李 宇

(泰興市人民醫(yī)院 腫瘤科,江蘇 泰興225400)

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都居第一位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康。在肺癌中,約3/4患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，Ⅰ期是其重要治療階段，治療以手術(shù)為主，但根治手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率仍達(dá)到30%-40%[1]，所以研發(fā)新的診療方法對(duì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤、實(shí)現(xiàn)有效治療，并最終保證患者的長期生存十分重要。

哺乳動(dòng)物來帕霉素靶蛋白(mTOR)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上重要的控制因子，在細(xì)胞的生長和增殖的各個(gè)重要環(huán)節(jié)中都有mTOR的參與。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR過度活化與惡性腫瘤相關(guān)，尤其磷酸化的mTOR(p-mTOR)是mTOR信號(hào)通路被激活的重要生物學(xué)標(biāo)志[2-6]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)被作為自噬特異性標(biāo)記分子，用來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬活動(dòng)，近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬減少也與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其具體發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。本研究借助免疫組化法檢測(cè)mTOR和LC3在Ⅰ期NSCLC組織中的蛋白表達(dá)量，來探究二者與患者長期生存率的相關(guān)性如下。

1 材料與方法

1.1一般資料篩選2009年9月到2015年3月我院胸外科手術(shù)治療切取且組織病理檢查顯示為Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌病理組織標(biāo)本45例，術(shù)前均未經(jīng)化療和放療，病歷資料完整并保持長期隨訪，其中男性37例，女性8例，平均年齡62.59±8.15歲。并以腫瘤同側(cè)離腫瘤3-5 cm處的肺組織為對(duì)照組。術(shù)后隨訪中位時(shí)間為89(3-115)個(gè)月，研究已通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法p-mTOR 、LC3 一抗、二抗(武漢金開瑞生物工程有限公司購得)。選取合適的組織蠟塊作厚度3.5 μm-4.0 μm切片，入60-65℃烤箱過夜。切片經(jīng)脫蠟處理后放入梯度乙醇溶液脫水，隨后浸入蒸餾水中。用檸檬酸鈉溶液液煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，加入3%孵育10 min，再用PBS洗滌。實(shí)驗(yàn)中的“滴加封閉”用正常山羊血清封閉，并室溫孵育30 min，隨后加入一抗(p-mTOR 、LC3抗體)，并在4℃下過夜后，PBS洗滌3次。隨后加入生物素化二抗室溫下孵育30 min，PBS洗滌3次。加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育后，DAB法顯色。空白對(duì)照用PBS替代一抗。顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3結(jié)果判定切片由另外兩名研究員各自單獨(dú)讀片，遵守盲法原則給出觀察結(jié)果。高倍鏡下(×400)隨機(jī)觀察5個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞的染色狀況，結(jié)果判定參照許浩然等的方法[12]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行處理，p-mTOR和LC3蛋白表達(dá)陽性率及5年生存率比較用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1mTOR蛋白在兩組中的表達(dá)情況

采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)p-mTOR蛋白的表達(dá)狀況，結(jié)果如表1所示，p-mTOR蛋白在Ⅰ期NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá)不同，在腫瘤組織中的陽性率為68.39%(31/45)，而癌旁組織中的陽性率僅有17.78%(8/45)，Ⅰ期NSCLC組織中p-mTOR的表達(dá)水平明顯比癌旁組織升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.94，P<0.05)。

表1 兩組中p-mTOR蛋白的表達(dá)情況

2.2LC3蛋白在兩組中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果如表2所示，LC3在Ⅰ期NSCLC組織中的表達(dá)較低，為44.44%(20/45)；在癌旁組織中的表達(dá)較高，為86.67%(39/45)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.76，P<0.05)。

表2 兩組中LC3蛋白的表達(dá)情況

2.3預(yù)后5年存活率分析

如表3所示， p-mTOR表達(dá)量不同Ⅰ期NSCLC患者的5年存活率也不同，陽性者5年生存率為45.16%(14/31)，陰性者5年生存率為92.86%(13/14)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ⅠLC3表達(dá)量的變化影響Ⅰ期NSCLC患者的5年生存率，陽性者5年存活率66.67%(26/39)，陰性者16.67%(1/6)，LC3蛋白表達(dá)高者5年存活率相對(duì)較高，但二者差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。

