供一種新的可能，為解決生物化工與煤化工 (甲醛生產(chǎn)) 產(chǎn)業(yè)銜接問題提供新思路，對于突破現(xiàn)有生物技術(shù)發(fā)展瓶頸具有重要意義。

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(本文責編 郝麗芳)

Enzymatic synthesis of xylulose from formaldehyde

Bo Cui1,2, Bingzhao Zhuo3, Xiaoyun Lu2,Wen Wang3, Dongguang Xiao1, and Huifeng Jiang2

1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 Northwestern Polytechnic University, Xi′an 710072, Shaanxi, China

Xylulose as a metabolic intermediate is the precursor of rare sugars, and its unique pattern of biological activity plays an important role in the fields of food, health, medicine and so on. The aim of this study was to design a new pathway for xylulose synthesis from formaldehyde, which is one of the most simple and basic organic substrate. The pathway was comprised of 3 steps: (1) formaldehyde was converted to glycolaldehyde by benzoylformate decarboxylase mutant BFD-M3 (from); (2) formaldehyde and glycolaldehyde were converted to dihydroxyacetone by BFD-M3 as well; (3) glycolaldehyde and dihydroxyacetone were converted to xylulose by transaldolase mutant TalB-F178Y (from). By adding formaldehyde (5 g/L), BFD-M3 and TalB-F178Y in one pot, xylulose was produced at a conversion rate of 0.4%. Through optimizing the concentration of formaldehyde, the conversion rate of xylulose was increased to 4.6% (20 g/L formaldehyde), which is 11.5 folds higher than the initial value. In order to further improve the xylulose conversion rate, we employed Scaffold Self-Assembly technique to co-immobilize BFD-M3 and TalB-F178Y. Finally, the xylulose conversion rate reached 14.02%. This study provides a new scheme for the biosynthesis of rare sugars.

xylulose, formaldehyde, enzymatic catalysis, Scaffold Self-Assembly technique

November 25, 2017;

January 12, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31670100), the Hundred Talents Program of the Chinese Academy of Sciences.

Huifeng Jiang. Tel/Fax: +86-22-24828732; E-mail: jiang_hf@tib.cas.cn

10.13345/j.cjb.170466

國家自然科學基金 (No. 31670100)，中國科學院百人計劃資助。