王 巖 吳同俊 滕晶晶 楊同金 馮學(xué)慶 夏 新

丙氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是人體的非必需氨基酸，在生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，與丙酮酸相互轉(zhuǎn)化，參與機(jī)體葡萄糖循環(huán)過(guò)程。丙氨酸分為α-丙氨酸/L-丙氨酸，DL-丙氨酸是α-丙氨酸的外消旋體，由等量的左旋體和右旋體構(gòu)成，無(wú)旋光性[1]，為白色透明晶體狀顆粒，無(wú)臭無(wú)味，鮮味良好，通常作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑、調(diào)味料應(yīng)用于食品工業(yè)中[2]，即可單獨(dú)作為甜味劑來(lái)增強(qiáng)化學(xué)調(diào)味料的調(diào)味效果，也可與谷氨酸鈉等制成復(fù)合調(diào)味品，在醫(yī)藥工業(yè)上是生產(chǎn)維生素B6和合成氨基丙醇的主要原料。目前，DL-丙氨酸生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)合成法、直接發(fā)酵法及消旋酶法[3-5]。消旋酶法是以L-丙氨酸為原料的酶催化反應(yīng)，提取工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，產(chǎn)品收率高，具有良好的應(yīng)用前景。本研究依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB15193-2014)[6-8]，擬采用小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)對(duì)消旋酶法DL-丙氨酸的遺傳毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 消旋酶法DL-丙氨酸(安徽華恒生物公司，AA0415042303)，純度≥99.0%。實(shí)驗(yàn)時(shí)，消旋酶法DL-丙氨酸經(jīng)充分研磨成粉末后用純水配制成10 000、5 000和2 500 mg/kg。

1.1.2 主要試劑 大鼠肝臟微粒體酶S9(齊氏生物公司，20160406)、Dexon(敵克松)(Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，40709)、疊氮鈉(Sigma公司，04202DJ)、2-AF(Sigma-Aldrich公司，00405JD)、1,8-二羥蒽醌(TCI公司，F(xiàn)HF01-LTMJ)、2-氨基蒽(TCI公司，7GCCI-P0)。環(huán)磷酰胺(Alfa Aesar公司，K06R045)、秋水仙素(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20140423)

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠80只(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：34000200000776和34000200000825，SPF級(jí)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(皖)2013-006)，體質(zhì)量25～35 g，周齡7～12周，溫度20～25℃，濕度40%～70%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)至少3 d，自由飲水、攝食(灌胃前受試動(dòng)物隔夜禁食)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)用菌 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535(Molecular Toxicology公司)，正式實(shí)驗(yàn)前經(jīng)生物學(xué)鑒定特性符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 選取50只昆明小鼠，雌雄各半，按性別采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分5組，每組10只。依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB15193.5-2014)[6]設(shè)消旋酶法DL-丙氨酸10 000、5 000和2 500 mg/kg 3個(gè)劑量組、陰性對(duì)照組(純水)和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(40 mg/kg，一次性腹腔注射給藥)。間隔24 h 2次經(jīng)口灌胃染毒，在第2次給藥6 h后，取胸骨骨髓制片，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)2 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocyte,PCE)，計(jì)數(shù)有微核的PCE并計(jì)算微核細(xì)胞率(微核細(xì)胞率=微核細(xì)胞數(shù)/PCE數(shù)×1000‰)。

