鄭丹，張清峰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌,330045)

落新婦苷(圖1)是一種廣泛存在于植物及其加工食品中的功能性黃酮成分，如龜苓膏[1]、葡萄(葡萄酒)[2]，土茯苓[3]，羅漢茶[4]，貫葉連翹[5]，草珊瑚[6]等。研究表明落新婦苷有多種生物活性,可顯著抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)、膠原性關(guān)節(jié)炎以及免疫性肝損傷[7-8],并可加快小鼠脂肪組織中甘油三酯分解速率[9],及抑制膽固醇合成限速酶HMG-CoA還原酶的活性[10]。落新婦苷具有很強(qiáng)的抗氧化能力[11]，可顯著降低小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化水平和提高SOD活性，護(hù)肝效果強(qiáng)于VE[12]。

圖1 落新婦苷的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structure of astilbin

食物中的功能性黃酮成分通過(guò)腸黏膜吸收進(jìn)入血液循環(huán)后，會(huì)與血清白蛋白發(fā)生可逆性的結(jié)合，從而對(duì)黃酮在體內(nèi)的分布與代謝產(chǎn)生重要影響[13]。由于牛血清白蛋白(BSA)具有與人血清白蛋白相似的序列和構(gòu)型，因此常作為研究黃酮成分與蛋白相互作用的首選底物。如MA等通過(guò)光譜技術(shù)研究了7種黃酮類(lèi)化合物與BSA的相互作用[14]；HOU等研究了4種甘草類(lèi)黃酮與BSA的相互作用[15]。然后，到目前為止，尚未見(jiàn)落新婦苷與BSA相互作用的研究報(bào)道。本文通過(guò)研究不同條件下落新婦苷對(duì)BSA熒光光譜的影響，并計(jì)算了兩者結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)，從而為了解兩者間的相互作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

落新婦苷由本實(shí)驗(yàn)室從土茯苓中提取純化，經(jīng)過(guò)UV、IR、MS、NMR鑒定，純度>98%。BSA購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。用超純水配制濃度為5 μmol/L的BSA溶液，用50%的甲醇配制濃度為1×10-3mol/L的落新婦苷母液，放置于4 ℃冰箱備用。用超純水配制pH=7.4的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(含0.1 mol/L NaCl)。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

970CRT型熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；恒溫循環(huán)水槽，北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司；微型pH計(jì)，杭州齊威儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將落新婦苷母液用Tris-HCl緩沖液稀釋10倍后，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于 5 mL比色管中，用5%甲醇補(bǔ)足至1 mL，再各加入1mL BSA溶液，最后用Tris-HCl緩沖液定容至5 mL。搖勻后放置30 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為282 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為280～450 nm，靈敏度為2，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm。同步熒光譜條別設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為265～365 nm和220～320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍均為280～380 nm,使得波長(zhǎng)偏移(Δλ)分別為15 nm和60 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值，使用Origin 7.0 (Origin Lab Co., Northampton,MA, USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、計(jì)算、繪圖和曲線(xiàn)擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 落新婦苷對(duì)BSA熒光光譜的影響

BSA中含有色氨酸殘基，可以發(fā)射熒光。圖2為BSA的熒光發(fā)射光譜，BSA的最大激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為342 nm。加入落新婦苷會(huì)使BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低，即發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，并使其最大發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)至355 nm，說(shuō)明二者有相互作用。熒光淬滅機(jī)制可分為靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅，可根據(jù)Stern-Volmer方程(公式1)中淬滅率常數(shù)和溫度的關(guān)系來(lái)區(qū)別[16]。

F0/F=1+Ksvcq=1+kqτ0cq

(1)

式中：F0和F分別表示加入落新婦苷前后BSA的熒光強(qiáng)度；Ksv表示淬滅常數(shù)，單位為L(zhǎng)/m；cq表示落新婦苷的濃度，單位為mol/L；kq表示淬滅率常數(shù)；τ0表示熒光團(tuán)的壽命，一般是10-8s。靜態(tài)淬滅的kq會(huì)隨溫度的升高而降低，而動(dòng)態(tài)淬滅的kq會(huì)隨溫度的升高而增加，故可根據(jù)Stern-Volmer方程測(cè)定不同溫度下落新婦苷對(duì)BSA熒光的淬滅率常數(shù)kq來(lái)判斷其淬滅機(jī)制。如圖3-A和表1所示，在溫度280、290、300 K下，其相對(duì)應(yīng)的kq分別為5.510 、5.278和5.174×1012L/(mol·s)。本研究中kq隨著溫度的升高而降低，表明落新婦苷對(duì)BSA的熒光淬滅是一個(gè)靜態(tài)淬滅過(guò)程。此外，如果小分子客體對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的熒光淬滅為動(dòng)態(tài)淬滅機(jī)制，kq值通常會(huì)小于2×1010L/(mol·s)[17]。

1～9中落新婦苷的濃度為別為0, 2，4，6，8, 10, 12，14，16，18 μmol/L圖2 落新婦苷對(duì)BSA熒光發(fā)射光譜的影響Fig.2 The effect of astilbe on fluorescence emission spectra of BSA

另外，改變BSA濃度為0.5、1、1.5、2 μmol/L，根據(jù)Stern-Volmer方程測(cè)定290 K條件下落新婦苷對(duì)BSA熒光的淬滅率常數(shù)kq，結(jié)果如圖3-B和表1所示，kq隨著B(niǎo)SA濃度的增加而增大，從而進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的相互作用是一個(gè)靜態(tài)淬滅的過(guò)程[18]。

