何江耀 趙任龍 果海娜

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第4位常見(jiàn)的惡性腫瘤，僅2012年全球發(fā)生宮頸癌近53萬(wàn)例，年死亡數(shù)高達(dá)27萬(wàn)，其中85%宮頸癌發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家，且居于這些國(guó)家癌癥死因的首位［1］。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染已被證實(shí)是宮頸癌發(fā)生的首要始動(dòng)因素，其中99.7%的宮頸鱗狀細(xì)胞癌被發(fā)現(xiàn)與高危型人乳頭瘤病毒（high risk?human papilloma virus，HR?HPV）感染有關(guān)，而持續(xù)的HR?HPV感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）并進(jìn)一步引發(fā)宮頸癌病變的主要病因［2?4］。解脲支原體（ureaplasmaurealyticum，UU）為條件致病菌，可使宿主細(xì)胞膜及泌尿生殖道黏膜受損，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物合成及免疫功能［5］。UU感染使宮頸微環(huán)境產(chǎn)生不良變化可能是部分HR?HPV持續(xù)感染從而導(dǎo)致CIN發(fā)生的重要因素之一。本文通過(guò)對(duì)宮頸分泌物進(jìn)行HPV分型檢測(cè)以及UU?DNA檢測(cè)，聯(lián)合做薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查，分析探討生殖道HR?HPV合并UU感染與CIN發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

收集2014年8月至2017年6月間于婦科門(mén)診就診的女性患者和健康體檢者宮頸分泌物樣本，共1 159例，年齡18～72歲，平均年齡35.6歲，均未進(jìn)行過(guò)抗HPV及UU的治療，顯微鏡下觀察待測(cè)的宮頸分泌物樣本中含脫落細(xì)胞為合格的標(biāo)本，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，合格樣本方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序行檢測(cè)。

1.1.2 主要檢測(cè)儀器及試劑

Luminex?200TM多功能流式點(diǎn)陣儀（Luminex公司，美國(guó)）；CFX96 TouchTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BioRad公司，美國(guó)）；Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Stratagene公司，美國(guó)），德國(guó) Eppendorf公司5333 PCR儀；人乳頭瘤病毒核酸分型檢測(cè)試劑盒（流式熒光雜交法）（上海透景生命科技有限公司）；解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒（PCR?熒光探針?lè)ǎㄖ猩酱髮W(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 HR?HPV分型檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)按HPV分型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：將宮頸分泌物樣本振蕩，12 000 r/min離心5 min取沉淀，加入裂解液100℃煮沸10 min，取上清2 μL加入反應(yīng)管中于5333型PCR儀上行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物與微球上交聯(lián)的探針根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理進(jìn)行雜交，再加入熒光標(biāo)記物以標(biāo)記微球上的探針，最后在Luminex?200TM多功能流式點(diǎn)陣儀上檢測(cè)熒光信號(hào)并進(jìn)行判讀，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。人乳頭瘤病毒核酸分型檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)17種 HR?HPV亞型，分別是：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82。

1.2.2 UU核酸檢測(cè)

按解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)操作：將宮頸分泌物樣本振蕩，12 000 r/min離心5 min取沉淀，加入裂解液100℃煮沸10 min，取上清2 μL加入反應(yīng)管中，用CFX96 TouchTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀或Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)待測(cè)樣品并捕獲熒光信號(hào)，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參照說(shuō)明書(shū)判定檢測(cè)結(jié)果：如果增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且Ct值＜27，結(jié)果判定為陽(yáng)性，該樣品的UU DNA含量=樣品的Qty/20基因拷貝；如果增長(zhǎng)曲線不呈S型曲線或Ct值=30，判定為陰性，樣品的UU DNA 含量＜5.0×102基因拷貝；如果27≤Ct值＜30，則為實(shí)驗(yàn)灰度區(qū)，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，若重復(fù)增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且Ct值＜30，判為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性。每批檢測(cè)按試劑盒內(nèi)提供的陽(yáng)性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品作對(duì)照。

1.2.3 細(xì)胞病理學(xué)檢查

在1 159例受檢者中隨機(jī)選擇122例樣本采用離心沉降式薄層液基細(xì)胞制片法制片，95%乙醇固定，經(jīng)巴氏染色，封片，光鏡觀察。由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生進(jìn)行閱片并作出相應(yīng)診斷，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)宮頸細(xì)胞學(xué)Bethesda系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）（2001）修訂版內(nèi)容對(duì) CIN 進(jìn)行分級(jí)［6］，同時(shí)將病理診斷≥CINⅠ即視為發(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以百分率（%）表示，使用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HR?HPV亞型陽(yáng)性感染情況

