高潔，李益民，杜聰，裴緒澤，盧慧敏，趙孝陽(yáng)，袁文杰

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褐藻膠裂解酶基因的克隆表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)

高潔，李益民，杜聰，裴緒澤，盧慧敏，趙孝陽(yáng)，袁文杰

大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

金城. 2018酶工程專(zhuān)刊序言. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

隨著大型褐藻生產(chǎn)燃料乙醇以及褐藻寡糖重大藥用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，褐藻膠裂解酶成為國(guó)內(nèi)外多個(gè)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。文中對(duì)解藻酸弧菌上與褐藻膠降解相關(guān)的5個(gè)基因分別進(jìn)行克隆表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE和酶活性定量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該基因簇中的4個(gè)基因有降解褐藻膠活性。對(duì)酶活最高的rAlgV3進(jìn)行了誘導(dǎo)條件的優(yōu)化、酶蛋白純化及酶性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化誘導(dǎo)條件后重組酶rAlgV3的酶活由2.34×104U/L上升為1.68×105U/L，比優(yōu)化前提高了7.3倍；對(duì)酶性質(zhì)進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn)該酶在4–70 ℃均有活性，最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在4–20 ℃酶相對(duì)穩(wěn)定；該酶在pH 6.5?9.0環(huán)境下均有較高的酶活，最適pH為8.0；pH穩(wěn)定性好，在pH 4.5–9.5環(huán)境下可以穩(wěn)定存在；適量的NaCl濃度和Fe2+、Fe3+等離子具有促進(jìn)酶活的作用，SDS和Cu2+離子可明顯抑制酶活力。對(duì)該酶的底物特性的研究發(fā)現(xiàn)，該酶不僅可以降解褐藻膠中的Poly-M片段，也能降解Poly-G片段，具有廣泛底物特性；其降解海藻酸鈉主要釋放二糖和三糖，是一種內(nèi)切酶。該酶對(duì)于第三代燃料乙醇的發(fā)展及褐藻寡糖的生產(chǎn)具有重要作用。

褐藻膠裂解酶，解藻酸弧菌，克隆表達(dá)，酶性質(zhì)，燃料乙醇

大型海藻生長(zhǎng)在潮間帶或亞潮帶，生存范圍廣，生長(zhǎng)迅速，并且不與陸生植物競(jìng)爭(zhēng)耕地、水源、肥料等資源，還可以固定大氣和海水中的二氧化碳，能有效緩解溫室效應(yīng)和海水酸化的問(wèn)題，具有良好的環(huán)境效益。海藻生物質(zhì)的主要成分是褐藻多糖，占褐藻植物干重的10%?40%[1-2]，廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)學(xué)材料、化妝品和生物燃料等領(lǐng)域。

褐藻膠是一種含量最豐富的褐藻多糖[2-4]，由L-古羅糖醛酸 (α-L-guluronic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)G) 和D-甘露糖醛酸 (β-D-mannuronic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)M) 兩種單元通過(guò)1,4-糖苷鍵連接而成。其組合方式有以下3種，即：均聚古羅糖醛酸片段 (Poly- gulutonate，Poly-G)、均聚甘露糖醛酸片段 (Poly- mannuronate，Poly-M) 和甘露糖醛酸-古洛糖醛酸混合嵌合片段 (Poly-MG)[5]。目前，褐藻膠降解的方法主要有化學(xué)降解法[6-7]、物理降解法[8-9]和 酶解法[10-11]，相比而言，酶促降解褐藻膠更有優(yōu)勢(shì)[12]，其效率高、無(wú)毒副產(chǎn)物，更適于褐藻膠寡糖的制備。通過(guò)酶法降解獲得的源自褐藻膠的各種寡糖具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗增殖和抗過(guò)敏活性等生理功能和生物活性[13-15]。低聚糖和寡糖因分子量小，容易被利用，其功能活性往往較多糖高，應(yīng)用更為 廣泛[16-17]。

