鐘曉緣，劉 姍，孫 蓉，張 穎

(攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院[農(nóng)學(xué)院]，四川攀枝花 617000)

三角梅(Bougainvilleaspectabilis)是中央種子目(Centrospermae)紫茉莉科(Nyctaginaceae)葉子花屬(Bougainvillea)的一類常綠藤狀灌木[1]，其可花葉俱賞，具花朵花色豐富、花期長(zhǎng)、適應(yīng)性廣、生命力強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種深受市民喜愛(ài)且廣泛應(yīng)用的觀賞花木。作為景觀植物，花色改良是其重要的育種目標(biāo)，目前三角梅觀賞品種約有100多個(gè)[2-3]，有紅色系、橙色系、粉紫色系及白色系等[4]，但缺乏稀有的藍(lán)色花系。然而迄今為止，基于傳統(tǒng)育種方法未培育出藍(lán)色三角梅新品系，報(bào)道顯示利用基因工程技術(shù)向非藍(lán)色花植物中引入目標(biāo)基因可實(shí)現(xiàn)藍(lán)色花色的培育，而篩選合適的藍(lán)色基因轉(zhuǎn)化受體是藍(lán)色三角梅育種的前提條件。飛燕草素苷是藍(lán)色花色形成的主要色素，三角梅的傳統(tǒng)花色中缺少藍(lán)色是因?yàn)樘鸩松睾铣陕窂胶忘S酮成分合成路徑有相互制約關(guān)系，由于缺乏F3′5′H基因不能有效生成二氫楊梅素(DHM)，因而不能合成藍(lán)色的飛燕草素苷。利用飼喂實(shí)驗(yàn)篩選可高效催化含DHM的品種已在菊花、仙客來(lái)等植物中證明其可行性[5-7]。本研究選取常見(jiàn)的紅色、白色、黃色和紫色4大花色6個(gè)品種三角梅進(jìn)行花色分析，對(duì)其苞片進(jìn)行DHM離體飼喂培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察苞片的顏色變化，分析不同品種利用DHM的能力及對(duì)甜菜色素合成的干擾影響能力，初步篩選適合轉(zhuǎn)化藍(lán)色基因的三角梅受體品種。

1 材料和方法

1.1 植物材料

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)相似的不同色系6個(gè)品種三角梅樣品枝條扦插種植于攀枝花學(xué)院苗圃，選擇生長(zhǎng)良好的植株作為供試材料(圖1)。其中，在各品種三角梅花盛開(kāi)期，‘新加坡大白’苞片為白色，‘寶老橙’和‘花葉大紅’苞片為紅色，‘中國(guó)麗人’和‘安格斯’苞片為紫色，‘黃蝶’苞片為黃色。根據(jù)三角梅苞片發(fā)育過(guò)程將其分為3個(gè)時(shí)期，S1幼嫩期(苞片根部為綠色或苞片處于轉(zhuǎn)色期)；S2盛開(kāi)期(苞片顏色成熟，三角梅花開(kāi)始或全部盛開(kāi))和S3衰敗期(三角梅花部分或全部萎焉)。苞片色彩分析供試樣本為同一株不同時(shí)期的苞片；體外飼喂供試樣本為同一株S1期苞片。

S1.幼嫩期；S2.盛開(kāi)期；S3.衰敗期；下同圖1 供試三角梅品種表觀特征S1. Budding stage; S2. Blooming stage; S3. End flowering stage. The same as belowFig.1 The apparent characteristics of the tested Bougainvillea ssp. varieties

1.2 儀器與試劑

主要儀器包括：取色器(NCS Color Muse, Color Muse SE, NCS-92)，電子天平(HZT，USA. HZUHUAZHI, HZT-FA220S)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(INESA L5S,上海儀電分析儀器有限公司制造)，高壓蒸汽滅菌鍋(BXM-100M，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，超聲波清洗儀(BQ-4, 無(wú)錫市美極超聲設(shè)備有限公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D，上海尚道儀器制造有限公司制造)，光照培養(yǎng)箱(MGC-350B0-2,上海一恒科學(xué)儀器有限公司制造)。主要試劑包括：二氫楊梅素(DHM)，MS培養(yǎng)基，蔗糖，瓊脂粉，無(wú)水乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，丙酮，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。所用試劑均為分析純，供試用水為超純水。