受檢的1 159例女性?xún)?nèi)分泌物標(biāo)本中，17種HR?HPV陽(yáng)性感染者共243例，總陽(yáng)性感染率為20.97%（243/1 159），其中HPV52亞型感染率最高，陽(yáng)性感染率為 4.23%（49/1 159），其次為HPV16和 58亞型，陽(yáng)性感染率分別為3.88%（45/1 159）和2.76%（32/1 159）；單一高危亞型陽(yáng)性感染率為17.08%（198/1 159），多重高危亞型陽(yáng)性感染率為3.88%（45/1 159）。各亞型的陽(yáng)性感染情況見(jiàn)表1。

2.2 HR?HPV與UU合并感染情況

本次研究受檢者中UU總陽(yáng)性感染率為67.56%（783/1 159）。HR?HPV合并UU感染情況見(jiàn)表2，在783例UU陽(yáng)性患者中，HR?HPV陽(yáng)性188例，陽(yáng)性率為24.01%（188/783）；在UU檢測(cè)陰性的376例患者中，HR?HPV陽(yáng)性55例，陽(yáng)性率為14.63%（55/376），2組相比差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝13.50，P=0.000 2）（表 2）；不同 UU?DNA載量組的HR?HPV檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，UU≥103cop?ies/mL組 HR?HPV 陽(yáng)性率占 23.42%（182/777），明顯高于UU＜103copies/mL組陽(yáng)性率 15.97%（61/382），2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝8.59，P=0.003 4）。

2.3 HR?HPV亞型合并感染UU情況

HR?HPV亞型合并UU陽(yáng)性感染情況如下：HPV26亞型合并UU陽(yáng)性感染率達(dá)100%（1/1），但考慮其研究病例數(shù)過(guò)少，不具有統(tǒng)計(jì)意義；HPV16陽(yáng)性患者中UU陽(yáng)性感染率最高，為93.33%（42/45），其次為HPV39和HPV58，合并UU陽(yáng)性感染率分別為85.00%（17/20）和84.38%（27/32）；HPV16與其它HR?HPV亞型組合并UU陽(yáng)性感染率相比，HPV16陽(yáng)性組合并UU陽(yáng)性感染率顯著升高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.66，P=0.005 6）。

表1 HR?HPV各亞型的感染情況Table 1 The infection of HR?HPVsubtypes

表2 HR?HPV合并UU感染情況Table 2 The infection of HR?HPV combined with UU

表3 不同UU?DNA載量標(biāo)本的HR?HPV檢測(cè)結(jié)果Table 3 The infection of HR?HPV in different concentrations of UU?DNA

2.4 HR?HPV合并UU陽(yáng)性感染的CIN發(fā)生情況

1 159 例受檢者中隨機(jī)選擇122例行薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查。如表4所示，病理診斷為發(fā)生CIN者共23例，總CIN發(fā)生率為18.85%（23/122）。其中在HR?HPV合并UU陽(yáng)性感染的患者中，CIN發(fā)生率41.9%（13/31）最高，較其他單純感染及陰性對(duì)照組中的CIN發(fā)生率顯著升高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 HR?HPV合并UU感染CIN發(fā)生情況Table 4 The influence of HR?HPV/UU co?infection on cervical intraepithelial neoplasia

3 討論

HPV是一種雙鏈環(huán)狀的小分子DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)的與人類(lèi)生殖道相關(guān)的亞型有40余種，其中約有20種被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［7］。根據(jù)致癌風(fēng)險(xiǎn)的高低大致可分為HPV高危型人乳頭瘤病毒（HR?HPV）和低危型人乳頭瘤病毒（low?risk human papilloma virus，LR?HRV）其中 LR?HPV可引起宮頸良性病變，而HR?HPV引發(fā)宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變和宮頸癌［8］。HPV分布具有區(qū)域特性，不同地區(qū)的HPV高發(fā)型存在差異。HPV16型致癌的風(fēng)險(xiǎn)最高，全球約55%～60%的宮頸癌是由HPV16引起的，而HPV52型和58型在亞洲的檢出率較高［9］。長(zhǎng)期的流行病學(xué)及循證醫(yī)學(xué)研究已證實(shí)，HR?HPV感染是宮頸癌的主要原因，可以導(dǎo)致宮頸癌前病變和浸潤(rùn)性宮頸癌發(fā)生，且有90%以上的宮頸癌中存在高危型HPV感染［10］。然而在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，HPV僅能誘導(dǎo)人正常上皮細(xì)胞的永生化而不能使之充分向惡性轉(zhuǎn)化［11］。因此，HR?HPV 的持續(xù)感染在CIN病變中起重要作用，且與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)［12?14］。

