咸靜女，郭鑫，李波，彭海波，汪小龍，張建業(yè)，陳剛

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微生物尿酸氧化酶的篩選、酶學性質及重組表達

咸靜女，郭鑫，李波，彭海波，汪小龍，張建業(yè)，陳剛

中國海洋大學，山東 青島 266007

金城. 2018酶工程專刊序言. 生物工程學報, 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

尿酸氧化酶 (Urate oxidase，Uox) 是一種催化尿酸氧化為尿囊素的酶，常用于尿酸的檢測以及痛風和高尿酸血癥治療。文中從土壤中篩選出一株Uox高產菌株OUC-1，經16S rRNA部分基因序列分析，與苛求芽孢桿菌序列相似度達99%。OUC-1的Uox經純化后，分析表明該酶反應最適pH和溫度分別為10.0和40 ℃；Uox以尿酸為底物反應動力學參數m值為 (0.15±0.04) mmol/L (=5)。Mg2+能夠提高該酶性活性，而Zn2+和SDS能強烈抑制該酶的酶活。參考GenBank中苛求芽孢桿菌基因組中的基因序列，成功擴增出基因，通過SWISS-MODEL對Uox空間結構進行預測，推測該酶是同源四聚體，單亞基分子量為35.38 kDa。文中將基因克隆并在大腸桿菌中表達，為后續(xù)的Uox的性能改造提供條件和技術支持。

尿酸氧化酶，苛求芽孢桿菌OUC-1，酶學性質，重組尿酸氧化酶

尿酸氧化酶(Urate oxidase, Uox, EC1.7.3.3)是生物體內嘌呤代謝的關鍵酶，催化尿酸氧化形成尿囊素。研究發(fā)現(xiàn)許多物種中有Uox存在，然而在高等哺乳動物尤其是猿和人類體內卻缺乏具有生物活性的Uox[1]，尿酸在人體內的累積可導致痛風癥[2-4]。近年來隨著飲食結構和生活方式的改變，攝入嘌呤成分的增多，調查發(fā)現(xiàn)成年人痛風發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢[5]，同時流行病學和臨床研究證實了血液中尿酸升高與心血管疾病的發(fā)生有重要的關聯(lián)[6-7]。

隨著研究的深入，在尿酸的檢測、痛風和高尿酸癥治療方面，Uox的應用潛力也逐漸被發(fā)現(xiàn)[8-9]。利用Uox檢測尿酸的方法具有簡單、快速、特異性強的優(yōu)點而成為常用的臨床檢測方法[10]。此外Uox在疾病治療方面可通過直接注射Uox快速降低血液中的尿酸含量，用于痛風癥的長期治療[11]。研究發(fā)現(xiàn)自然界中存在大量的微生物來源的Uox資源[12-14]，這些野生菌產生的Uox雖然在體外具有一定降解尿酸活性，但由于結構和穩(wěn)定性上的缺陷，限制了其在檢測和臨床的應用。因此利用工程菌株異源表達基因，并通過分子雜交和理性設計等手段改造Uox是獲得具有臨床價值藥物的重要途徑。

本研究通過從環(huán)境微生物中篩選高產Uox菌株，發(fā)酵后純化Uox，并對最適溫度、pH等酶學性質進行探究。通過合理設計引物擴增該菌的基因，進行克隆和在大腸桿菌中異源表達，為后續(xù)基因突變表達庫的構建及篩選高穩(wěn)定性和高底物親和力的Uox奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

本研究采用的菌株大腸桿菌DH5α、BL21和質粒pET28a等為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

尿酸降解微生物富集培養(yǎng)基(g/L)：硫酸鎂0.5，氯化鈉0.1，磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.5，尿酸2，pH 7.0；固體分離培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

產尿酸氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)：蛋白胨10 g，蔗糖20 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂1 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸亞鐵10 mg，尿酸1.5 g，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 產尿酸氧化酶菌株的篩選

稱取5 g不同環(huán)境來源的土壤樣品，加入到富集培養(yǎng)基于30 ℃、120r/min振蕩富集培養(yǎng)3–5 d。 梯度稀釋后涂布在含有尿酸的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取含有透明圈的菌落，經分離純化后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3–5 d，檢測發(fā)酵液中Uox的活性，篩選出高產Uox的菌株進行進一步測試。

