鄧亦麒，何興金，余 巖

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064)

葉是植物的重要營養(yǎng)器官，對植物的生命活動起到重要的作用[1]。在植物生態(tài)學(xué)中，葉片的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征能更好地闡釋物種的進(jìn)化與適應(yīng)相應(yīng)環(huán)境[2-3]，并且在古生物學(xué)中也常用“葉緣分析法” (Leaf margin analysis)[4]和“葉面積分析法” (leaf area analysis)[5]等方法來推測古環(huán)境狀態(tài)。植物在進(jìn)化的過程中，葉片內(nèi)在生理及外在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的特征會減少環(huán)境帶來的不利影響[6-7]。例如，苜蓿、天竺葵等植物為更好地適應(yīng)弱光環(huán)境，其葉片結(jié)構(gòu)會呈現(xiàn)出大且薄，質(zhì)地柔軟，具有較長的葉柄等增強(qiáng)光合作用效率的特征[8]。處在不同極端環(huán)境中的植物，其葉片也存在特殊的適應(yīng)性特征。如仙人掌屬植物為適應(yīng)干旱缺水的環(huán)境，其葉片變成了針刺狀減少蒸騰作用，莖變成肉質(zhì)掌狀，替代葉片光合作用[9]。鹽堿植物為適應(yīng)鹽堿地環(huán)境，通常葉片不發(fā)達(dá)，減少蒸騰作用并將植物多余的鹽分通過葉片排出[10-11]。

苞片(bract)是花序結(jié)構(gòu)中的變態(tài)葉，廣義上，任何和花序有關(guān)的葉片均可稱為苞片[12]。在植物分類學(xué)中，苞片是重要的分類依據(jù)，部分古植物化石的鑒定也要依賴于苞片的存在[13]。在不同的類群中，苞片或大或小，形態(tài)和顏色各異，其形態(tài)與普通葉片、花萼和花被片通常有所不同 。有些苞片具有鮮艷的色彩和突出的形態(tài)，能夠與花瓣協(xié)同(甚至代替花瓣)實(shí)現(xiàn)吸引傳粉者，防御天敵等功能[14-16]，這類苞片統(tǒng)稱為花瓣?duì)畎?(petaloid bracts)。

早期對于花瓣?duì)畎难芯恐饕性诓糠制贩N的園藝栽培和變種培育[17-18]。近年來，隨著各種生物學(xué)手段尤其是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，對于苞片結(jié)構(gòu)和功能的研究愈發(fā)深入和廣泛，延伸到包括發(fā)育遺傳學(xué) (developmental genetics)[19-20]、傳粉生態(tài)學(xué) (pollination ecology)[21]、系統(tǒng)發(fā)育和演化生物學(xué) (phylogeny and evolutionary biology)[22]等各個方面。

花瓣?duì)畎瑥V泛存在于被子植物的不同世系中，例如天南星科 (Araceae)、蓼科 (Polygonaceae)、茜草科 (Rubiaceae)、山茱萸科 (Cornaceae)、芭蕉科 (Musaceae)、紫茉莉科 (Nyctaginaceae)、三白草科 (Saururaceae)、莧科 (Amaranthaceae)和唇形科 (Lamiaceae) 等。其中紫茉莉科葉子花屬(BougainvilleaL. )植物因擁有大而美麗的花瓣?duì)畎鴱V泛栽培。其苞片色彩鮮艷，容易被誤認(rèn)為花瓣(圖1)，“葉子花”正是由此而來，因此是研究花瓣?duì)畎l(fā)育的理想類群。中國引入栽培的葉子花屬植物主要有2種：光葉葉子花(B.glabraChoisy)和葉子花(B.spectabilisWilld.)，其中葉子花的栽培極為普遍，常作為綠籬與花棚的觀賞花木。前人對于葉子花屬的研究主要集中在其繁殖技術(shù)、花期調(diào)控、花色調(diào)控、化學(xué)成分和遺傳多樣性等方面。然而，尚未有研究對其花瓣?duì)畎某梢蚣鞍腿~片在基因?qū)用娴膮^(qū)別進(jìn)行深入探討。