解脲支原體是寄生于女性泌尿生殖道內(nèi)較為常見(jiàn)的一種致病性病原菌，可引起女性尿道炎、盆腔炎等疾病［15］。相關(guān)研究報(bào)道，UU感染可能與CIN的發(fā)生有關(guān)，可協(xié)同促進(jìn)宮頸癌前病變或?qū)m頸癌的發(fā)生，在HR?HPV導(dǎo)致CIN或?qū)m頸癌中發(fā)揮重要輔助作用［16］。通過(guò)檢測(cè)分析HR?HPV與UU感染情況及與CIN發(fā)生的相關(guān)性，有助于探討其引起宮頸癌變的可能作用機(jī)制，為宮頸癌的篩查及早診早治提供理論依據(jù)及研究思路。

本研究受檢的1 159例樣本中，HR?HPV陽(yáng)性率為20.97%（243/1 159），要低于陜西省榆林地區(qū)［17］HR?HPV的感染率25.85%（190/735），高于無(wú)錫地區(qū)［18］HR?HPV 的感染率 10.53%（1 288/12 226），而與東莞邵錦歡等［19］報(bào)道的 21.89%（4 466/20 400）相近，這也充分說(shuō)明東莞地區(qū)的HR?HPV感染率相對(duì)處于一個(gè)中間水平，很可能與東莞地區(qū)人員結(jié)構(gòu)復(fù)雜，來(lái)自全國(guó)各地有關(guān)。本研究中UU感染率為67.5%（783/1 159），這與李國(guó)立等［20］報(bào)道的結(jié)果相接近，而較王剛等［21］報(bào)道的UU培養(yǎng)陽(yáng)性感染率49.66%（3 390/6 826）要高，可能與其UU的核酸檢測(cè)法比培養(yǎng)檢測(cè)敏感性更高有關(guān)。Lukic等［22］研究表明，UU感染可增加HR?HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)，可能作為HR?HPV感染的輔助因子，在HR?HPV侵入宮頸上皮細(xì)胞及HR?HPV持續(xù)感染過(guò)程中起重要作用。本研究結(jié)果也表明，在UU陽(yáng)性感染者中HR?HPV的陽(yáng)性率（24.01%，188/783）顯著高于UU陰性患者中HR?HPV陽(yáng)性率（14.63%，55/376），且隨著UU?DNA載量的增加，HR?HPV感染風(fēng)險(xiǎn)增加。UU的毒力因子主要由尿素酶、免疫球蛋白A（IgA）蛋白酶、磷脂酶A、磷脂酶C以及多帶抗原基因等5種蛋白與產(chǎn)生過(guò)氧化物的酶系統(tǒng)構(gòu)成，其吸附于機(jī)體后可通過(guò)損傷宿主細(xì)胞膜及泌尿生殖道黏膜屏障，繼而影響細(xì)胞的生物合成及免疫系統(tǒng)，增加機(jī)體對(duì)于HPV的易感性，同時(shí)也增加了HPV感染的暴露機(jī)會(huì)［23］。此外本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高致病性的HPV16亞型患者中UU陽(yáng)性率最高，要顯著高于其他各亞型中合并UU的陽(yáng)性感染率（P＜0.01），提示UU感染可能更易增加HPV16亞型的感染風(fēng)險(xiǎn)。

針對(duì)本研究隨機(jī)選取的122例樣本進(jìn)行薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查，細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果顯示，在被檢測(cè)為UU陽(yáng)性組中的CIN發(fā)生率（26.25%，21/80）明顯高于UU陰性組（4.76%，2/42），此結(jié)果與以往的報(bào)道相吻合，UU感染與宮頸病變的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)［16，22］；同時(shí)相較于其他單純感染及陰性對(duì)照組CIN發(fā)生情況而言，在HR?HPV合并UU陽(yáng)性感染的患者中CIN發(fā)生率顯著升高，表明HR?HPV合并UU陽(yáng)性感染可提高患者CIN的發(fā)生，與CIN病變密切相關(guān)。

綜上所述，UU感染可增加HR?HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)，且兩者協(xié)同促進(jìn)CIN的發(fā)生，但HR?HPV與UU是怎樣一個(gè)協(xié)同機(jī)制導(dǎo)致病變發(fā)生，目前還不明確，有待更進(jìn)一步深入研究。但在臨床防治CIN時(shí)需重視HR?HPV與UU合并感染的情況。