1.2.2 菌株生長和尿酸氧化酶酶活性檢測

產酶發(fā)酵過程中定時取樣檢測菌體生長和發(fā)酵液Uox酶活。菌體生長通過檢測600的值確定。Uox活性根據文獻[15-16]，將每分鐘轉換1 μmol尿酸的量定義為單位酶活。檢測反應液尿酸溶液在293nm紫外光下吸光值單位時間的減少量來確定。具體公式如下：

1.2.3 產酶菌株16S rRNA基因測序及鑒定

提取產酶菌株的基因組DNA，利用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增[17-18]。擴增產物經純化測序后，序列通過PubMed數據庫中的Blast工具與GenBank中核酸序列進行比對分析，確定與已知菌種的相似關系。DNA測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.4 產酶菌株Uox的純化

產酶菌株發(fā)酵結束后，離心分別獲取菌體和發(fā)酵液。菌體經超聲破碎離心收集上清液，即粗酶液。將胞內外粗酶液經50 mL透析管 (10 kDa)初步脫鹽濃縮后，通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)依次經DEAE-52陰離子交換層析[19]和丙烯基葡聚糖Sephacryl S-300凝膠過濾層析[20]對Uox酶進行進一步純化。

1.2.5 Uox酶學性質分析

將純化好的Uox酶液加入合適的反應體系中，分析溫度 (25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、45 ℃、48 ℃、50 ℃、52 ℃、55 ℃、58 ℃、60 ℃)、pH (7–12)、常見離子 (Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Fe3+和Ca2+) 及酶抑制劑(EDTA、咪唑、SDS) 對Uox酶活的影響，每組實驗分別設置3個平行組。

在酶熱穩(wěn)定性研究中，反應液分別經不同溫度處理10、20、30min后檢測酶活變化；檢測金屬離子對Uox影響實驗中，離子的濃度設置為 0–6mmol/L，除Ca2+使用CaCl2外，其他金屬離子都使用其硫酸鹽化合物；檢測酶抑制劑EDTA、咪唑、SDS對Uox活性的影響，抑制劑的濃度分別設置為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 mmol/L。

1.2.6 苛求芽孢桿菌OUC-1的Uox米氏常數 (m) 測定

在25 ℃條件下，0.2 mmol/L硼酸鈉反應體系(pH 9.0)中，測試不同濃度的尿酸(0.1–0.5 mmol/L)底物，在293nm處1min內光吸收的減少量。根據 Lineweaver Burk法[21]作圖計算該尿酸酶的m。

1.3 苛求芽孢桿菌B. fastidiosus OUC-1來源的uox基因的克隆、表達

基因擴增：根據GenBank中已知的保守序列設計擴增OUC-1菌的基因全序列的引物[22-23]，為便于克隆測序，分別在正向和反向引物序列的5?端引入酶HⅠ和dⅢ酶切位點，具體引物序列如下。正向引物UoxF：5?-CGGG ATCCATGTTTTATGGTAAAGGCG-3?；反向引物UoxR：5?-CCCAAGCTTTCATAGTGCA ACATACTCCG-3?。PCR擴增參考文獻[24-25]進行。

表達載體pET28a/uox的構建：基因PCR 擴增產物和質粒pET28a分別用HⅠ和d Ⅲ雙酶切后回收純化，經T4 DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，構建成重組質粒pET28a/，重組質粒序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

大腸桿菌重組表達Uox蛋白的分離純化：含有Uox重組子表達的工程大腸桿菌經發(fā)酵、IPTG誘導表達后48 h收獲菌體，7 500 r/min離心 20 min后收集菌體，菌體經超聲波破菌后離心，上清和重懸的沉淀分別經12% SDS-PAGE 分析來確定其為胞內可溶或包涵體表達，重組蛋白通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)，經親和層析柱純化[26]后檢測酶活。

