孟 妮，劉雅莉，竇雪溪，劉紅利，李方殷

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西楊陵712100)

蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)是蘭科蝴蝶蘭屬的花卉，因其花色艷麗，形似蝴蝶，花期持久，深受人們喜愛，被譽為“蘭花皇后”，具有極高的科研、觀賞、生態(tài)和經(jīng)濟價值[1]?；ㄆ鞴傩誀?花色、花香、花型等)改良是蝴蝶蘭遺傳育種的重要目標(biāo)，但漫長的生命周期嚴(yán)重限制了蝴蝶蘭基因功能研究和分子育種的進展。特別是植物轉(zhuǎn)基因工程中，蘭花從體外原球莖再生到成花，檢驗外源基因?qū)D(zhuǎn)基因蘭花表型、生理等方面的影響至少需要3～4年[2]。即使成功轉(zhuǎn)化，外源基因在受體植株中的不確定性和不穩(wěn)定性也很難克服。這些都意味著漫長的時間和龐大的人力資源。這就迫切需要建立一套可以快速在蝴蝶蘭花器官中進行性狀檢測和基因功能分析的早期驗證系統(tǒng)。

花瓣瞬時轉(zhuǎn)化方法可以代替穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系，對外源基因的功能和轉(zhuǎn)基因花瓣的預(yù)期表型進行早期評估。瞬時表達分析是一種快速研究基因-蛋白質(zhì)功能的方法。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化必須將T-DNA整合到宿主基因組中。而瞬時表達不需要將外源基因整合到染色體上，宿主細(xì)胞核中存在的T-DNA的非整合拷貝也能表達[3]，外源基因表達效率高，有時甚至是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的1 000倍[4]。因此，針對植物的目標(biāo)性狀，瞬時測定法具有簡單、快速、周期短、準(zhǔn)確等優(yōu)點[5]。

本研究選用蝴蝶蘭品種‘大辣椒’的花瓣和萼片為試材，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化方法，將報告基因β-葡糖醛酸酶基因(GUS)導(dǎo)入蝴蝶蘭花瓣，通過組織化學(xué)染色法研究適宜蝴蝶蘭高效瞬時表達的最佳條件。并進一步在蝴蝶蘭花瓣中分析花色基因CHS的功能，驗證該體系的可行性。

1 材料和方法

1.1 材 料

蝴蝶蘭供試樣品為紫紅色‘大辣椒’(P.‘Big chili’)，所有材料于2017年4月購于陜西省咸陽市楊陵區(qū)蝴蝶蘭基地。

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌株、植物表達載體pCAMBIA 0380-35S::GUS以及pKANNIBAL-phCHS干擾載體均為西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室保存。

緩沖重懸液，取MS粉4.43 g加入到1 L ddH2O中，121 ℃滅菌25 min備用，使用前加入200 mmol/L的乙酰丁香酮(AS)500 μL，pH 7.0。

花青苷提取液為甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸按比例70∶27∶2∶1混合而成。

1.2 方 法

1.2.1根癌農(nóng)桿菌菌液制備將攜帶35S::GUS的植物表達載體通過液氮凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，挑取根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子單菌落，在含50 mg/L卡那霉素、60 mg/L慶大霉素和25 mg/L利福平的液體LB培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜菌液100 μL，接種于50 mL含對應(yīng)抗性篩選的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min過夜擴大培養(yǎng)。4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體。根癌農(nóng)桿菌菌液濃度用其菌液在600 nm時的吸光光度值(OD600)表示。用緩沖重懸液將OD600調(diào)至0.2、0.6、1.0、2.0備用。

1.2.2花瓣注射和侵染方法取完全開放的花瓣和萼片，用無菌注射器針刺中心部位后使用1 mL無針頭的注射器于破口處緩慢注入菌液，而后將造成機械損傷的組織整體置入懸浮液中侵染[6]。將制備的不同濃度農(nóng)桿菌菌液振蕩侵染蝴蝶蘭花瓣，侵染時間分別為0、60和180 s，在(25±2)℃黑暗恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 d后進行染色并統(tǒng)計GUS瞬時表達率。

根據(jù)以上研究獲得瞬時表達最佳菌液濃度和侵染時間的組合，即菌液濃度OD600為0.6，侵染時間為60 s，在緩沖重懸液中加入乙酰丁香酮(AS)濃度分別為0、50、100、150、200、350 μmol/L, 共培養(yǎng)3 d后檢測GUS瞬時表達率。

用OD600為 0.6的根癌農(nóng)桿菌菌液侵染蝴蝶蘭花瓣和萼片60 s后，在共培養(yǎng)過程中添加150 μmol/L AS，黑暗恒溫條件下分別共培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6和7 d，對共培養(yǎng)結(jié)束的蝴蝶蘭花瓣進行染色并統(tǒng)計GUS瞬時表達率。