轉(zhuǎn)錄組是某個物種或者特定細(xì)胞類型產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合，隨著測序手段的進(jìn)步和費(fèi)用的降低，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。目前，基于Illumina高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù) (RNA-Seq) 能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進(jìn)行檢測，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時，還能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并精確識別可變剪切位點(diǎn)以及cSNP、UTR區(qū)域，提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息。本研究選取了葉子花(B.spectabilisWilld.)盛花期的葉片和苞片為研究材料，對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的手段對其葉片和苞片的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO分析、差異化表達(dá)分析、同源基因分析等。本研究首次分析了葉子花(B.spectabilisWilld.)成熟葉片和苞片的轉(zhuǎn)錄組特征，為未來精細(xì)研究花瓣?duì)畎幕蛘{(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時也為具有類似性狀的類群的形態(tài)學(xué)演化提供了參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和預(yù)處理

選取葉子花(B.spectabilisWilld.)苞片與葉片作為試驗(yàn)材料(圖1)。取花期植株的苞片和葉片各1份(未設(shè)置生物學(xué)重復(fù))，每份2～3 g，提取樣品總RNA并使用DNase I消化DNA后，用帶有Oligo(Dt) 的磁珠富集真核生物mRNA 。適溫條件下，加入打斷試劑，在Thermomixer中將mRNA打斷成短片段，以打斷后的 mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、cDNA的3′末端加上堿基A并連接接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后，使用測序儀進(jìn)行測序。

測序得到的raw reads里面可能含有接頭、N大于5%的序列、測序質(zhì)量很低的序列等。這些reads會影響組裝和后續(xù)分析，對測序reads進(jìn)行過濾，得到clean reads，數(shù)據(jù)處理的步驟如下：1)去除接頭污染的reads(reads中接頭污染的堿基數(shù)大于5 bp。對于雙端測序，若一端受到接頭污染，則去掉兩端的reads)；2)去除低質(zhì)量的reads(reads中質(zhì)量值Q <20的堿基占reads長度的20%以上，對于雙端測序，若一端為低質(zhì)量reads，則會去掉兩端reads)；3)去除含N比例大于5%的reads(對于雙端測序，若一端含N比例大于5%，則會去掉兩端reads)。

圖1 葉子花形態(tài)及苞片和葉片解剖圖Fig.1 The morphologies of leaf and bract in B. spectabilis

測序數(shù)據(jù)經(jīng)去除接頭、引物以及低質(zhì)量的reads共得到54.48 M(54 384 608)條長度為150 bp的成對的clean reads，其中苞片的clean reads有26.81 M(26807892)對，葉片的clean reads有27.58 M(27576716)對。

