董家書 韋美德 周格琛 鄧開鳳 戴盛明

三陰性乳腺癌（triple?negative breast cancer，TNBC）約占所有乳腺癌的10%～20%［1］，因其侵襲力強，且缺乏有效的治療靶點，而成為預后極差的惡性腫瘤。抑癌基因的甲基化改變是三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件。文獻報道，PPAR?γ基因可通過調(diào)節(jié)Wnt信號傳導通路的表達抑制乳腺癌細胞的轉移［2］。PPAR?γ是一種由配體激活的核轉錄因子，參與炎癥信號通路如NF?KB、Ap?1、JAK?sTAT，抑制促炎介質的生成［3］。有研究認為細胞內(nèi)PPAR?γ的表達是調(diào)節(jié)性T細胞抗炎作用所必須的［4］。5?氮雜?2?脫氧胞嘧啶（5?aza?2'?deox?ycytidine，5?Aza?CdR）是DNA甲基轉移酶特異性抑制劑，通過與DNA甲基轉移酶共價鍵結合，抑制DNA甲基轉移酶I的甲基轉移活性，除去抑癌基因啟動子的甲基化，解除甲基化對抑癌基因的抑制，從而使抑癌基因再表達，發(fā)揮抑癌作用［5］。本研究擬選用不同濃度的 5?Aza?CdR 作用于乳腺癌MDA?MB?231細胞系，觀察該藥物對乳腺癌細胞PPAR?γ基因甲基化情況以及轉錄水平，以及對該細胞凋亡的影響，為探索乳腺癌化療藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

MDA?MB?231細胞購自中科院上海細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、無菌PBS、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；5?Aza?CdR購自日本sigma公司，經(jīng)無菌PBS溶解后分裝，-80℃保存；DNA抽提純化試劑盒QIAamp DNA Mini Kit（貨號51304），重亞硫酸氫鹽轉化試劑盒EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit（貨號 59824），均購自德國凱杰生物技術（上海）有限公司；總RNA提取試劑盒Mini BEST Universal RNA Extraction Kit（貨號9767），逆轉錄試劑盒Mir?X miRNA First?Strand Syn?thesis Kit（貨號 68313），PCR 試劑盒 PrimeScript?RT Master Mix（貨號 RR036），均購自日本 Takara公司；PCR引物由大連寶生物公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

MDA?MB?231細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含1%青霉素、鏈霉素），于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的MDA?MB?23l細胞種入35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜使細胞充分貼壁后，加入含5、10、15、20 μmol/L的5?Aza?CdR完全培養(yǎng)液處理細胞，對照組用不含5?Aza?CdR的普通完全培養(yǎng)液，并加入與藥物相同體積的PBS緩沖液，培養(yǎng)48 h后收獲細胞。

1.3 甲基特異性PCR（methylmion specific PCR，MSP）檢測PPAR?γ基因甲基化情況

QIAamp DNA Mini Kit提取 5?Aza?CdR 處理細胞48 h后基因組DNA，EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit進行重亞硫酸氫鹽修飾并回收DNA，利用甲基化以及非甲基化引物進行PCR擴增。PPAR?γ基因甲基化引物和非甲基化引物見表1。PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30 個循環(huán)；72℃延伸10 min，進行熔解曲線分析以確認產(chǎn)物的特異性，4℃維持至結束。

表1 引物序列Table 1 Details of primers

1.4 實時熒光定量PCR（real?time fluorescent quan?tive PCR，qPCR）檢測PPAR?γmRNA表達水平

Trizol法提取藥物處理48 h后細胞的總RNA，TAKARA逆轉錄試劑盒獲得cDNA。PPAR?γ基因以及β?actin引物見表1。PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃終延伸5 min，進行熔解曲線分析以確認產(chǎn)物的特異性，4℃維持至結束。

1.5 流式細胞儀檢測5?Aza?CdR對MDA?MB?231細胞凋亡的影響

取生長對數(shù)期MDA?MB?231細胞，胰酶消化后細胞計數(shù)；含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度至1×106個/mL接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，每組細胞3個復孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后更換培養(yǎng)液，實驗組加入含不同濃度 5?Aza?CdR（5、10、15、20 μmol/L）的RPMI1640培養(yǎng)液；對照組加同等體積的培養(yǎng)液，孵育48 h后胰酶消化收集細胞；凋亡試驗取1×106個細胞，冷 PBS（2～8℃）洗 2 次，用 500 μL 1×An?nexin V結合液重懸細胞，濃度為1×106cells/mL，向細胞懸液中加5 μL Annexin V?FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min；加入10 μL PI染色液后輕輕混勻，2～8℃避光條件下孵育5 min，立即用流式細胞儀檢測，實驗重復3次。

2 結果

2.1 MSP檢測PPAR?γ基因啟動子區(qū)域甲基化情況

5?Aza?CdR 藥物處理細胞后，PPAR?γ基因甲基化程度明顯降低，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 MDA?MB?231細胞PPAR?γmRNA表達情況

藥物作用48 h，RT?qPCR結果顯示，與對照組相比PPAR?γmRNA 表達增加（P＜0.01）；隨著實驗組藥物濃度的增加，PPAR?γmRNA表達略有增加，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 5?Aza?CdR 對 MDA?MB?231 細胞凋亡的影響