以微藻和大型褐藻為底物的第三代生物能源，更是目前引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)[18-19]。海藻是生產(chǎn)生物燃料的一種理想原料，具有很大的潛力。海藻的生物構(gòu)造特征賦予它一種優(yōu)于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)，易于高產(chǎn)，且避開(kāi)了發(fā)酵前的耗能性預(yù)處理和水解過(guò)程。然而，目前尚未實(shí)現(xiàn)由海藻生產(chǎn)乙醇的全部潛能，主要是因?yàn)楣I(yè)微生物不能代謝海藻多糖組分，必須先降解為單糖或寡糖后才能被微生物利用。

因此，褐藻膠裂解酶溫和降解褐藻膠成為大型褐藻利用的關(guān)鍵點(diǎn)。文中對(duì)海藻酸裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)和機(jī)理方面進(jìn)行研究，進(jìn)而通過(guò)基因工程手段來(lái)提高褐藻膠裂解酶的產(chǎn)量，獲得高活力低成本的褐藻膠裂解酶。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株：解藻酸弧菌BH17 (BH17)，本實(shí)驗(yàn)室從腐爛海帶中篩選鑒定并保藏；大腸桿菌DH5α、BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒載體pET29a (+) 購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2 主要儀器和試劑

儀器：Image Lab凝膠成像系統(tǒng) (美國(guó)BIO-RAD公司)；Mini-PROTEAN Tetra蛋白電泳儀 (美國(guó)BIO-RAD公司)；蛋白純化重力柱，購(gòu)自TaKaRa公司。

試劑：PCR純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白膠配制試劑盒購(gòu)自BIO-RAD公司；海藻酸鈉購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純 (AR)；Poly-M、Poly-G購(gòu)自青島博智匯力生物科技有限公司。

1.3 褐藻膠裂解酶基因的克隆

1.3.1 褐藻膠裂解酶基因引物的合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，查找解藻酸弧菌上可能的褐藻膠裂解酶基因[20]，如圖1所示，以此基因序列及載體的多克隆位點(diǎn)，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物序列，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.2 褐藻膠裂解酶基因的克隆

將設(shè)計(jì)好的引物交由上海生工生物工程公司合成，根據(jù)引物值，用無(wú)菌水將其稀釋至10 μmo1/L，于–20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩a(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株 過(guò)夜培養(yǎng)，以此為模板，構(gòu)建50 μL PCR反應(yīng)體系，具體見(jiàn)表2。所得PCR產(chǎn)物通過(guò)OMEGA BIO-TEK公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物備用，或克隆至pET29a質(zhì)粒后測(cè)序并提取重組質(zhì)粒備用。

圖1 V. alginolyticus 40B基因組上推定的海藻酸裂解酶生物合成基因簇[20]

表1 褐藻膠裂解酶各基因的引物

Underline represent the restriction site.

1.3.3 重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將純化后的目的基因與載體按照連接體系 (表3) 于16 ℃過(guò)夜連接，并用熱擊法轉(zhuǎn)入擴(kuò)增宿主DH5α中。檢測(cè)陽(yáng)性克隆，雙酶切驗(yàn)證 (37 ℃，1?3 h或過(guò)夜)正確后送生工生物工程 (上海) 股份有限公司檢測(cè)序列。陽(yáng)性克隆中的目的基因序列無(wú)突變時(shí)，提取重組質(zhì)粒，并采用熱擊法轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主BL21。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 連接體系

1.4 重組酶的表達(dá)與酶活測(cè)定

1.4.1 重組酶的表達(dá)及檢測(cè)