1.2 方 法

1.2.1轉(zhuǎn)錄組的功能注釋由于葉子花沒有參考基因組，因此利用Trinity[23]軟件對clean reads進(jìn)行從頭拼接，設(shè)置轉(zhuǎn)錄本中每個gene類中最長的isoform作為Unigene。通過Blast[24]同源比對，將葉子花轉(zhuǎn)錄組的Unigenes比對到nr (ron-redundant)、COG (Cluster of orthologous group of protein)[25]以及Swiss-Port蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[26]，比對參數(shù)evalue為1e-5，最大匹配序列為1條，最大的局域比對數(shù)為1。利用Hmmscan(http:// hmmer. org/)將葉子花的Unigenes與Pfam進(jìn)行比對。通過Transdecoder (https://github.com/TransDecoder/TransDecoder )獲得轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)以及對應(yīng)的的蛋白質(zhì)序列，將獲得的蛋白質(zhì)序列與Swiss-Prot進(jìn)行同源比。Trinotate (http://trinotate.github.io/)利用編碼蛋白比對的結(jié)果結(jié)合之前轉(zhuǎn)錄本與nr蛋白庫比對上的結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本基因本體(GO)[27]注釋。通過與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到的結(jié)果按照COG數(shù)據(jù)庫的類別對Unigenes進(jìn)行分類。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析利用bowtie2[28]將葉子花苞片和葉片的clean reads比對到葉子花轉(zhuǎn)錄組的Unigenes，利用RSEM[29]計算苞片和葉片2個組織的表達(dá)量(比對上Unigenes的有效count數(shù)，F(xiàn)PKM)，edgeR[30]利用得到的苞片與葉片比對到相對應(yīng)Unigenes的有效count數(shù)矩陣進(jìn)行差異分析。由于假陽性的存在，設(shè)定表達(dá)量差異倍數(shù)為4以及多重檢驗(yàn)(FDR)的P=0.001的Unigenes作為差異表達(dá)基因。最后利用goseq[31]對得到的RNA-seq數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。將不同器官富集的GO基因分別用KOBAS軟件[32]對比到擬南芥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG富集分析。

1.2.3實(shí)時熒光定量qPCR驗(yàn)證使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)試劑盒分別對葉子花苞片和葉片提取總RNA，并對每個樣品取等量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。挑選了5個較為核心的在苞片中高表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證：DTX35、U85A3、BPE、DODA、AA5GT。使用Primer-BLAST設(shè)計特異性引物，選取TIP4基因作為內(nèi)參。實(shí)時熒光定量qPCR使用UltraSYBR Mixture(Cwbio)試劑盒進(jìn)行，其反應(yīng)體系及操作步驟均參考該試劑盒進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組功能注釋

根據(jù)獲得54.48 M葉子花RNA-seq數(shù)據(jù)，利用Trinity軟件拼接得到轉(zhuǎn)錄本isoform共167 467條，總共堿基數(shù)為177 962 558 bp，平均長度為1 062.67 bp，N50為1 407 bp。獲得55 872條Unigenes，總共堿基數(shù)為56 083 839 bp，平均長度為1 003.79 bp，N50為1 402 bp。經(jīng)過Blast同源比對，30 874條Unigenes(55.26%)能顯著地與nr庫比對上。對能比對的物種進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，葉子花的Unigenes有44.8%能與甜菜比對上，菠菜也有20.9%的序列能與葉子花比對上(圖2)。24 168條Unigenes(43.26%)能顯著地與Swiss-Port比對上。利用hmmerscan與已知的Pfam庫對比，發(fā)現(xiàn)總共有20 107條Unigenes(35.99%)能在已知Pfam庫中匹配到同源蛋白序列。

基因本體是一個在生物信息學(xué)領(lǐng)域廣泛使用的本體，它是一個有向無環(huán)(DAG)型的本體。GO主要涉及到基因和基因產(chǎn)物特性的術(shù)語描繪，根據(jù)特點(diǎn)劃分為三大類，即細(xì)胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物進(jìn)程(biological process, BP)。在這三大類型下又有不同的亞類，各類之間相互關(guān)聯(lián) ，因此通過GO注釋可以對基因進(jìn)行分類注釋，并了解該基因的生物學(xué)意義。本研究利用Trinotate軟件以及Swiss-Prot庫同源比對的結(jié)果進(jìn)行GO注釋，發(fā)現(xiàn)總共有12 631條Unigenes(22.61%)能被注釋。細(xì)胞組分共被注釋到20 425次，其亞類最高的分別是細(xì)胞(19 184)、器官(15 120)、膜系統(tǒng)(8 841)和大分子復(fù)合物(4 116)。分子功能總共有21 187次被注釋到，其亞類分布最高的分別是結(jié)合(15 976)和催化活性(15 976)。生物進(jìn)程的總共有20 668次被注釋上(圖3)，其亞類分布最高的分別是細(xì)胞進(jìn)程(16 934)、代謝進(jìn)程(15 231)和組織進(jìn)程(12 089)。