1.2.3瞬時轉(zhuǎn)化材料的鑒定(1) GUS組織化學(xué)染色分析。GUS組織化學(xué)染色依據(jù) Jefferson 等[7]的方法進行了改良。將花瓣浸入X-gulc染色液后，1.2 kPa真空抽濾10 min，37 ℃溫育過夜，第2天除去染色液，用95%乙醇使植物組織脫色，觀測染色結(jié)果并統(tǒng)計GUS瞬時表達率，以無菌水處理的花瓣和萼片作為陰性對照。GUS瞬時表達率(%)=(顯色花瓣數(shù)/檢測總花瓣數(shù))×100% 。

(2) 瞬時表達材料的反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定。設(shè)計蝴蝶蘭CHS基因檢測引物，上游序列為 5′-ATCGGACTCACCTTCCAC-3′，下游序列為 5′-AGCACATTTCTACTCGCG-3′，內(nèi)參Actin基因上游序列為 5′-GTTCTTTCCCTATATGCTAGTGGC-3′，下游序列為 5′-GAAGGATGGCATGAGGAAG-TG-3′，分別以未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化的蝴蝶蘭花瓣為材料提取總RNA[8]，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后以此為模板進行 PCR 擴增，以質(zhì)粒DNA 為陽性對照、用無菌水侵染的植株花瓣為陰性對照。RT-PCR 擴增采用 20 μL 反應(yīng)體系：上下游引物各 0. 8 μL，5 U TaqMix 酶 10 μL，模板 DNA 1 μL，超純水補齊。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸15 s，25 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 2 mins，4 ℃保存。PCR 擴增結(jié)束后，吸取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于 1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像儀上成像并拍照。

1.2.4花青素苷總量測定取實驗后的新鮮花器官，稱量，用液氮研磨后加入提取液，根據(jù)王琳等[9]的方法制備萃取液。測定花器官中總花青苷含量參考Huang等[10]的方法，分別在 530 和 657 nm 處進行吸收值測定，然后根據(jù)公式A530-0.25×A657計算，總花青苷用底物吸收值與鮮重的比值表示。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與分析每個試驗重復(fù)3次，平均每個處理20個花瓣。共培養(yǎng)結(jié)束后取出各組花瓣采用組織化學(xué)染色法對其染色，檢測GUS瞬時表達情況。采用Excel軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；采用SPSS 17.0軟件進行方差分析；利用HemI (Heatmap Illustrator，version 1.0)繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭花瓣中組織化學(xué)GUS測定的評分模式

本研究為了更好地評估GUS瞬時轉(zhuǎn)化效率，將攜帶植物表達載體35S::GUS的農(nóng)桿菌菌株侵染蝴蝶蘭‘大辣椒’的花瓣，農(nóng)桿菌菌液OD600為0.6、侵染時間60 s，在重懸液中添加200 μmol/L乙酰丁香酮，共培養(yǎng)2 d后，檢測GUS基因表達水平 (圖1) 。根據(jù)組織化學(xué)染色結(jié)果將其分為4個等級：未染色(-)，染色程度淺(+)，染色程度中等(++)，染色程度強(+++)。

2.2 菌液濃度和侵染時間對GUS瞬時表達的影響

農(nóng)桿菌菌液濃度在OD600為0.2～2.0的寬泛范圍內(nèi)，侵染時間在0～180 s時，GUS均能表達，但表達量差別明顯(圖2)。GUS活性隨著菌液濃度的提高逐漸增加，在OD600為 0.6時達到峰值，當(dāng)OD600為2.0時顯著降低。當(dāng)OD600為 0.6，侵染60 s時，GUS表達率最高為57%，而OD600為 0.6，侵染時間為180 s時，GUS表達率為53%，方差檢驗分析這二者之間差異顯著。綜合考慮，最佳的組合是侵染液濃度OD600為 0.6，侵染時間為60 s。

2.3 乙酰丁香酮對GUS瞬間表達的影響

根據(jù)以上研究獲得瞬時表達最佳菌液濃度和侵染時間的組合，即菌液濃度OD600為0.6，侵染時間為60 s，在緩沖重懸液中加入乙酰丁香酮(AS)濃度分別為0、50、100、150、200、350 μmol/L, 共培養(yǎng)3 d后檢測GUS瞬時表達率。

結(jié)果顯示AS的濃度對蝴蝶蘭花瓣的GUS 瞬時表達率有顯著影響(表1)。在重懸液中不添加AS時，GUS瞬時表達率為0；隨著AS濃度不斷增加，GUS瞬時表達率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。當(dāng)AS濃度為150 μmol/L時，GUS瞬時表達率達到最高，為86.67%。之后GUS瞬時表達率逐漸下降。