2 結果與分析

2.1 產尿酸氧化酶菌株的篩選和鑒定

經過富集篩選從環(huán)境樣品中純化出9株具有產透明圈的菌株，經PCR擴增16S rRNA部分序列并測序進行序列比對后，根據GenBank中菌落序列的相似性比對結果 (序列相似度>98％)，初步鑒定uo-331、uo-332、uo-333、uo-334、uo-335、uo-338為芽孢桿菌屬，uo-336、uo-411為假單胞菌屬，uo-412為微桿菌屬。根據透明圈的大小和發(fā)酵液酶活的初步測試，uo-338菌株的酶活最高，其16S rRNA序列與苛求芽孢桿菌基因序列(NR_113989) 相似性>99%。菌株經進一步的生理生化分析后確認為苛求芽孢桿菌OUC-1，以下實驗將針對該菌Uox酶進行研究。

2.2 B. fastidiosus OUC-1的生長和產酶曲線測定

實驗結果 (圖1) 顯示，OUC-1 經發(fā)酵培養(yǎng)36 h時生長量達到最高，隨后菌株的600值趨于穩(wěn)定。發(fā)酵液酶活在培養(yǎng)12 h前未檢測到Uox活性，24 h酶活達0.128 U/mL，到30 h時酶活性最高，達到0.183 U/mL，隨后酶活性逐漸下降。

圖1 B. fastidiosus OUC-1的生長和酶活測定

2.3 B. fastidiosus OUC-1產Uox的純化

實驗中發(fā)酵液及菌體內都檢測出Uox酶活性，發(fā)酵后細胞粗酶液經超濾濃縮和進一步的離子交換、凝膠層析純化后，胞內外Uox酶活都有不同程度的提高 (表1)，胞內Uox的比酶活提升了5倍，胞外Uox的比酶活則提升了13倍。SDS-PAGE結果(圖2) 也表明Uox經純化后純度明顯提高，且主要分布在35–40 kDa之間。

表1 純化過程的酶活和比酶活

圖2 OUC-1胞外(A)、胞內 (B) 純化Uox的SDS-PAGE圖譜

2.4 苛求芽孢桿菌B. fastidiosus OUC-1來源Uox的酶學性質

2.4.1 Uox的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性研究

實驗結果顯示 (圖3)，40 ℃為該酶的最適反應溫度。溫度從25 ℃升高到40 ℃時，OUC-1 的Uox活性隨溫度的升高處于較平穩(wěn)的狀態(tài)，在40 ℃熱處理10 min后達到最高。當溫度從48 ℃增高到55 ℃以上時，酶活從高點快速下降到8%左右，并隨著處理時間的延長，其酶的 熱穩(wěn)定性也呈下降趨勢，尤其是在50 ℃和52 ℃熱處理30 min后酶活衰減較快。溫度繼續(xù)升高到60 ℃，酶活一直保持在較低的水平，此時延長熱處理時間并不能使酶活快速降低。

2.4.2 pH對Uox酶活性的影響

以pH 9.0為參照，實驗結果顯示(圖4)，反應體系的pH從7.0升高到10.0過程中，Uox的相對酶活從30%升高到120%，之后隨pH從10.0升高到12.0，酶活呈快速下降趨勢，該Uox酶的最適pH應在10.0左右。

圖3 溫度對Uox酶活的影響

圖4 pH對Uox酶活的影響

2.4.3 不同金屬離子對Uox活性的影響

實驗結果(圖5) 顯示出Zn2+對Uox酶活性有明顯的抑制作用，在較低濃度(0.5 mmol/L)時Uox相對酶活為11.15%；而Mg2+隨著濃度的增加能顯著提高Uox酶的活性，當濃度達到6 mmol/L時，相對酶活高達163.27%。K+和Ca2+在測試濃度范圍內對酶活無明顯影響。而Cu2+和Fe3+隨著濃度升高，其對Uox的抑制作用明顯，金屬Mn2+離子在測試濃度范圍可能對Uox活性略有抑制。

2.4.4 抑制劑對Uox活性的影響

圖6結果表明Uox酶活隨著SDS濃度升高而迅速降低，尤其當SDS濃度高于3 mmol/L時，Uox幾乎沒有活性。咪唑在0.5–8 mmol/L濃度范圍內對Uox無明顯影響。EDTA作為常見的金屬螯合劑，在0.5 mmol/L時相對酶活高達134%，對Uox具有明顯促進作用，但隨著濃度的持續(xù)升高(>4 mmol/L)，其促進作用減弱到對照的酶活水平。