COG數(shù)據(jù)庫是基于細(xì)菌、藻類和真核生物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系得到的。根據(jù)蛋白質(zhì)序列的相似性，將Unigenes序列按照已整理的分類進(jìn)行注釋(圖4)。對葉子花轉(zhuǎn)錄組的Unigene進(jìn)行COG功能注釋，可以分成4個大類、24個功能亞類。細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)、信息存儲和處理、代謝和缺乏注解分別有3 538條、3 893條、3 982條和3 002條。在細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)類中，主要集中被注釋到O(翻譯后修飾、蛋白反轉(zhuǎn)、分子伴侶)和T(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制)這兩個亞類，分別占該類的38.08%(1 241條)和34.43%(1 112條)。在信息存儲和處理類中，有1 416條注釋到復(fù)制、重組和修復(fù)，有1 271條注釋到轉(zhuǎn)錄，有949條注釋到翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)、生物合成亞類。在代謝類中，有826條注釋到碳水化合物運(yùn)輸與代謝，有726條注釋到氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝。其中能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、無機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、脂類轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、次生代謝產(chǎn)物的合成，轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝分別有600條、475條、466條和422條。在缺乏注釋類中，有2 551條注釋到一般功能預(yù)測，剩下的Unigenes被注釋到未知功能。

2.2 轉(zhuǎn)錄組差異基因分析

根據(jù)拼接得到的葉子花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別對葉子花同一時期的苞片和葉片進(jìn)行定量分析。利用RSEM軟件，通過將2個器官的clean reads比對到拼接好的轉(zhuǎn)錄組Unigenes，并計算出轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別在不同組織的表達(dá)量。通過edgeR軟件，發(fā)現(xiàn)在同一時期苞片和葉片的差異表達(dá)基因(DEGs)總共有456個，在苞片中高表達(dá)的有166個基因，在葉片高表達(dá)的有290個基因。通過goseq軟件，分別對差異表達(dá)基因作GO富集，根據(jù)GO術(shù)語對其進(jìn)行聚類。葉片中高表達(dá)的差異表達(dá)基因共有240個GO術(shù)語，其中細(xì)胞組成(CC)41個，生物進(jìn)程(BP)124個，分子功能(MF)75個。其中葉綠體類囊體膜(GO:0009535)在整個葉片高表達(dá)基因中最為顯著(3.13e-43)，并且有許多都參與光合作用。還發(fā)現(xiàn)葉片中有抗寒相關(guān)(GO:0009409)的基因本體；苞片中高表達(dá)的差異基因共有115個GO術(shù)語，細(xì)胞組成(CC)有5個，生物進(jìn)程(BP)有54個，分子功能(MF)有56個。其中黃酮類化合物的生物合成過程(GO:0009813)在DEGs中高表達(dá)極為顯著，并且發(fā)現(xiàn)GO注釋中有許多與應(yīng)激相關(guān)的基因，比如與紫外線相關(guān)(GO:0009411,GO:0010224),與生物刺激相關(guān)(GO:0009607)，而且在這些高表達(dá)的基因中發(fā)現(xiàn)有參與花瓣發(fā)育過程相關(guān)的基因本體(GO:0048446,GO:0048441)。將不同組織的DEGs分開與擬南芥已知的KEGG數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)在葉子花葉片存在很多與植物光合作用相關(guān)的同源基因，很多基因被注釋到參與光合作用的天線蛋白LHCA/B基因家族(The light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins)，參與光合作用的基因(PSAF、PSAK、PSAN、PSAO、PSBQ2和PETE)，以及參與卡爾文-本森循環(huán)(Calvin-Benson cycle)碳固定的基因(GAPB)。而在苞葉中發(fā)現(xiàn)差異高表達(dá)基因有參與花青素合成的基因(CHI1)。

