仇 亮，朱勝琪，王永鑫，馮 凱，劉潔霞，熊愛生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，南京 210095)

水芹[Oenanthejavanica(Blume) DC.]為傘形科水芹屬多年生草本植物，常見于長江中下游地區(qū)，是重要的水生蔬菜[1]。水芹既可食用又具有藥用價值[2]。除富含人體所需的營養(yǎng)元素外，水芹還富含抗壞血酸、維生素、膳食纖維、芹菜素、黃酮類化合物等多種成分，對人體具有很好的保健功能，可以降壓安神、增強人體對外在環(huán)境的免疫能力、防治心腦血管等疾病[3]。

木質(zhì)素是植物中肉桂醇脫氫聚合產(chǎn)生的酚類高分子聚合物，為沉積在高等植物特定細(xì)胞壁中第二豐富的天然化合物，是植物細(xì)胞壁的重要組成成分[4]。木質(zhì)素的疏水特性使細(xì)胞壁不易透水，可以保證水分的長距離運輸，提高植株的物質(zhì)運輸能力[5]。木質(zhì)素的生物合成過程可以總結(jié)為苯丙氨酸或酪氨酸在一系列酶的催化下，逐步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素單體，最終聚合成木質(zhì)素的過程[6]。肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)參與木質(zhì)素特異合成途徑下游酶類的調(diào)控，是一類重要的限速酶[7]。木質(zhì)素作為膳食纖維的重要組成部分，能改善人體健康狀況，降低一些疾病的風(fēng)險，但含量增加后，植株細(xì)胞壁會加厚，植物組織變得木質(zhì)化，很大程度上會影響蔬菜口感。作為以幼嫩葉和莖為主要食用部位的水芹，木質(zhì)素含量對其品質(zhì)有較大的影響[8]。

目前，相對于模式植物和大田作物而言，水芹的分子生物學(xué)研究相對滯后。本試驗選用‘八卦洲水芹’及其紫色葉柄突變型‘南選八卦洲紫水芹’為材料，從水芹中克隆得到1個編碼肉桂醇脫氫酶的基因OjCAD，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并利用熒光定量PCR技術(shù)分析了OjCAD基因在‘八卦洲水芹’和‘南選八卦洲紫水芹’葉片和葉柄中的表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究水芹木質(zhì)素合成途徑及OjCAD響應(yīng)機制提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

本實驗以‘八卦洲水芹’和紫色葉柄突變型水芹‘南選八卦洲紫水芹’為植物材料[9]，于2017年2月下旬種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室人工氣候室，生長條件為：25 ℃光照12 h/20 ℃黑暗12 h，光照強度300 μmol·m-2·s-1。在水芹生長至抽薹后取樣，樣品用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于總RNA的提取。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α保存于本實驗室，pMD19-T質(zhì)粒載體、ExTaqDNA聚合酶、Prime Script RT reagent Kit試劑盒等為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成將所取的水芹樣品利用RNA Simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒提取總RNA(北京Tiangen公司)，并按照 Prime Script RT reagent Kit試劑盒說明書提取水芹總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2水芹肉桂醇脫氫酶基因的克隆根據(jù)本課題組的水芹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[10]，檢索得到水芹OjCAD基因，并對OjCAD序列進(jìn)行克隆分析。利用Primer Premier 6軟件設(shè)計1對克隆引物，OjCAD-F(ATGACGCAAACAACTCCCAA)和OjCAD-R(CTATGGTTTTCCAGCAATGT)。以水芹cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。擴增體系總體積10.0 mL，包括0.30 ng·mL-1cDNA模板0.5 mL、2 × TaKaRaExTaq Mix (產(chǎn)品編號RR001A) 5.0 mL、雙蒸水3.5 mL、0.10 mmol·L-1正向引物和反向引物各0.5 mL。擴增的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，共34個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。將反應(yīng)所得產(chǎn)物用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離并回收?；厥债a(chǎn)物連接到pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，菌液檢測后送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定。