將構(gòu)建成功的5株攜帶重組質(zhì)粒的宿主菌過(guò)夜活化后，1%接種量轉(zhuǎn)接于含終濃度50 μg/mL卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基中。于37 ℃搖床中培養(yǎng)至6200.6?0.7，加入終濃度60 mmol/L IPTG于18 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。離心收集菌體，用0.05 mmol/L PBS緩沖溶液稀釋菌體并在冰上超聲破碎 (功率300 W，工作3 s，間歇3 s，30 min)，全菌體于4 ℃離心分離得上清和沉淀。

SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)量：取待測(cè)樣品30 μL，加入10 μL的4×上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min。300 V電壓20?30 min后，取出蛋白膠通過(guò)凝膠檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。比較對(duì)應(yīng)位置處蛋白條帶鑒定重組酶是否表達(dá)或純化。

1.4.2 重組酶的酶活測(cè)定

目前，褐藻膠裂解酶的酶活力測(cè)定方法主要有硫代巴比妥酸法 (TBA)[21]、紫外吸收法[22-23]、粘度法[24]和還原糖法 (DNS)[25-26]。紫外吸收法是基于酶解產(chǎn)生的不飽和糖醛酸在230?240 nm處有較高的吸收峰，這種方法比較靈敏，是目前褐藻膠裂解酶酶活力測(cè)定的主要方法。

酶活力單位的定義為：235 nm下吸光值每分鐘增加0.1所需的酶量作為一個(gè)酶活單位。底物配制：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 8.0)，0.5%海藻酸鈉，0.4 mol/L氯化鈉。0.3 mL底物加0.l mL適當(dāng)稀釋的酶液于40 ℃水浴保溫20 min后，加入0.6 mL HCl終止反應(yīng)，在235 nm下測(cè)定其吸光值。

1.5 Gu柱親和層析法純化重組酶

采用重力柱 (購(gòu)自大連TaKaRa公司) 對(duì)重組酶進(jìn)行純化，緩沖液體系見(jiàn)表5，具體操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

收集的流出液通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)純度：取待測(cè)樣品30 μL，加入10 μL的4×上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min。300 V電壓20?30 min后，取出蛋白膠通過(guò)凝膠檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。比較對(duì)應(yīng)位置處蛋白條帶檢測(cè)純化效果。

表5 蛋白純化緩沖液體系

1.6 重組酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.6.1 重組酶rAlgV3的最適溫度及其穩(wěn)定性

(1) 等體積的酶與底物混合，分別在4 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴中反應(yīng)20 min測(cè)定酶活。

(2) 對(duì)于熱穩(wěn)定性，將重組酶酶液在4 ℃冰箱及20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴1 h后，迅速冷卻至4 ℃后測(cè)定酶活。

1.6.2 重組酶rAlgV3的最適pH及其穩(wěn)定性

(1) 分別用以下緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH：乙酸-乙酸鈉緩沖液 (pH 4.5、5.0、5.5、6.0)，Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液 (pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0、8.5、9.0) 和硼砂-氫氧化鈉緩沖液 (pH 9.0、9.5、10.0)，測(cè)定褐藻膠裂解酶在不同pH條件下的酶活力。

(2) 將酶分別加入到上述幾種緩沖液體系中，并于4 ℃保存24 h，測(cè)定酶活力。

1.6.3 不同離子對(duì)重組酶的影響

在酶與底物的反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 mmol/L的SDS、CuCl2、MnCl2、NaCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、FeSO4、FeCl3、EDTA溶液，未加任何離子反應(yīng)體系的酶活定義為100%，測(cè)定其他反應(yīng)體系中的酶活力。

1.6.4 不同NaCl濃度對(duì)酶活的影響

在酶與底物的反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為0、100、300、500、700、900 mmol/L 的NaCl溶液，測(cè)定酶活力。

1.6.5 重組酶底物偏好性分析

將2 μL褐藻膠裂解酶液和攜帶空載體的裂解菌液分別加在含0.5%褐藻酸鈉、Poly-G、Poly-M的平板上，40 ℃培養(yǎng)24 h后，加入CaCl2溶液觀察酶對(duì)底物分解情況進(jìn)行分析。