圖5 不同離子對Uox酶活的影響

圖6 常見酶抑制劑對Uox酶活的影響

2.5 Uox的米氏常數(Km) 和Vmax測定

根據Lineweaver Burk作圖法求得苛求芽孢桿菌OUC-1尿酸氧化酶的m為(0.15± 0.04) mmol/L(=5)(圖7)，max為0.021 mol/(L·min)。米氏方程為：1/=7.01/+46.57。

2.6 uox基因的克隆和重組表達

2.6.1基因的擴增及表達載體的構建

以苛求芽孢桿菌OUC-1的基因組DNA為模板，經PCR擴增出大小約為900 bp的DNA片段，測序后序列經NCBI網站的ORF Finder轉換為蛋白質序列，利用SWISS-MODEL建模推測該酶為同源四亞基，單亞基的分子量為35.38 kDa，等電點pI為5.1。OUC-1的基因序列通過NCBI網站的blastn和blastp分析工具與GenBank中的已知基因和Uox酶蛋白質進行比對，發(fā)現(xiàn)與已報道[27]的29604的基因和Uox序列高度相似，同源性分別達到96%和97.5%，但單亞基的氨基酸序列上存在7個氨基酸的差別：D103S、K118Q、K207Q、A215P、T230S、N234T、E236D。

通過進化樹分析 (圖8) 可看出OUC-1的Uox與其他種類Uox的同源性相對較低。利用UniProt網站數據庫中蛋白比對推測該菌的Uox活性位點為65位蘇氨酸 (T) 和66位的天冬氨酸 (D)、175位的苯丙氨酸 (F) 以及192位的精氨酸 (R)。

圖7 雙倒數作圖法測定Km

圖8 基于氨基酸序列的鄰接法 (N-J) 構建的Uox系統(tǒng)發(fā)育關系進化樹

2.6.2 苛求芽孢桿菌.OUC-1的基因克隆及大腸桿菌異源表達

的基因在大腸桿菌重組表達的實驗中，轉化后涂布在含有尿酸的固體培養(yǎng)基上，與對照組相比，含有尿酸氧化酶菌落的周圍已變透明，說明該重組子能分解Uox，進一步對重組子測序分析證明Uox已在大腸桿菌中異源表達成功。重組子發(fā)酵液菌體超聲波破碎后所得上清液經Ni柱親和層析純化獲得重組表達的Uox。酶活測試顯示，經IPTG誘導和未加誘導皆有Uox產生(圖9)，但未加IPTG的對照組全菌裂解液上清酶活為0.07 U/mL，而加入IPTG誘導的實驗組酶活達2.32 U/mL，酶活提升30多倍。

3 討論

Uox作為醫(yī)學檢測試劑和治療用酶具有廣闊的市場前景。微生物是尿酸氧化酶的一個重要來源，具有易于培養(yǎng)和代謝類型多樣的特點。目前國內外已有許多微生物尿酸酶研究報道[28-33]，本研究從土壤等環(huán)境樣品中篩選得到了多株產Uox的菌株，有假單胞菌、微桿菌、芽孢桿菌等菌株。其中苛求芽孢桿菌OUC-1產酶較高。OUC-1具有同時產生分泌性和細胞內Uox酶的特點，但野生菌的生長和產酶依賴尿酸誘導，并且可同化的底物少，這提高了Uox的生產成本，尚需遺傳改良得以提高產率。野生菌株的遺傳背景相對復雜，提高酶活和改進酶學性質存在一定難度。將基因克隆到表達載體，一方面可利用工程菌直接生產Uox，也利于分子進化和理性設計等分子改造快速改善酶的性能。本實驗表達的重組后Uox發(fā)酵產酶量達到了野生菌株的30倍，同時省去了添加價格昂貴的尿酸。