1.2.3序列分析通過DNAMAN 6.0軟件確定基因的開放閱讀框(ORF)序列，翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列后進(jìn)行氨基酸序列的親水性和疏水性分析。利用 NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastp進(jìn)行同源比對和保守域預(yù)測，采用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹[11]。不同物種CAD蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)分析均在ExPASy (http://www.expasy.org)上完成[12]。利用CPHmodels 3.2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/) 進(jìn)行空間建模分析。

1.2.4基因表達(dá)特性分析根據(jù)OjCAD基因測序結(jié)果，使用Real-time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-rad, CFX96, USA)在96孔板中進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以水芹actin基因作為熒光定量數(shù)據(jù)處理的內(nèi)參基因[13]，利用Primer Premier 6軟件設(shè)計熒光定量PCR上游引物(5′-CTGGATTCTGGTGATGGT-3′)和下游引物(5′-GCAGTTGTTGTGAAGGAG-3′)。根據(jù)擴增基因的序列設(shè)計表達(dá)檢測上游引物(5′-CAGGCACAATCACTCCTTACG-3′)和下游引物(5′-TCACACTTCAAACACGACGC-3′)。反應(yīng)采用20 mL體系，每個PCR反應(yīng)物體系中包含2.0 mL稀釋15倍的cDNA，0.4 mL上下游熒光定量引物，10 mL SYBR Green I mix和7.2 mL ddH2O。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 退火延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。每個PCR反應(yīng)重復(fù)3次，分析3個重復(fù)。使用Excel軟件進(jìn)行不同組織內(nèi)表達(dá)水平的分析，CAD基因在水芹不同品種葉片和葉柄中相對表達(dá)量的計算采用2-ΔΔCT方法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水芹OjCAD基因的克隆

提取正常生長的水芹植株葉的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以此為模板，利用OjCAD-F和OjCAD-R引物進(jìn)行PCR擴增，獲得1 000 bp左右的擴增片段。測序結(jié)果顯示，水芹的OjCAD基因包含一個長度為1 074 bp開放閱讀框(ORF)，編碼357個氨基酸(圖1)。其中，堿基A、T、G、C的總量分別為305、276、272和221個，分別占總堿基數(shù)的28%、26%、25%和21%。

2.2 水芹OjCAD蛋白的進(jìn)化分析

利用 MEGA 5.0 軟件繪制CAD蛋白在不同物種間的進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示，水芹OjCAD蛋白與傘形科的胡蘿卜(Daucuscarota)CAD蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，其次是地星(Dorcocerashygrometricum)；水芹的OjCAD蛋白與芝麻(Sesamumindicum)、甜櫻桃(Prunusavium)和藜麥(Chenopodiumquinoa)CAD蛋白進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。水芹的OjCAD蛋白與同為傘形科的胡蘿卜在同一分支上，表明CAD蛋白的氨基酸序列在同科植物的進(jìn)化中比較保守。

*. 終止密碼子圖1 水芹OjCAD基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列*. Stop codonFig.1 The nucleotide and putative amino acid sequences of OjCAD gene from O. javanica

括號內(nèi)為氨基酸登錄號；其他物種來源的CAD氨基酸序列皆來源于NCBI數(shù)據(jù)庫；標(biāo)尺表示遺傳距離圖2 水芹與其他物種CAD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹The accession No. was given in brackets; The amino acid sequences of CAD proteins from other species were derived from NCBI database; The scale bar represents genetic distanceFig.2 Phylogenetic tree of CAD protein from O. javanica and other species