對GUS染色的花瓣進行染色程度的統(tǒng)計分析，重懸液中添加的AS濃度不斷增高，染色程度中等和染色程度強的花瓣GUS染色率也呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在AS濃度為150 μmol/L，染色程度中等和染色程度強的花瓣GUS總?cè)旧蕿?5%，而AS濃度為200 μmol/L的染色率僅為48.33%。因此，在蝴蝶蘭花瓣瞬時轉(zhuǎn)化中，最適宜的AS濃度為150 μmol/L。

2.4 共培養(yǎng)時間對GUS瞬間表達的影響

用OD600為 0. 6的根癌農(nóng)桿菌菌液侵染蝴蝶蘭花瓣和萼片60 s后，在共培養(yǎng)過程中添加150 μmol/LAS，黑暗恒溫條件下分別共培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6和7 d。從表2可以看出共培養(yǎng)時間從0～7 d不斷延長時，GUS瞬時表達率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。共培養(yǎng)時間為3 d時達到最高值，為85.01%。之后GUS瞬時表達率不斷下降，當(dāng)共培養(yǎng)時間為6 d時，GUS瞬時表達率僅為8.33%。說明共培養(yǎng)時間對GUS瞬時表達率有較大的影響。

A.新鮮花瓣；B.空白對照；C.-(未染色)；D.+(染色程度淺)；E.++(染色程度中等)；F.+++(染色程度強)圖1 蝴蝶蘭花瓣中組織化學(xué)GUS測定的評分模式A.Fresh petals；B. Blank control；C. -(unstained)； D.+ (staining is shallow)； E. ++(staining moderate)； F.+++(staining the strongest)Fig.1 Pattern of scoring for the histochemical GUS assay in Phalaenopsis aphrodite petals

Y軸代表不同的侵染時間0、60、180 s；X軸代表菌液在600 nm時的吸光度值(OD)，分別為0.2、0.6、1.0、2.0圖2 菌液濃度和侵染時間對GUS瞬時表達的影響The Y-axis represents the infection time, which were 0,60 and 180 seconds；The X-axis represents the absorbance value of the broth at 600 nm, which were 0.2,0.6,1.0 and 2.0Fig.2 Effect of bacterial concentration and infection time on the expression of GUS in the sepals and petals

觀察共培養(yǎng)時間為2和3 d之間的GUS染色程度率，得知共培養(yǎng)3 d時，染色程度中等和染色程度強的百分率均高于共培養(yǎng)2 d時的百分率。因此，在蝴蝶蘭花瓣瞬時轉(zhuǎn)化中，共培養(yǎng)時間以3 d為宜。

2.5 花色基因在蝴蝶蘭瞬時表達體系中的功能驗證

為了驗證蝴蝶蘭花瓣瞬時表達體系，將CHS基因干擾載體轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭花瓣。與對照組相比，轉(zhuǎn)基因蝴蝶蘭花色明顯變淡(圖3，A～D)?？偦ㄇ嘬蘸繙y定顯示對照組花瓣中總花青苷的含量約為轉(zhuǎn)基因植物的2. 5倍(圖3，C)。RT-PCR檢測顯示，與預(yù)期結(jié)果一致，攜帶CHSRNAi的轉(zhuǎn)基因花瓣擴增的目的條帶亮度低于對照組(圖3，E)，說明目的基因CHS在該蝴蝶蘭花瓣中的表達被抑制，證明了CHS在蝴蝶蘭花青素合成過程中發(fā)揮重要作用。該結(jié)果進一步證實了該體系可以用于基因功能在蝴蝶蘭花器官中的早期驗證。

表1 AS對蝴蝶蘭花瓣GUS瞬時表達率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著； +、++和+++分別表示染色程度輕、中等和強的花瓣GUS染色率。下同Note: After each column of data, different normal letters indicate significant difference at 0.05 level. The staining rate +, ++, +++ indicate the staining rate of the petals with a light, medium and strong level of staining, respectively. The same as below

表2 共培養(yǎng)時間對蝴蝶蘭花瓣GUS瞬時表達率的影響

A.無菌水處理的花瓣；B.轉(zhuǎn)化CHS RNAi基因的花瓣；C.總花青苷含量的測定和對應(yīng)的提取液；D.蝴蝶蘭花器官解剖圖；E.RT-PCR檢測，IR表示侵染區(qū)域，NR表示沒有侵染的區(qū)域，P和S分別代表花瓣和萼片圖3 CHS基因在蝴蝶蘭瞬時表達體系中的功能驗證A. Petal of sterile water treatment；B. Flower petals transforming the CHS RNAi gene；C. Determination of total anthocyanin content and corresponding extract；D. Phalaenopsis aphrodite orchid organ dismantling；E. RT-PCR detection, IR indicate infected area, NR indicate no infected area, P and S represent petal and sepal respectivelyFig.3 Functional verification of the CHS gene in the transient expression system of Phalaenopsis aphrodite