圖2 葉子花轉(zhuǎn)錄組與非冗余蛋白庫同源比對Fig.2 The homologous blast between B. spectabilis transciptome and non-redundant protein database

1. 細(xì)胞過程;2. 代謝過程;3. 單有機(jī)體過程;4. 刺激反應(yīng);5. 生物調(diào)節(jié);6. 細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生;7. 發(fā)育過程;8. 定位;9. 多細(xì)胞體過程;10. 信號;11. 生殖;12. 多有機(jī)體過程;13. 生長;14. 免疫系統(tǒng)的過程;15. 節(jié)律過程;16. 移動;17. 生物粘附;18. 行為;19. 細(xì)胞殺傷;20. 生物相;21. 細(xì)胞聚集;22. 細(xì)胞;23. 細(xì)胞器;24. 膜;25. 大分子復(fù)合物;26. 膜封閉的管腔;27. 細(xì)胞外區(qū)域;28. 細(xì)胞連接處;29. 共質(zhì)體;30. 超分子復(fù)合物;31. 類核;32. 突觸;33. 其他有機(jī)體;34. 病毒;35. 錨定;36. 催化活性;37. 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性;38. 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;39. 結(jié)構(gòu)分子活性;40. 信號傳感器活動;41. 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性;42. 分子功能調(diào)節(jié)劑;43. 抗氧化活性;44. 轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合;45. 電子載體活性;46. 營養(yǎng)儲藏活動;47. 金屬伴侶活性;48. 翻譯調(diào)節(jié)器活動;49. 蛋白質(zhì)標(biāo)簽圖3 葉子花轉(zhuǎn)錄組Unigene的GO注釋1. Cellular process; 2. Metabolic process; 3. Single-organism process; 4. Response to stimulus; 5. Biological regulation;6. Cellular component organization or biogenesis; 7. Developmental process; 8. Localization; 9. Multicellular organismal process;10. Signaling; 11. Reproduction; 12. Multi-organism process; 13. Growth; 14. Immune system process; 15. Rhythmic process;16. Locomotion; 17. Biological adhesion; 18. Behavior; 19. Cell killing; 20. Biological phase; 21. Cell aggregation; 22. Cell;23. Organelle; 24. Membrane; 25. Macromolecular complex; 26. Membrane-enclosed lumen; 27. Extracellular region;28. Cell junction; 29. Symplast; 30. Supramolecular complex; 31. Nucleoid; 32. Synapse; 33. Other organism; 34. Virion;35. binding;36. Catalytic activity; 37. Transporter activity; 38. Nucleic acid binding transcription factor activity; 39. Structural molecule activity;40. Signal transducer activity; 41. Molecular transducer activity; 42. Molecular function regulator; 43. Antioxidant activity;44. Transcription factor activity, protein binding; 45. Electron carrier activity; 46. Nutrient reservoir activity;47. Metallochaperone activity; 48. Translation regulator activity; 49. Protein tagFig.3 GO annotation of Unigenes in B. spectabilis

表1 qPCR特異性引物

O. 翻譯后修飾，蛋白反轉(zhuǎn)，分子伴侶; T. 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制; M. 細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/質(zhì)膜合成; U. 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸; Z. 細(xì)胞骨架; D. 細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂，染色體分隔; V. 防御機(jī)制；N. 細(xì)胞運(yùn)動; Y. 核酸結(jié)構(gòu); L. 復(fù)制、重組和修復(fù)；K. 轉(zhuǎn)錄; J. 翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成; A. 加工和修飾; B. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué); G. 碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; E. 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; C. 能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換; P. 無機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; I. 脂轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; Q. 次生代謝產(chǎn)物的合成，轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; H. 輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; F. 核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; R. 一般功能預(yù)測; S. 未知功能圖4 葉子花轉(zhuǎn)錄組Unigene的COG功能注釋O. Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; T. Signal transduction mechanisms; M. Cell wall/membrane/envelope biogenesis; U. Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; Z. Cytoskeleton; D. Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; V. Defense mechanisms; N. Cell motility; Y. Nuclear structure; L. Replication, recombination and repair; K. Transcription; J. Translation, ribosomal structure and biogenesis; A. RNA processing and modification RNA; B. Chromatin structure and dynamics; G. Carbohydrate transport and metabolism; E. Amino acid transport and metabolism; C. Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; P. Inorganic ion transport and metabolism; I. Lipid transport and metabolism; Q. Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; H. Coenzyme transport and metabolism; F. Nucleotide transport and metabolism; R. General function prediction only; S. Function unknownFig.4 Functional annotation of Unigenes in B. spectabilis