1.7 褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物ESI-MS分析

為了確定降解產(chǎn)物的聚合度，利用ESI-MS進(jìn)行質(zhì)譜分析。所用儀器型號(hào)：LTQ Orbitrap XL，加熱器溫度：400 ℃，載氣流量：10 L/min，輔助氣體流量：10/3 L/min，毛細(xì)管溫度：350 ℃，毛細(xì)管電壓：39 V，掃描質(zhì)量范圍150–1 500/。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

1–5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和陽(yáng)性克隆鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2，條帶清晰，與理論大小值相符(1–5堿基數(shù)分別為1 044、1 554、1 752、2 166和2 256 bp)。5個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序，其中插入基因的序列與已知基因組測(cè)序的序列相似度均大于98%，這表明1–5序列正確。

2.2 褐藻膠裂解酶的表達(dá)與誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.2.1 五株重組菌褐藻膠裂解酶的表達(dá)

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，各重組菌超聲破碎后超聲上清液和超聲沉淀中重組蛋白表達(dá)情況如圖3所示。由圖可以看出rAlgV1–rAlgV5在相應(yīng)位置均有表達(dá)，與經(jīng)誘導(dǎo)攜帶空載體菌液相比，重組酶rAlgV2–rAlgV5均產(chǎn)生了可溶性蛋白。rAlgV1表達(dá)產(chǎn)物均在沉淀中，可能是由于重組酶產(chǎn)生了包涵體等不溶蛋白。

通過(guò)紫外吸收法測(cè)定5株重組菌發(fā)酵上清和超聲破碎后上清的酶活，結(jié)果見(jiàn)表6。

圖2 AlgV1–algV5的PCR結(jié)果

圖3 重組酶rAlgV1–rAlgV5的SDS-PAGE分析

表6 各重組菌海藻酸酶活性的定量測(cè)定

通過(guò)體外測(cè)定酶活驗(yàn)證1、2、3、5基因?yàn)楹Ｔ逅崃呀饷妇幋a基因；其中rAlgV1–rAlgV3這3個(gè)重組菌均有胞外褐藻膠酶活性，這與胥晴晴[20]研究結(jié)果一致，但是胞外酶活性相對(duì)較低，應(yīng)用價(jià)值較??；由圖3可以看出rAlgV4和rAlgV5均進(jìn)行了大量可溶性表達(dá)，但是rAlgV4胞內(nèi)外均未檢測(cè)到酶活，原因可能是其褐藻膠裂解酶的活性低，褐藻膠裂解酶活性的定量測(cè)活方法不靈敏導(dǎo)致未能測(cè)出海藻酸裂解酶的活性，也可能其本身就無(wú)海藻酸裂解酶活性，而與褐藻膠異構(gòu)酶的活性相關(guān)；同樣rAlgV5僅在胞內(nèi)檢測(cè)到少量酶活，可能原因與rAlgV4相同；重組蛋白rAlgV2表達(dá)量較高，酶活也較高，具有一定的應(yīng)用潛力；重組酶rAlgV3的酶活性很高，尤其是胞內(nèi)酶活，這比文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果高了23倍，具有很高的應(yīng)用價(jià)值[20]。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇rAlgV3為研究對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，提高rAlgV3的表達(dá)量，進(jìn)而對(duì)該酶進(jìn)行分離純化與酶性質(zhì)的表征。

2.2.2 rAlgV3誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

為了提高rAlgV3的表達(dá)量，本研究對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)、誘導(dǎo)劑IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間 4個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖4。由優(yōu)化結(jié)果可知，最佳誘導(dǎo)條件為37 ℃培養(yǎng)菌體達(dá)到0.4，于25 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)酶活影響不大。優(yōu)化后重組酶rAlgV3表達(dá)量提高，酶活達(dá)到1.68×105U/L，比優(yōu)化前提高了7.3倍。