1.3 花色測(cè)定

在避免日光直射、光線良好的室內(nèi)，以苞片下端靠近葉柄處的上表皮細(xì)胞中央部位為取色點(diǎn)，用取色器對(duì)各品種三角梅不同花期苞片取色，色彩定量分析，記錄色彩亮度L*、紅綠色相值a*、黃藍(lán)色相值b*、色彩飽和度C*，以及根據(jù)a*和b*計(jì)算色相角H*[H*=arctan(b*/a*)]。測(cè)定位置均為苞片下端靠近葉柄處的上表皮細(xì)胞中央部位，同一苞片測(cè)定3次，取其平均值為測(cè)定結(jié)果。各品種各花期三角梅苞片色彩數(shù)據(jù)采集不低于100組。

1.4 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)

參照Brugliera等菊花DHM體外飼喂實(shí)驗(yàn)[5-7]的方法并做適量改進(jìn)，采用固體培養(yǎng)基添加DHM進(jìn)行飼喂。固體培養(yǎng)基：1/4 MS+蔗糖10 g/L+瓊脂粉6 g/L，pH 6.5；DHM試驗(yàn)組在此基礎(chǔ)上添加2 mg/mL DHM。采取幼嫩期(S1)的三角梅葉子花，將苞片分別插入DHM試驗(yàn)培養(yǎng)基、空白對(duì)照培養(yǎng)基，使苞片完全浸泡在培養(yǎng)基中。25 ℃、光照培養(yǎng)36 h。各品種每個(gè)處理苞片處理量2 g，重復(fù)3次。培養(yǎng)結(jié)束后，清水沖洗苞片表面培養(yǎng)基，濾紙吸干表面水分，記錄顏色變化。

1.5 苞片水提液色素成分分析

1.5.1 總黃酮的提取及含量測(cè)定將苞片剪成1 mm以下的細(xì)絲，稱取三角梅苞片細(xì)絲2 g，以25 mL 60%乙醇超聲波提取40 min，浸泡24 h后離心取上清液，得到色素水提液，于4 ℃冰箱保存，備用。利用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制總黃酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取2 mL水提供試液于容量瓶，60%乙醇溶液定容至25 mL，為稀釋液。吸取2 mL稀釋液加入1 mL 5% NaNO2溶液，1 mL 10% Al(NO3)3溶液，立即混勻，靜置5 min，加入5 mL 4% NaOH溶液，以60%乙醇溶液定容至25 mL，混勻。靜置5 min，利用紫外可見(jiàn)光譜儀在510 nm處測(cè)定吸光值，同時(shí)以試劑空白作參比。平行測(cè)定3次，并按照下式計(jì)算含量。

黃酮含量(mg·g-1) =(C×V1×V2)/(M×V3×1 000)×100%

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的儀器檢測(cè)濃度(mg/mL)，V1為提取液定容量(mL)，V2為測(cè)定時(shí)定容量(mL)，V3為吸取測(cè)定量(mL)，M為稱取樣品的量(g)。

1.5.2 甜菜色素的提取及總量測(cè)定精密稱取三角梅各供試材料各2 g，加入液氮將其研磨為粉末，迅速加蒸餾水 50 mL 進(jìn)行振蕩，然后置于超聲波清洗器中提取 20 min，置于 4 ℃、12 000×g 的條件下進(jìn)行離心 20 min，收集上清液。精密量取2 mL上清液于容量瓶，60% 乙醇溶液定容至25 mL，為稀釋液。取2 mL稀釋液定容至25 mL，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)538 nm處測(cè)稀釋液甜菜紅吸光值，465 nm處測(cè)甜菜黃吸光值[8]，同時(shí)以試劑空白作參比。平行測(cè)定3次，并按照Stintzing的公式計(jì)算含量。