圖9 Uox表達的SDS-PAGE分析

本研究篩選的OUC-1產Uox由同源四聚體構成，與1978年Bongaerts報道的 由2個36 kDa和2個39 kDa的亞基組成的SMG83 Uox異四聚體不同，后者只存在菌體胞內，兩者在最適溫度上也存在差異[10,28]。在氨基酸序列和空間結構上與ATCC 29604同源性非常高，僅有7個氨基酸差異，可能是同一種酶。其中有3個氨基酸T230S、N234T、E236D位于α螺旋 (225–238) 中，另外幾個氨基酸的電性和疏水性等性質都存在變化，這些變化可能通過靜電網絡和空間結構的改變對酶活性產生一定的影響。

OUC-1來源Uox的m為 0.15 mmol/L，明顯低于ATCC 29604 (0.22 mmol/L)[27]，也低于Bongaerts等早期報 道的SMG83產生的尿酸酶 (0.18 mmol/L)[28]，另外相對于Kai等[34]報道的一種微桿菌屬尿酸酶(0.31 mmol/L)，以及李想等[35]報道的芽孢桿菌胞內尿酸酶(0.29 mmol/L)，OUC-1尿酸酶的m值較低，說明其與底物親和性更強。

研究報道不同金屬離子對不同微生物來源的Uox活性的作用不同[36]。本研究設置了0.5–6.0 mmol/L 的不同離子濃度梯度，發(fā)現(xiàn)Mg2+對Uox有明顯的促進作用，并且隨著濃度的提高促進作用更明顯，這在其他文獻中很少報道。而Zn2+對Uox活性有明顯的抑制作用，與報道的Zn2+對球形節(jié)桿菌[36]、SMG83[28]和微桿菌sp. ZZJ4-1[37]的尿酸酶抑制作用相似。之前研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對不同微生物尿酸酶也存在不同的作用，本研究隨Cu2+濃度升高，其抑制作用逐漸增強，但仍與Cu2+表現(xiàn)出對FERM BP-360、sp. TB-90和來源[37]的Uox的強抑制作用有區(qū)別。

雖然OUC-1來源的Uox與ATCC 29604的Uox相似性非常高，但兩者在底物的親和力、離子對酶的影響方面還是有很大的差異，并且這些酶有些性質的差異與氨基酸的變化之間可能存在關聯(lián)，尚需進一步研究。

當前應用于檢測和臨床治療的Uox普遍存在熱穩(wěn)定差和免疫原性問題，在儲藏、運輸和應用過程中容易失活。目前對熱穩(wěn)定性好的Uox研究較少。因此以重組表達的苛求芽孢桿菌基因為基礎，采用易錯PCR或與其他尿酸氧化酶進行分子進化等技術，構建Uox基因突變庫篩選和設計具有高耐熱和pH穩(wěn)定性Uox是今后研究的方向。

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(本文責編 郝麗芳)

Screening, characterization and expression of microbial urate oxidase

Jingnü Xian, Xin Guo, Bo Li, Haibo Peng, Xiaolong Wang, Jianye Zhang, and Gang Chen

Ocean University of China, Qingdao 266007, Shandong, China

Urate oxidase (Uox), an enzyme catalyzing oxidation of uric acid to allantoin, is widely used as diagnostic reagents and for treatments of uarthritis and hyperuricemia diseases. In our study, a higher Uox producer, bacterial strain OUC-1, was isolated from soil samples. The 16S rRNA gene sequence of strain OUC-1 showed 99% identity to the homologous fragments of. After purification, Uox showed the optimal pH and temperature was 10.0 and 40 °C. Themvalue of Uox was (0.15±0.04) mmol/L (=5) with uric acid as the substrate. Uox activity was enhanced by Mg2+, and seriously inhibited by Zn2+and SDS. Then thegene ofOUC-1 was amplified and sequenced. The 3D structures of Uox, predicted with SWISS-MODEL, showed a homotetramer structure with a subunit molecular weight of 35.38 kDa. Finally, the gene coding for theUox was successfully cloned and heterologously expressed in,which provides theoretical basis and technical support for improvement of Uox in the future.

urate oxidase,OUC-1, enzymatic properties, recombinant urate oxidase

December 27, 2017;

February 26, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 41476090).

Gang Chen. E-mail: chengang@ouc.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 41476090) 資助。

2018-03-26

http//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180326.0926.002.html

10.13345/j.cjb.170524