圖4 重組酶rAlgV3誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.3 重組酶rAlgV3的純化及酶性質(zhì)研究

2.3.1 重組蛋白酶的分離純化

由于重組酶rAlgV3帶有His-Tag，通過(guò)TaKaRa公司的重力柱進(jìn)行純化，收集的流出液進(jìn)行SDS-PAGE (圖5)，發(fā)現(xiàn)純化的褐藻膠裂解酶有兩條相近條帶，通過(guò)Western blotting發(fā)現(xiàn)兩條帶均帶有組氨酸標(biāo)簽，可能原因?yàn)橘|(zhì)粒pET29a與目的基因均存在起始密碼子，或者蛋白酶的部分降解導(dǎo)致。對(duì)收集到的純酶進(jìn)行活性測(cè)定為398 U/mg。

2.3.2 重組酶rAlgV3酶學(xué)性質(zhì)的研究

重組酶rAlgV3的最適溫度和熱穩(wěn)定性：等體積的酶rAlgV3與底物混合后，分別在4 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴中反應(yīng)20 min測(cè)定酶活，結(jié)果見(jiàn)圖6A。由結(jié)果可知，該酶40 ℃酶活最高，而在4?70 ℃均有酶活，可見(jiàn)該酶反應(yīng)的溫度范圍較廣，可在多種反應(yīng)溫度中應(yīng)用。

對(duì)于熱穩(wěn)定性，將重組酶rAlgV3酶液在4 ℃冰箱及20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴1 h后，迅速冷卻至4 ℃后測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖6B。由結(jié)果可知，該重組酶rAlgV3在20 ℃以?xún)?nèi)酶活變化較小，具有很好的穩(wěn)定性，30 ℃以上酶活下降，到60 ℃以上酶活性完全喪失。這說(shuō)明重組酶rAlgV3不宜在高溫環(huán)境中長(zhǎng)期保存。

重組酶rAlgV3的最適pH和pH穩(wěn)定性：分別用以下緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH：乙酸-乙酸鈉緩沖液 (pH 4.5、5.0、5.5、6.0)，Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液 (pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0、8.5、9.0)和硼砂-氫氧化鈉緩 沖液 (pH 9.0、9.5、10.0)，測(cè)定褐藻膠裂解酶不同pH條件下的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖7A。重組 酶rAlgV3在pH 5.0以下幾乎沒(méi)有酶活，直至pH 8.0達(dá)到最大值，當(dāng)pH大于8.0后酶活下降，當(dāng)pH為10時(shí)，酶活性完全喪失。由圖可知，重組酶rAlgV3適合反應(yīng)的pH為6.5?9，具有廣泛pH特性。

將酶分別加入到以上3種緩沖液體系中，并放于4 ℃冰箱中保存24 h，測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖7B，pH 4.5?9.5時(shí)相對(duì)酶活變化不大，而pH為10時(shí)，酶活幾乎完全喪失，由其變化趨勢(shì)可知，重組酶rAlg2的pH穩(wěn)定范圍為4.5?9.5，可見(jiàn)該酶具有耐酸耐堿的特性，在不同pH中穩(wěn)定性很好，與目前文獻(xiàn)報(bào)道的酶活pH穩(wěn)定性相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

不同離子對(duì)重組酶rAlgV3酶活的影響：在酶與底物的反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 mmol/L的SDS、CuCl2、MnCl2、NaCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、FeSO4、FeCl3、EDTA溶液，未加任何離子反應(yīng)體系的酶活定義為100%，測(cè)定反應(yīng)體系中的相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果表明，SDS、Cu2+具有明顯抑制酶活作用，而Fe2+、Fe3+有促進(jìn)酶活的作用，其他離子影響不大。

