陳晴晴 李少英 冼嘉嘉 王燕超 黎青

不孕不育是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問題，不育占所有不孕不育病例的一半［1］。遺傳因素導(dǎo)致的精子畸形是導(dǎo)致男性不育的主要原因［2］。Tiepolo 等［3］發(fā)現(xiàn)無精子患者有Y染色體長臂缺失，推測Y染色體q臂上有“精子生成因子”。精子發(fā)生是由許多Y染色體特定基因調(diào)控的重要生殖過程，這些基因大多位于人類Y染色體長臂的一個(gè)特定區(qū)域，被稱為無精子癥因子（azoospermia factor，AZF）區(qū)域，AZF區(qū)域有很多與精子生成相關(guān)的關(guān)鍵基因位點(diǎn)，其微缺失與男性不育有關(guān)。1992年Vogt等［4］發(fā)現(xiàn)AZF上存在a、b、c區(qū)，由于Y染色體上有Y染色體性別決定區(qū)（sex?determining region of Y?chromosome，SRY）基因，有Y染色體微缺失的患者可以將微缺失基因傳遞給下一代男性。陳暖等［5］研究認(rèn)為Y染色體微缺失的基因檢測對明確男性不育患者的病因和選擇治療方案具有非常重要的意義。這類缺失可以采用多重聚合酶鏈反應(yīng)電泳法、探針檢測法、基因芯片檢測法或毛細(xì)管電泳檢測法等方法進(jìn)行檢測［6］。目前臨床實(shí)驗(yàn)室常用方法為多重聚合酶鏈反應(yīng)電泳法，但是該方法操作較為繁瑣且不能批量檢測。本研究通過對比聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）熒光探針法和多重聚合酶鏈反應(yīng)（multiplex poly?merase chain reaction，multiplex PCR）結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法，比較2種檢測方法的檢測率和吻合度，探討PCR熒光探針法檢測Y染色體微缺失在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

2016年6月至2017年6月到我院就診的208例不育男性患者，年齡23～46歲，平均年齡32.8歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organiza?tion，WHO）2010年第5版精液分析操作指南將208例患者分為正常精子癥組、無精子癥組和少精子癥組。用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法對208例不育患者的Y染色體無精子癥因子進(jìn)行檢測。

1.2 方法

1.2.1 抽提DNA

208例不育患者各采集5 mL外周血并進(jìn)行抗凝處理。采用 DNeasy?Blood&Tissue試劑盒（QIAGEN，德國）提取基因組DNA。

1.2.2 PCR熒光探針法

PCR熒光探針法采用透景生命科技股份有限公司的Y染色體微缺失檢測試劑盒。分為A反應(yīng)液和B反應(yīng)液。A反應(yīng)液檢測的位點(diǎn)是SRY、SY84、SY127和SY225，B反應(yīng)液檢測的位點(diǎn)是ZFX/ZFY、SY86、SY134和SY254。主要包括3個(gè)步驟：核酸提取、PCR試劑配制和PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件如下：50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。信號收集：在第三階段60°C時(shí)收集FAM/VIC/ROX/Cy5信號，并保存相關(guān)文件。PCR實(shí)驗(yàn)儀器為ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems?，美國）。檢測位點(diǎn)及對應(yīng)的AZF區(qū)域見表1。

表1 PCR熒光探針法檢測位點(diǎn)及對應(yīng)的AZF區(qū)域Table 1 Detection sites of PCR fluorescent probe and corresponding AZF areas

1.2.3 multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法

采用的是Promega的Y染色體微缺失檢測方法。對Y染色體的短DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過5個(gè)平行PCR擴(kuò)增檢測Y染色體的20個(gè)序列標(biāo)簽。PCR 擴(kuò)增條件如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min、57℃ 30 s，72℃ 1 min，37個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。檢測位點(diǎn)及對應(yīng)的AZF區(qū)域見表2。

表2 multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法檢測位點(diǎn)及對應(yīng)的AZF區(qū)域Table 2 Detection sites of multiplex PCR combined with agarose gel electrophoresis and corresponding AZF areas

2 結(jié)果

2.1 用PCR熒光探針法檢測結(jié)果

無精子癥組47例，檢出微缺失1例；少精子癥組61例，檢出微缺失1例；正常精子癥組未檢出缺失型（圖1，圖2，圖3）。

圖1 無精子癥組中1例PCR熒光探針法顯示AZFabc缺失Figure 1 A case of AZFabc deficiency was detected by PCR fluorescence probe in azoospermia group

2.2 用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法

無精子癥組47例，檢出微缺失1例；少精子癥組61例，檢出微缺失1例；正常精子癥組未檢出缺失型（圖4）。其中應(yīng)用PCR熒光探針法和multi?plex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法檢測出的微缺失來自于相同的病人。