2.3 不同物種CAD蛋白氨基酸序列比對與氨基酸理化性質(zhì)分析

利用NCBI對水芹CAD蛋白序列進(jìn)行Blastp檢索，結(jié)果表明，克隆得出的水芹CAD蛋白具有一個典型的CAD1結(jié)構(gòu)域，此外還包含CAD特征性的2個Zn結(jié)合位點(圖3)，與CAD酶學(xué)功能相符，屬于MDR超級家族。選取來源于巴西橡膠樹、菠菜、地星、藜麥、榴蓮、葡萄、甜櫻桃、胡蘿卜、長春花、芝麻的CAD蛋白，與水芹OjCAD蛋白進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(圖4)。結(jié)果顯示，水芹OjCAD蛋白序列與已被證實的另外10個物種的氨基酸序列一致性達(dá)到了85.75%。其中，水芹OjCAD蛋白序列與胡蘿卜CAD蛋白序列的一致性達(dá)到了95.24%，可見，水芹與同為傘形科的胡蘿卜親緣進(jìn)化關(guān)系極近。進(jìn)一步通過水芹和其他物種CAD氨基酸組成及理化性質(zhì)比較(表1)可以發(fā)現(xiàn)，這 11種植物CAD蛋白氨基酸數(shù)在357～366之間, 相對分子質(zhì)量均在3.9×104左右, 理論等電點在6.42～7.57之間,堿性氨基酸與酸性氨基酸數(shù)目相差不大, 脂肪族氨基酸比例較高, 芳香族較低, 蛋白質(zhì)可溶性預(yù)測中平均親水性在-0.164～-0.074之間。

圖3 水芹OjCAD氨基酸序列保守域預(yù)測Fig.3 Prediction of conserved domain of amino acid sequence of OjCAD from O. javanica

A. 水芹; B. 巴西橡膠樹; C. 菠菜; D. 地星; E. 藜麥; F. 榴蓮; G. 葡萄; H. 甜櫻桃; I. 胡蘿卜; J. 長春花; K. 芝麻；表1同。圖4 水芹與其他物種CAD氨基酸序列的多重比對A. O. javanica; B. Hevea brasiliensis; C. Spinacia oleracea; D. Dorcoceras hygrometricum; E. Chenopodium quinoa; F. Durio zibethinus; G. Vitis vinifera; H. Prunus avium; I. Daucus carota; J. Catharanthus roseus; K. Sesamum indicum；The same as Table 1Fig.4 Multiple alignment of amino acid sequences of CAD from O. javanica and other species

表1 水芹及其他物種CAD氨基酸組成及理化性質(zhì)比較

注：BA. 堿性氨基酸; AC. 酸性氨基酸; AR. 芳香族氨基酸; AL. 脂肪族氨基酸Note：BA. Basic amino acids; AC. Acidic amino acids; AR. Aromatic amino acids; AL. Aliphatic amino acids

圖5 水芹OjCAD蛋白氨基酸序列的疏水性和親水性分析Fig.5 Analysis of hydrophobicity and hydrophilicity of amino acid sequence of OjCAD protein from O. javanica

2.4 水芹OjCAD氨基酸親疏水性分析

利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行蛋白親水性疏水性分析，結(jié)果顯示，水芹OjCAD氨基酸位于第189位的異亮氨酸疏水性最強，位于第221的賴氨酸和223位的丙氨酸親水性最強。從總體來看，水芹OjCAD屬于疏水性蛋白(圖5)。

圖6 水芹OjCAD蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure of OjCAD protein from O. javanica

2.5 水芹OjCAD蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析

通過CPHmodels 3.2 Server對水芹OjCAD蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測及分析，以PDB ID: 1YQD.A為模型對OjCAD蛋白序列進(jìn)行同源建模，其一致性為58.7%。結(jié)果顯示，水芹OjCAD蛋白結(jié)構(gòu)主要由7個α-螺旋和17個β-折疊組成(圖6)。

2.6 OjCAD基因在紫色和非紫色水芹葉片和葉柄中的表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法對‘八卦洲水芹’和‘南選八卦洲紫水芹’的葉片和葉柄中OjCAD基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。如圖7所示，OjCAD基因在紫色和非紫色水芹葉片和葉柄中的表達(dá)量有明顯的差異。其中，OjCAD基因在‘八卦洲水芹’中的相對表達(dá)量是‘南選八卦洲紫水芹’的2倍；OjCAD基因在葉片中的表達(dá)量相對較高，且品種差異顯著，而在葉柄中的表達(dá)量極低，且品種間無顯著差異。