不同NaCl濃度對(duì)重組酶rAlgV3活性的影響：由于褐藻膠裂解酶主要產(chǎn)自海洋微生物，NaCl濃度是其發(fā)生反應(yīng)的一個(gè)重要影響因素，故考察了高NaCl濃度對(duì)該酶的影響。在酶與底物的反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為0、100、300、500、700、900 mmol/L的NaCl溶液，測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖可以看出，NaCl濃度為300?500 mmol/L時(shí)，酶活性最高，適量的NaCl對(duì)酶活具有促進(jìn)作用。

圖8 離子對(duì)重組酶rAlgV2酶活的影響

圖9 不同NaCl濃度對(duì)rAlgV3酶活性的影響

重組酶rAlgV3底物偏好性分析：由于古羅糖醛酸的聚合物 (Poly-G)能和Ca2+形成白色的膠狀絡(luò)合物，而聚甘露糖醛酸 (Poly-M)和Ca2+結(jié)合是無(wú)色的，因此，如果加入的酶能夠降解Poly-G，則濾紙片周?chē)霈F(xiàn)透明的圓圈；如果不降解Poly-G，則出現(xiàn)白色的暈圈；如果既降解Poly-G又降解Poly-M，則也是出現(xiàn)透明圈。根據(jù)此原理，將2 μL褐藻膠裂解酶液和攜帶空載的裂解菌液分別加在0.5%海藻酸鈉、Poly-G、Poly-M成分的平板上，40 ℃培養(yǎng)24 h后加入CaCl2溶液，結(jié)果見(jiàn)圖10。分別以0.5%的海藻酸鈉、Poly-G、Poly-M為底物，檢測(cè)相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖10 褐藻酸酶降解不同成分平板的結(jié)果

圖11 重組酶rAlgV3的底物偏好性

由結(jié)果可知，該酶在3個(gè)平板上均產(chǎn)生透明圈，且對(duì)3種底物都有活性，說(shuō)明該酶既可以分解Poly-M片段，也可以分解Poly-G片段，具有廣泛底物特性，且偏好Poly-M。目前發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶普遍具有單一性，能同時(shí)分解兩種片段的酶比較少，該酶的發(fā)現(xiàn)可將褐藻膠有效降解成單糖，為褐藻的生物轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

2.4 褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物ESI-MS分析

為了對(duì)該酶的降解產(chǎn)物作進(jìn)一步的分析，采用ESI-MS分析方法，將0.9 mL的0.5%海藻酸鈉與0.1 mL重組酶rAlgV3酶液于40 ℃反應(yīng)1 h，然后煮沸5 min滅活，產(chǎn)物離心脫鹽后，進(jìn)行ESI-MS質(zhì)譜分析 (圖12)。

圖12 褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物ESI-MS分析

從質(zhì)譜圖上可以看出，對(duì)于海藻酸鹽，酶解后產(chǎn)物主要是聚合度較低的寡糖，其中二糖和三糖為主要降解產(chǎn)物 (圖12)，可見(jiàn)該酶為內(nèi)切酶。褐藻膠寡糖應(yīng)用廣泛，該酶可作為生產(chǎn)褐藻膠寡糖的有效工具。

3 結(jié)論

本研究對(duì)解藻酸弧菌上可能的5個(gè)褐藻膠裂解酶進(jìn)行了克隆表達(dá)，成功構(gòu)建了5株重組菌，其中觀察到重組酶rAlgV3具有較高酶活。對(duì)重組酶rAlgV3進(jìn)行了誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，該酶的表達(dá)量明顯提高，且酶活力達(dá)到1.68×105U/L，相比文獻(xiàn)報(bào)道的rAlgV3酶活性高出168倍[20]，可能由于蛋白序列差異引起的，值得進(jìn)一步探究。對(duì)重組酶rAlgV3的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)環(huán)境變化高度適應(yīng)，具有較廣的溫度范圍和很好的pH穩(wěn)定性，這與大部分報(bào)道的褐藻膠裂解酶相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)重組酶rAlgV3底物偏好性分析發(fā)現(xiàn)，該酶既能分解Poly-M片段，也能分解Poly-G片段，具有底物多樣性的特點(diǎn)。ESI-MS分析發(fā)現(xiàn)，該酶可將底物主要降解為二糖和三糖，是產(chǎn)生褐藻膠寡糖的有效工具，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、能源等領(lǐng)域，是一種在商業(yè)上具有應(yīng)用潛力的酶。

[1] Wong TY, Preston LA, Schiller NL. Alginate lyase: review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications. Ann Rev Microbiol, 2000, 54(1): 289–340.