與空白對照組細胞相比，5、10、15、20 μmol/L 5?Aza?CdR處理組的細胞凋亡率分別為（14.1±2.3）%、（25.4±3.3）%、（32.7±2.8）%、（43.1±1.9）%，與對照組的（6.9±0.8）%相比，凋亡率增加（P＜0.05），藥物處理組間均有明顯差異（P＜0.05），見圖3。

圖1 5?Aza?CdR 對MDA?MB?231細胞PPAR?γ基因去甲基化的影響Figure 1 Effects of 5?Aza?CdR on PPAR?γdemethylation in MDA?MB?231 cells

圖2 5?Aza?CdR 對 MDA?MB?231細胞 PPAR?γmRNA表達的影響Figure 2 Effects of 5?Aza?CdR on PPAR?γmRNA expression in MDA?MB?231 cells

3 討論

乳腺癌是危害女性健康最常見的婦科腫瘤，而其中TNBC是惡性程度極高，預后極差的腫瘤，且對內(nèi)分泌治療不敏感［6］，至今仍然沒有具有針對性的治療方案。PPAR?γ是核受體基因超家族中的一員，在脂肪組織、結腸、脾臟及巨噬細胞中大量表達，并且通過配體依賴途徑影響相關基因轉錄的方式［7］，影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［8?9］。Abduljab?bar等［10］研究發(fā)現(xiàn)高表達的PPAR?γ與沒有接受激素治療的雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性腫瘤患者的生存期延長有關［10］。張洪斌等［11］對 40例乳腺浸潤性導管癌組織的檢測中亦發(fā)現(xiàn)，PPAR?γ表達高者，5年生存率平均為91%，弱陽性或陰性表達者，5年生存率平均為42%，差異有統(tǒng)計學意義。本課題組前期的研究結果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織PPAR?γ表達低于癌旁組織，且PPAR?γ在MDA?MB?231（ER?）細胞中的表達明顯低于MCF?7（ER+）乳腺癌細胞［12］。綜合以上結果，提示PPAR?γ低表達很有可能是ER陰性且5年生存率低的TNBC的重要因素。

圖3 不同濃度5?Aza?CdR作用MDA?MB?231細胞48 h后凋亡率的變化Figure 3 Changes of the apoptosis rate of MDA?MB?231 cells after treatment with different concentrations of 5?Aza?CdR for 48 h

DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的重要方式之一，抑癌基因甲基化導致基因轉錄抑制，引起細胞代謝紊亂，是腫瘤發(fā)生的重要機制之一［13］。本課題組的另一部分研究結果表明乳腺癌患者PPAR?γ基因啟動子甲基化程度顯著高于健康對照。而基因異常甲基化導致的基因沉默是可以逆轉的過程，應用甲基化酶抑制劑可以使基因發(fā)生去甲基化，恢復基因的表達［14］。許多研究已成功將 5?Aza?CdR應用于體外培養(yǎng)的乳腺癌、宮頸癌等細胞株中，逆轉E鈣粘蛋白（E?cadherin）、RAS相關結構域蛋白 2A基因（RAS associated domain family 2A，RASSF2A）和人Runt相關轉錄因子3（Runt related transcription factor 3，RUNX3）等多種抑癌基因啟動子的甲基化狀態(tài)，恢復其表達，抑制腫瘤的生長［15?17］。研究已證實，PPAR?γ低表達與該基因的啟動子甲基化增加有關［18］。因此，本研究選用去甲基化藥物 5?Aza?CdR 作用 MDA?MB?231 細胞。經(jīng)檢測，PPAR?γ甲基化水平明顯降低，提示 5?Aza?CdR能夠有效解除PPAR?γ基因甲基化。同時，RT?qPCR檢測結果也顯示，與對照組相比，藥物處理組PPAR?γ表達水平顯著增加，但不同藥物濃度間無顯著差異，提示PPAR?γ在低濃度（10 μmol/L）5?Aza?CdR處理時即可顯著表達升高；然MDA?MB?231細胞凋亡增加卻有劑量依賴性，提示PPAR?γ可能參與了誘導癌細胞凋亡的部分作用。在袁昱寧的研究中，作者利用5?Aza?CdR作用MDA?MB?231細胞后檢測促進凋亡的E?cadherin、Wnt抑制因子（Wnt inhibitory factor 1，WIF1）基因表達上調(diào)，且呈時間依賴性逐漸升高，而抑制凋亡的β?連環(huán)蛋白（β?catenin）的表達隨作用時間延長逐漸下降［15］；Long 等［19］的研究亦發(fā)現(xiàn) 5?Aza?CdR處理MDA?MB?231細胞后，特異AT序列結合蛋白 2（special AT?rich binding protein 2，SATB2）表達降低，miR?31表達升高，抑制了細胞的侵襲和轉移。綜合以上結果，提示5?Aza?CdR可有效提高抑癌基因的表達，從而抑制MDA?MB?231腫瘤細胞的生長。

綜上，本研究提示，5?Aza?CdR 可有效降低PPAR?γ甲基化的水平，使其在mRNA轉錄水平表達增加，促進MDA?MB?231細胞凋亡，為表觀遺傳學藥物5?Aza?CdR用于TNBC治療提供更多實驗和理論依據(jù)。