圖7 OjCAD基因在水芹葉片與葉柄中的相對表達(dá)量Fig.7 The relative expression levels of OjCAD gene in the leaf blades and petioles of O. javanica

3 討 論

在高等植物中，木質(zhì)素是細(xì)胞壁的基本組成成分，對植物具有形態(tài)塑成、機械強度支撐等重要作用[15]。在蔬菜中，木質(zhì)素常與纖維素、半纖維素互相連接，形成天然屏，阻止各種病原菌的侵入，增強植物應(yīng)對干旱、病害等環(huán)境脅迫的能力，對植物抗病蟲和抗逆性等有很大的影響[16]。適宜的木質(zhì)素含量對于蔬菜作物的品質(zhì)很重要，尤其是葉菜類蔬菜。有研究表明，木質(zhì)素合成的增多會導(dǎo)致鴨兒芹食用器官木質(zhì)化，嚴(yán)重影響鴨兒芹的品質(zhì)[17]。水芹是中國重要的水生蔬菜，研究水芹木質(zhì)素生物合成，能更有效提高水芹的品質(zhì)，改善水芹的口感。

高等植物中，肉桂醇脫氫酶(CAD)作用于木質(zhì)素單體合成的最后一步，在植物木質(zhì)素生物合成中起著重要的作用。在黑麥草[18]、陸地棉[19]、高粱[20]等植物中都已獲得相關(guān)基因。在木質(zhì)素合成過程中，肉桂醇脫氫酶以NADPH為輔酶將肉桂醛還原成相應(yīng)的肉桂醇，合成不同的木質(zhì)素單體，是調(diào)控木質(zhì)素合成的關(guān)鍵控制點之一[21]。有研究證實，在擬南芥中將CAD4和CAD5這2個基因雙突變之后，擬南芥莖部柔軟，有倒莖現(xiàn)象，整個植株呈現(xiàn)倒伏狀。經(jīng)測定，其與野生型擬南芥相比，植株中的維管組織含量降低，木質(zhì)素含量下降了94%[22]。石榴種皮中的木質(zhì)素含量是影響石榴籽粒硬度的重要因子[23]，石榴肉桂醇脫氫酶基因PgCAD的表達(dá)量與種皮總木質(zhì)素含量呈正相關(guān)，PgCAD基因在石榴籽粒中表達(dá)量最高，肉桂醇脫氫酶對石榴籽粒的硬度起重要作用[24]。

水芹除了維生素和蛋白質(zhì)等含量很高外，還含有蕓香苷、水芹素和檞皮素等物質(zhì)。為保證其鮮嫩的口感，適當(dāng)降低葉和莖中的木質(zhì)素含量至關(guān)重要。本研究以本課題組水芹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從水芹中克隆獲得1個編碼肉桂醇脫氫酶的OjCAD基因。OjCAD氨基酸序列含有典型的CAD1結(jié)構(gòu)域，且具有特征性2個Zn結(jié)合位點[25]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，水芹OjCAD與同科植物胡蘿卜CAD具有最近的親緣關(guān)系。OjCAD氨基酸序列屬于MDR超級家族[26]。水芹與同一科植物CAD蛋白氨基酸理化性質(zhì)相近，同科植物的CAD蛋白同源性也較高。另外，有研究表明，在葉柄中，木質(zhì)素只能在維管束、厚角組織和表皮細(xì)胞中可以觀察到[27]。本研究熒光定量結(jié)果顯示，OjCAD在水芹葉片中的表達(dá)量高于葉柄，推測OjCAD基因在水芹木質(zhì)素合成中起重要作用。本研究結(jié)果為水芹木質(zhì)素的合成與調(diào)控等研究奠定了理論基礎(chǔ)。