A-不同溫度的影響, BSA濃度為1 μmol/L;B-BSA濃度的影響, 溫度為290 K圖3 Stern-Volmer方程擬合曲線(xiàn)Fig.3 Stern-Volmer equation fitted curve

T/Kkq×10-12/[L·(mol·s)-1]RBSA/(μmol·L-1)kq×10-12/[L·(mol·s)-1]R2805.5100.9930.54.1390.9882905.2780.9921.05.2780.9923005.1740.9691.55.3530.9912.05.5000.997

2.2 落新婦苷與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

對(duì)于一個(gè)靜態(tài)淬滅過(guò)程，可通過(guò)公式(2)來(lái)計(jì)算落新婦苷與BSA之間的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[14]。

(2)

圖4 不同溫度下對(duì)lgCq的線(xiàn)性圖Fig.4 The linear graphs of and lgCq

T/KlgKanRΔG/(kJ·mol-1)ΔH/(kJ·mol-1)ΔS[J·(mol·K)-1]2804.490.950.993-24.072904.670.990.980-25.9320.98161.23004.751.000.992-27.28

熱力學(xué)參數(shù)包括焓變(ΔH)、熵變(ΔS)、自由能變化(ΔG)。根據(jù)范特霍夫方程ΔG=ΔH-TΔS及ΔG=-RTlnKa，將lnKa對(duì)1/T做圖并線(xiàn)性回歸可計(jì)算得到ΔH和ΔS。如表2所示，ΔG<0，表明落新婦苷與牛血清蛋白的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的。ROSS等總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律如下[19]：(1)ΔS>0疏水和靜電作用力；(2)ΔS<0氫鍵和范德華力；(3)ΔH>0、ΔS>0典型的疏水作用力；(4)ΔH<0、ΔS<0氫鍵和范德華力；(5)ΔH<0、ΔS>0靜電作用力。本研究中ΔH>0、ΔS>0，表明疏水作用力在落新婦苷與牛血清蛋白的結(jié)合反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。

2.3 常見(jiàn)離子對(duì)落新婦苷與BSA相互作用的影響

同時(shí)，也研究這些常見(jiàn)離子對(duì)落新婦苷的紫外吸收光譜的影響，結(jié)果如圖5所示。圖中各離子不改變落新婦苷的紫外吸收光譜，說(shuō)明這些離子不與落新婦苷發(fā)生螯合作用。

表3 常見(jiàn)離子對(duì)落新婦苷與BSA相互作用的影響Table 3 The effect of common ions on the interaction between astilbe and BSA

圖5 常見(jiàn)離子對(duì)落新婦苷紫外吸收光譜的影響Fig.5 The effects of common ions on the ultraviolet absorption spectra of astilbe

2.4 同步熒光譜

同步熒光譜是掃描過(guò)程中使激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)間保持固定的波長(zhǎng)間隔(Δλ)，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)與對(duì)應(yīng)發(fā)射波長(zhǎng)構(gòu)成光譜圖，它可以反映熒光基團(tuán)外部微環(huán)境的變化。BSA蛋白中主要的熒光基團(tuán)為色氨酸和酪氨酸殘基。設(shè)定Δλ為15 nm時(shí)，同步熒光譜可以反映酪氨酸殘基的特征信息；當(dāng)Δλ為60 nm時(shí)，同步熒光譜可以反映色氨酸殘基的特征信息。如圖6所示，固定BSA蛋白濃度，隨著落新婦苷濃度的升高，同步熒光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酪氨酸殘基的熒光很弱(Δλ=15 nm)，且色氨酸殘基的熒光降低速度(Δλ=60 nm)遠(yuǎn)快于酪氨酸殘基，說(shuō)明色氨酸殘基是落新婦苷猝滅BSA內(nèi)源熒光的主要作用位點(diǎn)。同時(shí)，色氨酸殘基的同步熒光光譜圖峰位位置發(fā)生了明顯的紅移，最大發(fā)射波長(zhǎng)從341 nm紅移至343 nm。這表明落新婦苷對(duì)色氨酸殘基附近微環(huán)境產(chǎn)生影響，同步熒光光譜峰位紅移說(shuō)明BSA色氨酸殘基附近疏水環(huán)境的極性增大，并且使得肽鏈的伸展程度有所增加[20]。

A: Δλ=15 nm；B: Δλ=60 nm。BSA濃度為1 μmol/L，1～9中落新婦苷的濃度為別為0, 2，4，6，8,10,12，14，16，18 μmol/L圖6 同步熒光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra

3 結(jié)論

落新婦苷可與BSA結(jié)合，并通過(guò)靜態(tài)淬滅機(jī)制淬滅BSA內(nèi)源熒光。280K時(shí)，落新婦苷與BSA結(jié)合常數(shù)的lgKa為4.496 3，焓變和熵變等熱力學(xué)參數(shù)說(shuō)明疏水作用力在兩者的相互作用中發(fā)揮重要的作用。Ca2+、Mg2+、K+、SO42-及NO2等常見(jiàn)離子對(duì)落新婦苷與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)影響很小。同步熒光光譜研究表明色氨酸殘基是落新婦苷猝滅BSA內(nèi)源熒光的主要作用位點(diǎn)，落新婦苷會(huì)使BSA色氨酸殘基附近疏水微環(huán)境的極性增大。