1.5.3 葉綠素、類胡蘿卜素提取及含量的測(cè)定取0.5 g左右的三角梅苞片細(xì)絲，以10 mL丙酮和無(wú)水乙醇(V∶V=1∶1)混合提取液超聲波提取40 min，避光浸提至苞片顏色消失，離心取上清液為供試液，在波長(zhǎng)663、645和470 nm下測(cè)定吸光度值[9]，同時(shí)以試劑空白作參比。平行測(cè)定3次。葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及葉綠素總量按Lictenthaler[10]的公式計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件SPSS Statistics 26進(jìn)行相關(guān)性分析；Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖，Origin 2019進(jìn)行多元線性回歸分析；DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析。

灰色關(guān)聯(lián)分析以供試的6個(gè)三角梅品種做為一個(gè)灰色系統(tǒng)，其中每一個(gè)品種作為系統(tǒng)中的一個(gè)灰色單元，以各指標(biāo)最佳值構(gòu)建“參考品種”的苞片參數(shù)，對(duì)三角梅苞片參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理及無(wú)量綱化處理，計(jì)算各品種差序列Δi=|x0(k)-xi(k)|，求得最大極差值M=maximaxkΔi(k)與最小極差值m=miniminkΔi(k)，然后計(jì)算各指標(biāo)關(guān)聯(lián)系數(shù)ζi(k)=(m+ρM)/(Δi+ρM)，對(duì)無(wú)量綱化后各指標(biāo)參數(shù)賦權(quán)，最后計(jì)算加權(quán)關(guān)聯(lián)度[11]。公式中，i=1,2,3…,n(待評(píng)價(jià)品種數(shù))；k=1,2,3…,n(待評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù))；Δi=|x0(k)-xi(k)|為第i個(gè)品種第k個(gè)指標(biāo)無(wú)量綱化處理值與最優(yōu)指標(biāo)值的絕對(duì)差值。為分辨系數(shù)，取值范圍為[0,1]，本實(shí)驗(yàn)中取0.5，γi為第i個(gè)品種的灰色關(guān)聯(lián)度，w(k)第k個(gè)指標(biāo)的權(quán)重。

2 結(jié)果和分析

2.1 三角梅各品種苞片不同發(fā)育時(shí)期色素含量、色彩參數(shù)及相關(guān)性分析

2.1.1 苞片色素含量三角梅苞片色素含量在品種間和不同發(fā)育時(shí)期之間多存在顯著性差異。其中，苞片中總黃酮含量以‘安格斯’最低，而以‘新加坡大白’和‘花葉大紅’相對(duì)較高，且品種間均存在顯著性差異；隨苞片發(fā)育進(jìn)程(S1→S2→S3)，各品種苞片中總黃酮含量均呈較為一致的逐漸下降趨勢(shì)，但在發(fā)育時(shí)期間均無(wú)顯著差異(圖2，A)。苞片甜菜色素(甜菜紅素和甜菜黃素)含量在各品種間有顯著差異，并以品種‘花葉大紅’最高，且顯著高于同期其余品種，而苞葉甜菜紅素含量以品種‘新加坡大白’最低，并低于同期大多數(shù)品種，苞葉甜菜黃素含量以‘新加坡大白’和‘安格斯’最低，并與其余品種差異顯著；苞片甜菜色素隨苞片發(fā)育總體呈上升趨勢(shì)，但僅‘新加坡大白’‘寶老橙’和‘中國(guó)麗人’苞葉甜菜紅素含量在生育時(shí)期間有顯著差異。各品種苞片葉綠素含量(葉綠素a和b)從S1期到S2期大多顯著下降，隨后均保持相對(duì)穩(wěn)定，即S1期明顯高于其余時(shí)期，且在各時(shí)期均以品種‘花葉大紅’含量最高。苞葉類胡蘿卜素含量在各品種三角梅苞片中均處于較低水平，但在品種間和生育期間存在顯著差異，各品種以‘新加坡大白’、‘花葉大紅’和‘安格斯’相對(duì)較高;隨著生育期推進(jìn)，‘花葉大紅’和‘中國(guó)麗人’含量有降低趨勢(shì)，并在S1時(shí)期有最高值，而其余品種則有上升的趨勢(shì)，多在S3時(shí)期有最高值。