表3 肺癌患者兩種蛋白不同表達(dá)狀態(tài)下的5年生存狀態(tài)

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是世界上和中國死亡率第一的惡性疾病。在我國肺癌的死亡率高達(dá)30.83/10萬，且正在逐年上升。非小細(xì)胞肺癌是肺癌中比例最大的，占到85%肺癌的85%左右。目前對(duì)于NSCLC的主要治療手段為手術(shù)治療[1]，即使Ⅰ期NSCLC手術(shù)后仍有大約有40%的患者因?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而死亡，NSCLC患者五年存活率僅左右15%[1]。因此，探索肺癌的生物分子標(biāo)記物對(duì)于肺癌的早期診斷和預(yù)測(cè)Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后狀況，指導(dǎo)Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌臨床治療十分重要。

mTOR是各種細(xì)胞信號(hào)通路的重要成員之一，對(duì)于細(xì)胞生發(fā)、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞遷移等都發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，是核糖體合成、細(xì)胞程序性死亡、蛋白質(zhì)翻譯、基因轉(zhuǎn)錄起始及調(diào)控等重要細(xì)胞功能的中心調(diào)控因子。研究顯示多種惡性腫瘤的發(fā)生均與mTOR信號(hào)通路的異?；罨嘘P(guān)，、乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均可見到mTOR相關(guān)傳導(dǎo)通路的過度活化[2-5]。mTOR的磷酸化的mTOR(p-mTOR)向細(xì)胞傳導(dǎo)生存信號(hào)，致使細(xì)胞凋亡受到抑制，細(xì)胞生存延續(xù)。因此通過檢測(cè)p-mTOR蛋白的高低來反映mTOR通路的活化情況。研究顯示在多數(shù)惡性腫瘤中p-mTOR較正常組織表達(dá)顯著增加， p-mTOR異常增高促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤的TNM分期呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性[6]。本研究借助免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期NSCLC組織中p-mTOR表達(dá)比癌旁組織顯著增高，而p-mTOR蛋白陽性率與患者的5年生存率相關(guān)，p-mTOR陽性者長期生存時(shí)間相對(duì)縮短，所以p-mTOR蛋白表達(dá)增加是影響Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后長期生存的危險(xiǎn)因素，可以通過檢測(cè)p-mTOR蛋白表達(dá)量預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后狀態(tài)。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3是在高等動(dòng)物發(fā)現(xiàn)的首種自噬體膜蛋白，是檢測(cè)細(xì)胞自噬活動(dòng)的重要分子標(biāo)記。自噬活動(dòng)的異常可能是腫瘤的生發(fā)的重要機(jī)制。在自噬過程中，首先Ⅰ型LC3發(fā)生泛素化轉(zhuǎn)變?yōu)棰蛐蚅C3并定位在自噬前體膜上， 就此存在于自噬體上，并隨自噬活性強(qiáng)弱而變化。因此可以通過檢測(cè)其含量了解自噬水平的高低[6]。此次研究實(shí)驗(yàn)顯示Ⅰ期NSCLC組織中LC3的表達(dá)水平明顯較癌旁組織降低，可知NSCLC組織的自噬活性降低。在Ⅰ期NSCLC患者中LC3陰性者相較陽性者長期存活時(shí)間縮短，可能是LC3表達(dá)降低因而自噬能力降低推動(dòng)了肺癌進(jìn)展和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者長期存活率降低。但在本研究中LC3陰性和陽性患者5年生存率的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)，加大樣本量可能可以提高差異的顯著性，所以進(jìn)行大樣本的檢測(cè)對(duì)于明確自噬在肺癌預(yù)后生存狀況中的作用有重大意義。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)顯示，mTOR在Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，患者mTOR蛋白陽性者較陰性者5年生存率低；在腫瘤組織中LC3表達(dá)下調(diào)，而LC3蛋白陽性者較陰性者5年存活率高。所以mTOR蛋白可能是Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，而LC3蛋白可能是保護(hù)因素。但此次研究樣本量較少影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，mTOR蛋白和LC3蛋白與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌長期預(yù)后的關(guān)系需要大樣本量的研究支持。

作者簡介：李宇，男，44歲，河北省人，博士，副主任醫(yī)師，研究方向是腫瘤的綜合治療。