圖5 葉子花轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因熒光定量PCR驗(yàn)證Fig.5 The experimental validation of differential expression genes in B. spectabilis by quantitative PCR

2.3 熒光定量PCR驗(yàn)證

在苞片表達(dá)量相對上調(diào)的基因中，選擇了5個Unigene(表1)進(jìn)行驗(yàn)證(TIP4作為內(nèi)參基因)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明每個基因在苞片中的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于葉片，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測結(jié)果相符，驗(yàn)證了差異表達(dá)的準(zhǔn)確性(圖5)。其中DODA基因在葉片中的表達(dá)量比內(nèi)參基因TIP4低，而其他基因的表達(dá)量均高于內(nèi)參基因。

3 討 論

葉子花在景觀園藝和環(huán)境美化有著廣泛應(yīng)用，葉子花苞片色彩鮮艷多樣，而且花期長、耐污染，是綠化美化環(huán)境比較好的選擇植物[33]。本研究通過研究同一時期葉子花的苞片與葉片在轉(zhuǎn)錄水平的差異，能更好地理解物種不同組織在同一時期基因的選擇性表達(dá)以及闡釋苞片在物種演化過程中發(fā)揮的生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)對葉子花的葉片和苞片分開收集，一起拼接。由于沒有參考基因組，故采用Trinity進(jìn)行重頭拼接。得到的轉(zhuǎn)錄本是Unigenes的3倍，說明葉子花基因組在表達(dá)之后有很多RNA進(jìn)行了RNA剪切，產(chǎn)生了大量的同源異構(gòu)體(isoform)。將Unigenes分別與各大公共數(shù)據(jù)庫(nr庫、COG、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫等)比對，與已知最大的非冗余蛋白序列庫(nr庫)比對率55.26%，仍有部分基因功能未知。這些功能未知的基因在物種營養(yǎng)器官和繁殖器官均有表達(dá)，可能在葉子花的演化過程中扮演相當(dāng)關(guān)鍵的作用，這些基因的功能研究以及后續(xù)的調(diào)控機(jī)制都還有待于進(jìn)一步研究。在進(jìn)行差異表達(dá)分析時，使用了不需要生物學(xué)重復(fù)的edgeR方法，通過此方法可以極大地避免結(jié)果的假陽性，并通過后續(xù)的qRT-PCR抽樣驗(yàn)證了各基因在葉子花的苞片和葉片差異表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致。