Ⅰ.新加坡大白；Ⅱ.寶老橙；Ⅲ.花葉大紅；Ⅳ.中國(guó)麗人；Ⅴ.黃蝶；Ⅵ.安格斯;同一發(fā)育階段內(nèi)不同小寫字母表示三角梅品種間苞片色素含量在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05)；下同圖2 各品種三角梅苞片不同發(fā)育期色素含量Ⅰ. Singapore White; Ⅱ. Baolaocheng; Ⅲ. Brilliant Variegata; Ⅳ. China Beauty; Ⅴ. Firecracker Yellow; Ⅵ. Elizabeth Angus;Different lowercase letters indicate significant differences in pigment content of Bougainvillea spp. bracts among different varieties at the same developmental stage at 0.05 level (P<0.05). The same as belowFig.2 The pigment content of Bougainvillea spp. bracts in different developmental stages

2.1.2 苞片色素含量比例不同三角梅品種間苞片中各色素含量占比也有明顯差異(圖3)。其中，甜菜色素作為三角梅苞片中的主要色素，其在不同品種三角梅苞片中含量占比差距較大，且甜菜紅素與甜菜黃素也有所差異。在苞片幼嫩期(S1)，葉綠素和甜菜色素是苞片中的主導(dǎo)色素(占比>50%)，而在盛開(kāi)期(S2)和衰敗期(S3)，總黃酮和甜菜色素是苞片中的主導(dǎo)色素?？梢钥闯觯S三角梅苞片發(fā)育，其中色素含量占比的變化表現(xiàn)出一定規(guī)律性, 即在3個(gè)發(fā)育時(shí)期，苞片中甜菜色素含量(甜菜紅素+甜菜黃素)都是較高，隨著發(fā)育時(shí)期總體呈上升趨勢(shì)；隨著苞片不斷發(fā)育，其中的總黃酮、葉綠素含量都出現(xiàn)下降趨勢(shì)，且葉綠素(葉綠素a、葉綠素b)含量下降明顯；苞片胡蘿卜素含量在發(fā)育中變化較小，增降幅度均波動(dòng)不大。

圖3 不同品種和發(fā)育期三角梅苞片各色素含量占比差異Fig.3 The difference in the percentage of pigment content of Bougainvillea ssp. bracts in different cultivars and developmental stages

2.1.3 色彩參數(shù)隨三角梅苞片發(fā)育進(jìn)程，各品種苞片色彩參數(shù)的變化表現(xiàn)出一定的規(guī)律性及差異性(表1)。其中，苞片亮度(L*值)大致呈增大趨勢(shì)，即隨苞片發(fā)育，苞片亮度增大，并以白色品種三角梅‘新加坡大白’苞片色彩亮度最大；各品種苞片的紅綠色相值(a*值)在幼嫩期向盛開(kāi)期發(fā)育階段(S1→S2)均呈增大趨勢(shì)，在盛開(kāi)期向衰敗期發(fā)育階段(S2→S3)除‘新加坡大白’與‘黃蝶’兩品種a*值呈下降趨勢(shì)，其余4品種均呈上升趨勢(shì)；各品種苞片黃藍(lán)色相值(b*值)隨發(fā)育的進(jìn)程(S1→S3)整體呈下降趨勢(shì)，除‘新加坡大白’ b*值的下降主要體現(xiàn)在幼嫩期向盛開(kāi)期發(fā)育階段(S1→S2)外，其余品種b*值的下降主要體現(xiàn)在盛開(kāi)期向衰敗期發(fā)育階段(S2→S3)；隨苞片發(fā)育進(jìn)程，各品種苞片色彩飽和度(C*值)除‘新加坡大白’外也整體呈上升趨勢(shì)。

2.1.4 苞片色素含量與色彩參數(shù)相關(guān)性為探究三角梅苞片色素含量與苞片色彩間的關(guān)系，將三角梅苞片中色素含量與色彩參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。由表2可知，苞片葉綠素(葉綠素a、b、總?cè)~綠素)和類胡蘿卜素的含量與其色彩參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性；苞片甜菜色素(甜菜紅素、甜菜黃素、總甜菜色素)含量及總黃酮含量與其色彩參數(shù)有顯著的相關(guān)性。其中，甜菜紅素、甜菜黃素及總甜菜色素含量與苞片a*值呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，即隨著甜菜色苷含量的升高，苞片a*值增大(紅色增加或綠色減退)；甜菜紅素及總甜菜色素含量與苞片L*值呈顯著負(fù)相關(guān)，即隨著甜菜紅素、總甜菜色素含量的升高，苞片L*值減小(苞片色彩變暗)；甜菜紅素含量與苞片b*值呈顯著負(fù)相關(guān)，即隨著甜菜紅素含量的升高，苞片b*值減小(黃色減退或藍(lán)色增加)；總黃酮含量與苞片L*值及b*值呈顯著正相關(guān)，與苞片a*值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，即隨著總黃酮含量增加，苞片L*值增大(苞片色彩變亮)及b*值增大(黃色增加或藍(lán)色減退)；同時(shí)，三角梅苞片中甜菜黃素含量與色相值H*呈顯著正相關(guān)。