3 討論

孫華賓等［7］分析了不育男性無精子因子基因檢測結(jié)果，認(rèn)為AZF區(qū)域微缺失是引起男性無精、少精子癥的重要原因之一，對原發(fā)無精、少精子癥患者在單精子注射（intracytoplasmic sperm injec?tion，ICSI）之前進(jìn)行Y染色體微缺失檢測。陳云等［8］在研究廈門地區(qū)男性無精子癥患者Y染色體微缺失情況中發(fā)現(xiàn)無精子癥患者AZF微缺失發(fā)生率約為10%，丑廣程等［9］在研究Y染色體微缺失及臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)無精子癥患者AZF微缺失發(fā)生率接近10%。在此次研究中無精子癥檢測率低于10%，原因可能是在納入無精子癥組的時(shí)候，沒有做精液分析項(xiàng)目檢測的不育患者沒有納入此次統(tǒng)計(jì)研究。在研究的過程中，有2例不育患者PCR熒光探針法檢測為SY127/SY134及SY255/SY254位點(diǎn)缺失，1例為SY84/SY86位點(diǎn)缺失，由于這3例沒有相應(yīng)的精液分析結(jié)果無法分組所以沒有納入此次研究。

圖2 少精子癥組1例PCR熒光探針法顯示AZFc缺失Figure 2 A case of AZFc deficiency was demonstrated by PCR fluorescence probe in oligospermia group

圖3 正常精子癥組1例PCR熒光探針法顯示未缺失型Figure 3 A case of normal spermatozoa showed no missing type by PCR fluorescence probe

圖4 multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法結(jié)果Figure 4 Results of multiplex PCR combined with agarose gel electrophoresis

multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法在臨床上已應(yīng)用多年，近年來熒光定量PCR技術(shù)也開始應(yīng)用于臨床。段晉燕等［10］研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在男性不育患者Y染色體微缺失檢查中的應(yīng)用，得出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可用于Y染色體微缺失的檢測，且對篩查不育癥患者具有臨床價(jià)值的結(jié)論，張媛媛等［11］研究利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF?PCR）篩查男性不育患者Y染色體微缺失，認(rèn)為多重QF?PCR技術(shù)，一個(gè)反應(yīng)即能檢測樣本的多個(gè)位點(diǎn)，并可提示性染色體是否存在異常，有助于男性不育患者盡早明確病因，也為后續(xù)的檢查和治療提供依據(jù)。2013年發(fā)布的關(guān)于Y染色體微缺失指南中提出了6個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列（short tan?dem repeat，STR）位點(diǎn)［12］。本研究中PCR熒光探針法對SY86等6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測，具體檢測缺失位點(diǎn)為multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法檢測AZF區(qū)域的20個(gè)位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示應(yīng)用PCR熒光探針法檢測208例不育患者，無精子癥組中1例是AZFabc缺失，少精子癥組中1例是AZFc缺失，其他未檢測到缺失，用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)無精子癥組中同一病例AZFabc缺失，少精子癥組中同一病例是AZFc缺失，2種檢測方法結(jié)果一致。崔瑾等［13］研究發(fā)現(xiàn)PCR熒光探針法檢測Y染色體微缺失結(jié)果與multi?plex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法檢測結(jié)果相同，且該法的檢測結(jié)果與臨床診斷相符，因此PCR熒光探針法適用于Y染色體微缺失的臨床實(shí)驗(yàn)室篩查。楊洋等［14］研究PCR熒光探針法檢測少精子癥和無精子癥患者認(rèn)為PCR熒光探針法在Y染色體微缺失檢測中穩(wěn)定快捷，結(jié)果可靠。

王健等［15］研究認(rèn)為多重?zé)晒釶CR方法操作方便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高且重復(fù)性好，在Y染色體微缺失檢測上有重要應(yīng)用價(jià)值，實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間和費(fèi)用明顯少于multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法，而且PCR熒光探針法可以基本排除男性不育患者Y染色體常見的微缺失，可作為臨床篩查男性不育患者的推薦方法，若PCR熒光探針法檢測有異常，可進(jìn)一步用multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測法檢測確認(rèn)。由于PCR熒光探針法檢測項(xiàng)目在本院開展時(shí)間不久，本研究納入病例有限，還未能充分認(rèn)識其與傳統(tǒng)檢測手段之間的優(yōu)勢，后期我們將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量以及多診斷中心合作，進(jìn)一步研究PCR熒光探針檢測法在臨床上對AZF缺失區(qū)域的檢出率及應(yīng)用價(jià)值。