由于現(xiàn)階段對非模式生物的苞片發(fā)育機(jī)制研究很少，本研究根據(jù)苞片和葉片的差異表達(dá)基因研究的結(jié)果借助已報道的分子學(xué)證據(jù)和葉子花的宏觀特征來闡釋苞片在該物種演化過程中發(fā)揮的作用。葉子花苞片葉狀紙質(zhì)，色彩艷麗，常呈紅色或深紫色[33]。在差異表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)，苞片高表達(dá)的基因有與花青素(CHI1)和色素合成關(guān)鍵酶(DOD)相關(guān)的同源基因。之前研究發(fā)現(xiàn)葉子花花色發(fā)生變化主要作用是甜菜色素，而多巴雙加氧酶(DODA)是葉子花中參與甜菜色素合成酶的關(guān)鍵酶[34-35]。 然而對苞片差異基因進(jìn)行GO功能注釋發(fā)現(xiàn)，其中有部分基因參與到黃酮類化合物的生物合成。在模式生物擬南芥的研究中，參與類黃酮代謝基因DTX35在花序組織中尤其是花卉的表皮保衛(wèi)細(xì)胞中特異高表達(dá)[36]。Mol J等[37]通過突變分析也驗(yàn)證了花色受到花青素和黃酮醇類化合物的影響。因此推測，葉子花苞片具有鮮艷的顏色從而取代了花被片的相關(guān)功能，主要是受到甜菜色素合成通路中相關(guān)酶的高表達(dá)以及類黃酮素化合物合成導(dǎo)致的。對葉片高表達(dá)基因進(jìn)行GO富集以及KEGG富集發(fā)現(xiàn)葉片在這一時期主要是參與碳固定、戊糖磷酸化和光合作用等生理活動，然而在苞片高表達(dá)富集的基因中沒有參與光合作用的基因，這與形態(tài)得到的結(jié)果一致。說明葉子花的苞片作為特化的葉片，已經(jīng)基本失去了光合作用的能力，其生理功能更貼近于繁殖器官，不再為植株提供能量。葉子花的花期為9月到次年3月，會經(jīng)歷溫度較低的時期，本研究在葉片高表達(dá)和苞片高表達(dá)的基因中均發(fā)現(xiàn)了葉子花對寒冷刺激作出反應(yīng)的相關(guān)基因(At1g32060、PER57等)，當(dāng)受到寒冷刺激時該類基因表達(dá)會增加[38-40]，體現(xiàn)了葉子花對于低溫環(huán)境的耐受性。同時，在苞片的高表達(dá)的基因中，發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)控花瓣大小的轉(zhuǎn)錄因子BPE[41]以及只在花和根部特異組織表達(dá)的基因(U85A3)[42]，可見葉子花的苞片在基因轉(zhuǎn)錄水平上已經(jīng)有了類似花瓣的功能。本研究中還發(fā)現(xiàn)了葉子花苞片中一些應(yīng)對外界環(huán)境的基因呈高表達(dá)趨勢，其中包括應(yīng)對紫外線(UVR8)[43-44]以及生物刺激(BFRUCT4)[45]的基因。推測由于葉子花苞葉顏色較深，容易受到紫外線的影響，而且容易吸引外界生物，因此相關(guān)基因的表達(dá)在演化中逐漸升高，其具體的生物學(xué)意義和基因調(diào)控通路還需進(jìn)一步研究。此外，在苞片差異基因中我們還發(fā)現(xiàn)了與植物相關(guān)化合物合成(脂肪酸、木聚糖和類單萜等)、代謝(油脂和糖基類等)、酶活性相關(guān)(果膠乙酰酯酶、過氧物酶和蔗糖α-葡糖苷酶等)等基因，這些基因的高表達(dá)可能在葉子花苞發(fā)育相關(guān)時期物質(zhì)能量供應(yīng)方面扮演著重要角色。

綜上所述，葉子花的苞片在演化過程中，其色素調(diào)控相關(guān)的基因發(fā)生了變化，一些花瓣發(fā)育相關(guān)的基因和對外界刺激的基因開始表達(dá)。這些都說明葉子花的苞片在發(fā)育過程中受到相關(guān)基因的影響，漸漸演化出了類似花瓣的結(jié)構(gòu)，協(xié)同并逐漸替代花瓣的一部分功能。本研究對葉子花葉片和苞片的轉(zhuǎn)錄組特征的探討，為未來精細(xì)研究花瓣?duì)畎幕蛘{(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時也可以為研究具有類似性狀的類群的形態(tài)學(xué)演化提供了參考。