[2] Takeda H, Yoneyama F, Kawai S, et al. Bioethanol production from marine biomass alginate by metabolically engineered bacteria. Energy Environ Sci, 2011, 4(7): 2575–2581.

[3] Ravanal MC, Pezoa-Conte R, Von Schoultz S, et al. Comparison of different types of pretreatment and enzymatic saccharification offor the production of biofuel. Algal Res, 2016, 13: 141–147.

[4] Thomas F, Lundqvist LCE, Jam M, et al. Comparative characterization of two marine alginate lyases froms reveals distinct modes of action and exquisite adaptation to their natural substrate. J Biol Chem, 2013, 288(32): 23021–23037.

[5] Kim HS, Lee CG, Lee EY. Alginate lyase: structure, property, and application. Biotechnol Bioprocess Eng, 2011, 16(5): 843–851.

[6] Haug A, Larsen B. Quantitative determination of the uronic acid composition of alginates. Acta Chem Scand, 1962, 16: 1908–1918.

[7] T?mmeraas K, V?rum KM, Christensen BE, et al. Preparation and characterization ofoligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans. Carbohydr Res, 2001, 333(2): 137–144.

[8] Nagasawa N, Mitomo H, Yoshii F, et al. Radiation-induceddegradation of sodium alginate. Polym Degrad Stab,2000, 69(3): 279–285.

[9] Zhao JP, Yu DH, Zhu GJ, et al. Study on ultrasound method in the degradation reaction of sodium alginate. Chin J Spectrosc Lab, 2009, 26(2): 242–245 (in Chinese). 趙建平, 于大海, 朱光軍, 等. 超聲方法對(duì)于海藻酸鈉的降解反應(yīng)研究. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2009, 26(2): 242–245.

[10] Nakada HI, Sweeny PC. Alginc acid degradation by eliminases from abalone hepatopancreas. J Biol Chem, 1967, 242(5): 845–851.

[11] Romeo T, Preston III JF. Liquid-chromatographic analysis of the depolymerization of (1→4)-β-D-mannuronan by an extracellular alginate lyase from a marine bacterium. Carbohydr Res, 1986, 153(2): 181–193.

[12] Yamasaki Y, Yokose T, Nishikawa T, et al. Effects of alginate oligosaccharide mixtures on the growth and fatty acid composition of the green alga. J Biosci Bioeng, 2012, 113(1): 112–116.

[13] Tusi SK, Khalaj L, Ashabi G, et al. Alginate oligosaccharide protects against endoplasmic reticulum-and mitochondrial-mediated apoptotic cell death and oxidative stress. Biomaterials, 2011, 32(23): 5438–5458.

[14] Liu SY, Liu GY, Yi YT. Novel vanadyl complexes of alginate saccharides: synthesis, characterization, and biological activities. Carbohydr Polym, 2015, 121: 86–91.

[15] Xu X, Iwamoto Y, Kitamura Y, et al. Root growth-promoting activity of unsaturated oligomeric uronates from alginate on carrot and rice plants. Biosci Biotechnol Biochem, 2003, 67(9): 2022–2025.

[16] Zhu BW, Yin H. Alginate lyase: Review of major sources and classification, properties, structure-function analysis and applications. Bioengineered, 2015, 6(3): 125–131.