表1 三角梅各品種不同生育期苞片色彩參數(shù)

表2 三角梅苞片色彩參數(shù)與色素含量相關(guān)系數(shù)

為進(jìn)一步了解三角梅苞片與其色素含量間的關(guān)系，對(duì)三角梅苞片色彩參數(shù)與其苞片中色素含量存在著相關(guān)性的因子間進(jìn)行回歸分析，即以L*、a*、b*為因變量(y)，甜菜紅素、甜菜黃素、總甜菜色苷、總黃酮含量為自變量(分別以x1、x2、x3、x4表示)，進(jìn)行多元線性回歸方程擬合，得如下擬合方程：

L*:y=64.001-747.345x1-1.079x3+812.974x4(R2=0.551);

a*:y=12.124+90.656x1+13.45x2+19.255x3-21.809x4(R2=0.767);

b*:y=25.377-84.439x1+24.347x4(R2=0.535)

根據(jù)回歸方程自變量系數(shù)可知，三角梅苞片色素含量對(duì)其色彩參數(shù)值(L*、a*、b*)的影響中，甜菜紅素含量的影響值均大于總黃酮含量的影響值。綜上，三角梅苞片色彩主要由甜菜色素和黃酮類色素兩類色素所決定，并以甜菜紅素的影響最大。因此后續(xù)主要討論甜菜色素及總黃酮對(duì)三角梅苞片色彩的影響。

2.2 DHM離體誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)三角梅苞片色素成分含量和色彩參數(shù)的影響

2.2.1 色素成分含量及占比圖4，A、B顯示，經(jīng)二氫楊梅素(DHM)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的6個(gè)品種三角梅苞片中，總黃酮含量在4個(gè)品種三角梅(‘新加坡大白’、‘寶老橙’、‘中國(guó)麗人’、‘黃蝶’)苞片中明顯升高，并以‘新加坡大白’苞片中總黃酮含量上升幅度最大(+65.77%)；各品種苞片總甜菜色素含量均下降，其中的‘新加坡大白’苞片中甜菜色素含量下降幅度最大(甜菜紅素：-62.80%，甜菜黃素：-59.75),‘黃蝶’、‘安格斯’苞片中甜菜黃素含量變化與其他4個(gè)品種相反，有小幅度上升(‘黃蝶’甜菜黃素：+9.72%，‘安格斯’甜菜黃素：+15.30%)。

同時(shí)，如圖4，C、D所示，經(jīng)DHM體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的6個(gè)品種三角梅苞片中，除紅色品種‘花葉大紅’及紫色品種‘安格斯’例外，其余4個(gè)品種的三角梅苞片中總黃酮含量占比均呈上升趨勢(shì)，甜菜色素含量占比均呈下降趨勢(shì)。其中，白色花色品種‘新加坡大白’苞片中色素含量占比變化幅度最大，并且表現(xiàn)為總黃酮含量占比顯著上升(+26.91%)，甜菜色素占比下降(甜菜紅素含量占比-15.24%，甜菜黃素含量占比-11.67%)；紅色花色品種‘花葉大紅’苞片中各色素含量占比變化幅度最小。

DHM.DHM飼喂培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組；CG.對(duì)照組;下同圖4 三角梅苞片DHM體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后色素含量及其占比的變化DHM. DHM feeding experimental group; CG. Control group. The same as belowFig.4 The changes of pigment contents and its percentage in Bougainvillea ssp. bracts after DHM induction and culture in vitro