1.2.2 小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn) 選取30只雄性昆明小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分6組，每組5只。依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB15193.8-2014)[7]設(shè)消旋酶法DL-丙氨酸10 000、5 000和2 500 mg/kg 3個(gè)劑量組、陰性對(duì)照組(純水)和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(40 mg/kg，一次性腹腔注射給藥)，其中10 000 mg/kg組設(shè)24 h組和48 h組。采用經(jīng)口灌胃一次染毒法，10 000 mg/kg組分別于染毒后24 h和48 h處死各組動(dòng)物取材，其余各劑量組均在染毒后24 h取樣。動(dòng)物處死前4 h，腹腔注射秋水仙素4 mg/kg，取兩側(cè)睪丸，剔除脂肪，1%檸檬酸三鈉低滲，甲醇-冰乙酸固定，60%冰乙酸軟化后，染色制片。尋找清晰且分散良好的染色體中期分裂相檢查，每只動(dòng)物分析100個(gè)中期分裂相，記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)改變情況，并計(jì)算畸變細(xì)胞率(畸變細(xì)胞率=畸變細(xì)胞數(shù)/中期分裂相細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.3 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames實(shí)驗(yàn)) 依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB15193.8-2014)[8]，設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和5個(gè)消旋酶法DL-丙氨酸劑量組。以3.16倍和5倍為組間距，2次實(shí)驗(yàn)消旋酶法DL-丙氨酸劑量分別設(shè)50、158、500、1 580、5 000 μg/皿和8、40、200、1 000、5 000 μg/皿。在加代謝活化系統(tǒng)(S9混合液)時(shí)選用1,8-二羥蒽醌、2-氨基蒽和2-AF做陽(yáng)性物，不加S9混合液時(shí)選用敵克松和疊氮鈉做陽(yáng)性物。實(shí)驗(yàn)采用平板摻入法，分別在加和不加S9混合液的條件下進(jìn)行，每組各做3皿，計(jì)數(shù)每皿的回變突變菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果 消旋酶法DL-丙氨酸10 000 mg/kg、5 000 mg/kg和2 500 mg/kg組PCE微核率與陰性對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果 消旋酶法DL-丙氨酸10 000 mg/kg、5 000 mg/kg和2 500 mg/kg組動(dòng)物睪丸精原細(xì)胞染色體畸變率、畸變細(xì)胞率與陰性對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與陰性對(duì)照組比較

表2 消旋酶法DL-丙氨酸對(duì)小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變率和畸變細(xì)胞率的影響

注：與陰性對(duì)照組比較

2.3 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)平皿菌苔生長(zhǎng)良好，無(wú)明顯可見(jiàn)的沉淀痕跡，對(duì)照組每皿回變數(shù)均在正常范圍，陽(yáng)性對(duì)照組兩次測(cè)試各菌株的回復(fù)突變數(shù)均大于對(duì)照組的2倍以上。消旋酶法DL-丙氨酸各劑量組及溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，兩次測(cè)試各測(cè)試菌株的回復(fù)突變數(shù)均小于對(duì)照組2倍，各劑量組之間無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，測(cè)試結(jié)果均為陰性。見(jiàn)表3～6。

表3 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(第1次，-S9)個(gè))

表4 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(第1次，+S9)個(gè))

表5 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(第2次，-S9)個(gè))

表6 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(第2次，+S9)個(gè))

3 討論

甜味劑是能使食物具有甜味的非糖類(lèi)物質(zhì)，作為一大類(lèi)食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，具有品種多、數(shù)量大、應(yīng)用廣等特點(diǎn)，但其安全性問(wèn)題也一直是社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)[9]，隨著研究的深入，各種甜味劑的毒性效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飲用阿斯巴甜飲料能顯著增加患淋巴瘤和白血病危險(xiǎn)性[10]，王虹等[11]研究發(fā)現(xiàn)甜蜜素和蛋白糖對(duì)于小鼠有致突變作用，精子畸形率和骨髓微核率均顯著高于對(duì)照組。消旋酶法DL-丙氨酸作為一種新型的食品添加劑，不僅可以作為甜味劑，也可用于營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和調(diào)味品，由于其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備投資少、三廢排放少，使其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用成為可能[12]。

本研究結(jié)果表明，各劑量消旋酶法DL-丙氨酸沒(méi)有對(duì)骨髓紅細(xì)胞造成明顯的抑制作用，未見(jiàn)其對(duì)小鼠體細(xì)胞或生殖細(xì)胞具有遺傳毒性或致突變作用，且無(wú)論是否存在代謝活化系統(tǒng)，消旋酶法DL-丙氨酸對(duì)五組組氨酸缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 均未顯示出任何致突變作用，前期急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示消旋酶法DL-丙氨酸對(duì)大、小鼠急性經(jīng)口LD50雌、雄性均大于10 000 mg/kg，屬實(shí)際無(wú)毒類(lèi)，可以認(rèn)為消旋酶法DL-丙氨酸作為一種食品添加劑是基本安全的，與國(guó)內(nèi)研究[13]基本一致。陳耿等[14]對(duì)發(fā)酵法L-丙氨酸進(jìn)行了90天經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌、雄大鼠實(shí)際攝入的最大未觀察到有害作用劑量分別為5.56、4.58 g /kg ( 分別相當(dāng)于推薦劑量的332 和274 倍) ，對(duì)于消旋酶法DL-丙氨酸廠家提供的成人推薦劑量(1.0 g/d)長(zhǎng)期使用是否安全還需進(jìn)行亞急性、亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步評(píng)估其安全性。