[17] Falkeborg M, Cheong LZ, Gianfico C, et al. Alginate oligosaccharides: enzymatic preparation and antioxidant property evaluation. Food Chem, 2014, 164: 185–194.

[18] Wargacki AJ, Leonard E, Win MN, et al. An engineered microbial platform for direct biofuel production from brown macroalgae. Science, 2012, 335(6066): 308–313.

[19] Enquist-Newman M, Faust AME, Bravo DD, et al. Efficient ethanol production from brown macroalgae sugars by a synthetic yeast platform. Nature, 2014, 505(7482): 239–243.

[20] Xu QQ. The research on alginate lyase genes inATCC 17749[D]. Shanghai: East China University of Science and Technology, 2012 (in Chinese). 胥晴晴. 解藻酸弧菌ATCC 17749株海藻酸裂解酶基因的相關(guān)研究[D]. 上海: 華東理工大學(xué), 2012.

[21] Hurwitz J, Weissbach A. The formation of 2-keto-3-deoxyheptonic acid in extracts ofB. II. Enzymic studies. J BiolChem, 1959, 234(4): 705–709.

[22] Zhu BW, Tan HD, Qin YQ, et al. Characterization of a new endo-type alginate lyase fromsp. W13. Int J Biol Macromol,2015, 75: 330–337.

[23] Li SY, Wang LN, Hao JH, et al. Purification and characterization of a new alginate lyase from marine bacteriumsp. SY08. Mar Drugs, 2017, 15(1): 1–12.

[24] Sawabe T, Ohtsuka M, Ezura Y. Novel alginate lyases from marine bacteriumsp. strain H-4. Carbohydr Res, 1997, 304(1): 69–76.

[25] Nelson N. A photometric adaptation of the somogyi method for the determination of glucose. J Biol Chem, 1944, 153: 375–380.

[26] Stevens RA, Levin RE. Purification and characteristics of an alginase from. Appl Environ Microbiol, 1977, 33(5): 1156–1161.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Cloning and expression of alginate lyase genes fromand characterization of the alginate lyase

Jie Gao, Yimin Li, Cong Du, Xuze Pei, Huimin Lu, Xiaoyang Zhao, and Wenjie Yuan

School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China

With the discovery of the significant medicinal value of alginate oligosaccharides and bioethanol produced by microalgae, alginate lyase has been the focus of research in all fields. Five alginate lyase genes in cluster fromwere cloned and expressed in. SDS-PAGE and enzyme activity showed that four of the five genes have the activity to degrade alginate. Optimization of the induction conditions, protein purification and enzyme properties of rAlgV3 with the highest enzyme activity were studied. The results showed that the enzyme activity of recombinant enzyme rAlgV3 increased from 2.34×104U/L to 1.68×105U/L, which was 7.3 times higher than before. The optimal reaction temperature was 40 °C, and the enzyme was relatively stable between 4 °C and 20 °C. The enzyme had a higher activity between pH 6.5 and 9.0, with the optimum pH 8.0. It showed a wide range of pH that the alginate lyase can exist stably between pH 4.5 and 9.5. Appropriate concentrations of NaCl and Fe2+, Fe3+ions promoted enzyme activity. SDS and Cu2+ions inhibited the enzyme activity. The enzyme degraded Poly-M fragments and Poly-G fragments, with a wide range of substrate properties. The degraded product of sodium alginate of rAlgV3 analyzed by ESI-MS mainly was oligosaccharides with a polymerization degree of 2 to 3, which means that rAlgV3 was an endo-type alginate lyase. This enzyme has the potential in the development of third-generation bioethanol and the production of alginate oligosaccharides.

alginate lyase,, clone and expression, enzymatic properties, fuel ethanol

January 16, 2018;

April 2, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 51561145014).

Wenjie Yuan. Tel: +86-411-84706150; E-mail: ywj@dlut.edu.cn

10.13345/j.cjb.180027

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 51561145014 ) 資助。