2.2.2 苞片表觀色彩6個(gè)品種三角梅苞片在含飛燕草素苷前體物DHM的培養(yǎng)基光照培養(yǎng)36 h后，3個(gè)品種的三角梅苞片出現(xiàn)了較為明顯的顏色變化(圖5)。其中,‘中國(guó)麗人’苞片顏色加深，苞片底部到尖端的顏色過(guò)渡減弱，苞片呈色較為一致；‘寶老橙’苞片橙色變淺，色彩變暗；‘新加坡大白’苞片葉脈變明顯，同時(shí)苞片顏色發(fā)生較為明顯變化，苞片呈白色。各品種苞片色彩的變化與其苞片中甜菜色素含量及色素含量的占比變化結(jié)果基本一致?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)DHM體外離體飼喂培養(yǎng)的苞片顏色和色素含量及占比發(fā)生了較明顯變化，由此可推測(cè)此類供試品種苞片組織細(xì)胞能自動(dòng)攝取，并使攝入的DHM進(jìn)入自身色素代謝途徑，對(duì)原有的自身色素代謝途徑下游產(chǎn)物產(chǎn)生一定干擾。

圖5 三角梅苞片DHM體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后表觀色彩變化Fig.5 The apparent color changes of Bougainvillea ssp. bracts after DHM induction and culture in vitro

2.3 三角梅品種苞葉色素成分含量的灰色關(guān)聯(lián)度分析

三角梅苞片總黃酮含量和甜菜色素含量與其苞片色彩參數(shù)間有著較強(qiáng)相關(guān)性，同時(shí)總黃酮含量及占比變化大的品種對(duì)應(yīng)苞片色彩變化有較明顯變化，說(shuō)明高含量的總黃酮及權(quán)重有益于三角梅花色的改變，而甜菜色素是三角梅苞片中的主要色素。因此，高含量及占比的總黃酮、低含量及占比的甜菜色素是三角梅新型花色選育研究中選擇目標(biāo)品種時(shí)重要的考慮因素。

由于本實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)參數(shù)單位一致，因此采取均值化對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行無(wú)量綱化處理。由供試品種各指標(biāo)參數(shù)的最佳值作為灰色關(guān)聯(lián)分析參考品種指標(biāo)參數(shù)。參考三角梅品種的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)為：總黃酮含量0.421 9 mg/g，甜菜紅素含量0.161 2 mg/g，甜菜黃素含量0.098 3 mg/g，總甜菜色素含量0.322 6 mg/g；由于甜菜紅素含量、甜菜黃素含量與藍(lán)色花色呈負(fù)相關(guān)作用，因此對(duì)無(wú)量綱化甜菜紅素含量、甜菜黃素含量指標(biāo)參數(shù)時(shí)取逆序列值；根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所測(cè)色素含量與苞片間相關(guān)性分析結(jié)果對(duì)無(wú)量綱化后各指標(biāo)參數(shù)賦權(quán)：總黃酮含量為0.4，甜菜紅素含量為0.5，甜菜黃素含量為0.05，總甜菜色素含量為0.05。

應(yīng)用灰色系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)度分析計(jì)算供試品種與參考品種的關(guān)聯(lián)度(表3)，發(fā)現(xiàn)‘新加坡大白’關(guān)聯(lián)度最高(0.744 4)，所以可選定‘新加坡大白’作為藍(lán)色轉(zhuǎn)基因三角梅候受體品種。

表3 三角梅品種苞葉色素成分含量灰色關(guān)聯(lián)度分析

3 討 論

本研究對(duì)三角梅苞片色彩參數(shù)間進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)苞片色彩明亮度(L*)值與色紅綠色相(a*)值呈負(fù)相關(guān)，這與余秋岫等[12]在對(duì)紫花含笑花被呈色過(guò)程中色素含量變化研究結(jié)果一致，即隨著紅度的降低，花瓣的亮度逐漸升高。三角梅苞片的紅綠色相(a*)值對(duì)三角梅苞片的呈色有著舉足輕重的作用，因此，在對(duì)三角梅花色的改良及新型花色的培育研究中，紅綠色相(a*)值的控制與改變是今后研究者們的重要研究切入點(diǎn)。