3 討 論

瞬時表達系統(tǒng)是植物基因功能研究不可或缺的分析工具。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化方法快速、高效，不需要昂貴的設(shè)備。迄今為止確定的影響瞬時轉(zhuǎn)化最重要的因素是宿主植物的基因型，農(nóng)桿菌菌株類型，農(nóng)桿菌菌液的濃度、侵染時間以及乙酰丁香酮的濃度和共培養(yǎng)天數(shù)[11]。

本研究通過對農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間進行組合，獲得蝴蝶蘭花瓣瞬時轉(zhuǎn)化最適宜的侵染液濃度OD600為0. 6，侵染時間為60 s。大量研究表明，農(nóng)桿菌懸浮液OD600為0. 6～1. 0之間已經(jīng)普遍用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘭花遺傳轉(zhuǎn)化中，例如石斛蘭(Dendrobiumnobile)[12]、文心蘭(Oncidiumhybridum)[13]和蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)[14]。Yasmin等[15]報道寬范圍OD6000. 5 ～ 4. 0的菌液濃度對月季花瓣的瞬時轉(zhuǎn)化GUS活性沒有顯著影響，菌液濃度小于0. 5時沒有GUS活性。這是由于植物敏感性不同還是宿主植物基因型不同，或是其他方面的原因有待進一步研究。

使用不同的滲透介質(zhì)[16]、添加乙酰丁香酮[17]和表面活性劑[11]能顯著提高外源基因的表達。乙酰丁香酮提高外植體轉(zhuǎn)化效率的原因，是因為Vir區(qū)的活動產(chǎn)物能將 T-DNA區(qū)從T兩側(cè) 25 bp邊緣的序列中切割下來，從而促進外源基因的融合。因此，Vir區(qū)的活化是農(nóng)桿菌向植物基因組轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵步驟，但是不同植物適宜乙酰丁香酮的濃度不同[18]。在文心蘭[13]、石斛蘭[19]、月季花瓣[15]、煙草葉片[11]遺傳轉(zhuǎn)化中使用的AS濃度各不同。本研究結(jié)果表明，在重懸液中添加150 μmol/L AS時，最適宜蝴蝶蘭的遺傳轉(zhuǎn)化。

該實驗獲得蝴蝶蘭花瓣瞬時轉(zhuǎn)化最適宜共培養(yǎng)天數(shù)為3 d。將蝴蝶蘭遺傳轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)時間延長到5～7 d不會增加GUS瞬時活性，但會引起細(xì)胞壞死，這與Belarmino等[20]的研究是一致的。

蝴蝶蘭花色基因功能驗證的研究較少，主要受遺傳轉(zhuǎn)化效率低和遺傳轉(zhuǎn)化周期長的限制。韓穎穎[21]克隆到3個新的蝴蝶蘭CHS基因，初步驗證PhCHS5特異地在花瓣和唇瓣中表達，在模式植物煙草中轉(zhuǎn)化PhCHS3的外顯子2序列，獲得花瓣顏色加深的轉(zhuǎn)基因植株。而未在蝴蝶蘭中進一步驗證基因的功能。根據(jù)前人研究推測，CHS基因位于類黃酮生物合成途徑的起始位置，是決定類黃酮合成的分子開關(guān)[22]。使用反義抑制、共抑制、RNAi等分子生物學(xué)技術(shù)手段來下調(diào)基因的表達，從而改變花色素代謝途徑的方式已廣泛應(yīng)用。在野生型煙草中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥CHSRNAi干擾載體后，得到花色變淺的轉(zhuǎn)基因煙草[23]。Aida等將CHS反義基因轉(zhuǎn)化夏堇，獲得花色變淡的新品種[24]。Courtney-Gutterson等[25]將菊花CHS基因與CaMV35S啟動子正向或反向連接,轉(zhuǎn)化菊花產(chǎn)生白花植株。以上研究從不同的側(cè)面證明，當(dāng)CHS活性被強烈抑制時，花青素的合成被阻斷，花色變淺甚至完全變?yōu)榘咨玔26]。本研究利用該體系證實了推測，在花瓣中快速檢測了CHS基因功能，和Liu等[27]研究結(jié)果相似，失活文心蘭的CHS導(dǎo)致花器官不能積累花色素苷。該體系可快速在蝴蝶蘭花器官中檢測基因功能，為后期定向改良花色提供技術(shù)支持。