本研究通過(guò)對(duì)三角梅苞片中色素含量與苞片色彩參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，總黃酮含量與苞片a*值呈顯著正相關(guān)，這與前人對(duì)葉片色彩與色素含量的相關(guān)性研究結(jié)果一致，即黃酮類色素含量與紅綠色相值a*呈顯著或極顯著正相關(guān)[13-15]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)三角梅苞片甜菜紅素含量與苞片L*值及b*值呈極顯著負(fù)相關(guān)，與a*值呈顯著正相關(guān)，即甜菜紅素含量對(duì)三角梅苞片呈色有著決定性的影響。Aida等研究證明，提高黃酮、黃酮醇含量能使蝴蝶蘭轉(zhuǎn)化植株花色變藍(lán)[16]。黃酮類物質(zhì)的黃酮和黃酮醇是重要的助色素，當(dāng)黃酮與花色苷組成復(fù)合物時(shí)，可產(chǎn)生增色效應(yīng)，使花色苷的可見(jiàn)光吸收光譜發(fā)生紅移現(xiàn)象，使花色的藍(lán)色效果增強(qiáng)[17]。因此，高黃酮含量的植物品種也是理想藍(lán)色轉(zhuǎn)基因受體的一個(gè)重要選擇對(duì)象。在本研究供試4大花色6個(gè)品種三角梅品種中白色三角梅‘新加坡大白’最適宜作為藍(lán)色花色轉(zhuǎn)基因受體。三角梅苞片中的甜菜色素是決定其花色的主要色素，白色品種中甜菜色素含量權(quán)重低，有利于其他色素的展色，并且不會(huì)對(duì)其他色素原有色彩產(chǎn)生干擾，可使轉(zhuǎn)化植株形成的藍(lán)色效果更加明顯。

三角梅苞片顏色隸屬的甜菜色素和屬于類黃酮的花青素在自然界排斥分布，不能積累藍(lán)色素，目前解決這一問(wèn)題的方法一是為植物轉(zhuǎn)入F3′5′H基因，一是進(jìn)行DHM飼喂。在不能確定能否有效發(fā)揮作用的品種中盲目轉(zhuǎn)入新基因很難取得明顯結(jié)果，因此飼喂實(shí)驗(yàn)變?yōu)槭走x。近年研究發(fā)現(xiàn)三角梅屬植物苞片中存在大量黃酮類物質(zhì)(檞皮素、山奈酚、異鼠李素等)[18]，同時(shí)在三角梅屬植物中已成功檢測(cè)出花青素合成途徑末端的3個(gè)基因(DFR,LDOX,3-GT)，特別是DFR是催化F3′5′H生成DHM的關(guān)鍵基因，使得培育三角梅藍(lán)花色品種有了科學(xué)依據(jù)。自然界中大多數(shù)藍(lán)色花的花色苷都是由飛燕草素苷組成，而DHM是飛燕草素合成必要的前體物質(zhì)。該合成路徑是轉(zhuǎn)化外源藍(lán)色基因受體花色呈現(xiàn)藍(lán)色的前提。

在本研究中只是討論了三角梅產(chǎn)生藍(lán)色花的可能性，找到了最適宜作為轉(zhuǎn)基因受體的花色——白色。我們推測(cè)其余顏色中較高的甜菜色素含量對(duì)花青素的合成有一定影響。前人認(rèn)為兩者的合成前體存在淵源，均與苯丙氨酸相關(guān)，有一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[19]。Harborne等報(bào)道當(dāng)植物體中單獨(dú)存在飛燕草素糖苷時(shí)，多數(shù)情況下花顯現(xiàn)紫紅色，只有需要類黃酮作為助色素才會(huì)表現(xiàn)出藍(lán)色[20]，因此今后仍需進(jìn)一步對(duì)相關(guān)基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)助色素含量，以及研究如何抑制甜菜色素合成途徑讓代謝流進(jìn)入花青素合成途徑，才能最終達(dá)到藍(lán)色三角梅培育的目的。本研究是首次在甜菜色素合成途徑的觀賞植物中進(jìn)行飼喂實(shí)驗(yàn)，為三角梅新花色的培育提供了新方向，為利用基因工程技術(shù)合成藍(lán)色三角梅提供了數(shù)據(jù)支撐。