賈東旭，王騰，孫嘉誠，金利群，廖承軍，陳德水，王紅艷

1(浙江工業(yè)大學，浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室，浙江 杭州，310014) 2(浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江 開化，324032)

D-葡萄糖和D-果糖分別是自然界分布最廣和甜度最大的單糖，兩者互為同分異構體,混合，可制得高果糖漿(high fructose corn syrup，HFCS)。根據(jù)果糖質(zhì)量分數(shù)的不同，HFCS分為HFCS-90、HFCS-42和HFCS-55[1]。其中，HFCS-55的口感和甜度更適用于工業(yè)應用[2]。

葡萄糖異構酶(EC 5.3.1.5，glucose isomerase，GI)，可催化D-葡萄糖異構化為D-果糖，是生產(chǎn)HFCS最重要的商業(yè)酶[3]。伴隨HFCS日益膨脹的市場需求，需要研制熱穩(wěn)定性更好并可以循環(huán)使用的新型GI酶制劑。固定化酶(細胞)是20世紀崛起并已成功應用于多種酶的工業(yè)化實用技術，經(jīng)固定化的酶或細胞的半衰期和操作穩(wěn)定性會有很大提升，便于填充床連續(xù)反應和催化劑的回收再使用[4]。

GI異構化過程中，高溫有利于推動反應平衡向果糖方向進行，本實驗室已通過基因挖掘技術篩選到新型耐高溫酶ThermusoshimaiGI(ToGI)，于85 ℃保溫48 h，仍保留80%以上酶活，熱穩(wěn)定性顯著優(yōu)于已有耐高溫酶[9]?；诖耍瑢ふ疫m用于ToGI的固定化方法成為當務之急。有報道指出，三羥甲基磷[P(CH2OH)3](THP)，是一種可以替代GLU使用的交聯(lián)劑，其與氨基物質(zhì)交聯(lián)形成P—CH2—N鍵，該鍵在高溫下非常穩(wěn)定[8]。該交聯(lián)劑已用于固定化脂肪酶[10]、α-葡萄糖苷酶[11]和β-半乳糖苷酶[12]，各固定化產(chǎn)物的相對酶活或熱穩(wěn)定性較游離酶都明顯提高。

此外，固定化材料的理化性質(zhì)同樣影響固定化產(chǎn)物的性能，廉價易得、對酶無損害、可提高酶穩(wěn)定性、能延長固定化酶的使用周期等都應該是固定化材料的選擇準則[13]。固定化過程中，各條件因素的變化也會影響固定化產(chǎn)物的催化性能[14]。因此，需要對影響固定化的關鍵因素，如細胞裝載量、絮凝劑和交聯(lián)劑的使用量進行研究。

本研究首次詳細優(yōu)化了THP交聯(lián)固定耐高溫ToGI的過程，首先確定固定化所用的最佳材料，如載體、絮凝劑和THP交聯(lián)劑類型等；此后，進一步優(yōu)化了固定化過程的條件因素，如絮凝和交聯(lián)時間、金屬離子摩爾濃度等，以確定最優(yōu)固定化方法，最終實現(xiàn)高溫連續(xù)制備高果糖濃度HFCS。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達ToGI的重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI由本實驗室構建并保存[15]。

卡那霉素(Kan)購于上海生工生物工程股份有限公司；D-葡萄糖、80%(質(zhì)量分數(shù))四羥甲基氯化磷水溶液(THPC)、75%(質(zhì)量分數(shù))四羥甲基硫酸磷水溶液(THPS)、各種分子質(zhì)量(600～70 000 Da)的聚乙烯亞胺(PEI)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D-果糖購于北京索萊寶科技有限公司；各種粒徑(9.6～36.8 μm)的硅藻土(DE)購自百靈威科技有限公司；其他實驗試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；超凈工作臺，蘇州中亞凈化設備有限公司；5 L立式發(fā)酵罐，上海保興生物器材有限公司；高速冷凍離心機，美國Beckman公司；電熱恒溫水浴鍋，德國Julobo公司；高效液相色譜，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基與靜息細胞的制備

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10(固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨15、酵母粉12、NaCl 10、甘油12、KH2PO41.5、(NH4)2SO45、K2HPO4(3H2O 2.3、MnCl23.8。

補料培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨75、酵母粉50、甘油500、KH2PO46.75、(NH4)2SO45、Na2HPO43、H2O 3、檸檬酸3。

將重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/ToGI接種至含100 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)10 h，獲得種子液；將100 mL種子液接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于37 ℃、500 r/min、1.33 vvm和0.05 MPa罐壓條件下發(fā)酵3.5 h，過程中流加2 mol/L磷酸和25%(體積分數(shù))氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0；當發(fā)酵至罐內(nèi)溶氧上升時，流加200 mL補料培養(yǎng)基；將發(fā)酵罐溫度降至28 ℃，加入質(zhì)量濃度為10 g/L的乳糖誘導表達10 h，離心收集濕菌體，即為含ToGI基因的濕菌體細胞(簡稱重組ToGI細胞)。

1.3.2 初始固定化方法

制備THP水溶液：按THPC和KOH摩爾比1∶0.995的配制原則[12]，將15 g THPC(或32.6 g THPS)溶于90 mL ddH2O，再將3.4 g KOH溶于10 mL ddH2O，室溫條件下將兩者緩慢混合，制得THP水溶液。

在攪拌條件下，將5 g的重組ToGI細胞懸浮于50 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 7.0)，先加入0.3 g Celite 545載體，再加入2 mL體積分數(shù)為4%的PEI(分子質(zhì)量10 000 Da)母液，絮凝反應1.5 h，最后加入體積分數(shù)為0.5%的上述THP水溶液，交聯(lián)反應2 h。然后抽濾，濾餅用蒸餾水洗滌后用軸向擠壓機擠壓成長條狀，室溫風干后，粉碎成顆粒，得到含耐高溫ToGI固定化顆粒。

1.3.3 固定化載體、絮凝劑和交聯(lián)劑的選擇

以相對酶活為考察指標，進行如下實驗，確定最佳固定化材料。

(1)確定最佳固定化載體。按1.3.2，選擇不同粒徑9.6、19.6和36.8 μm的DE作為載體進行固定化，然后進行酶活測定。

(2)確定最佳絮凝劑。取上述最優(yōu)結果，分別選擇分子質(zhì)量為600、1 800、10 000和70 000 Da的PEI作為絮凝劑進行固定化，然后進行酶活測定。

(3)確定最佳交聯(lián)劑。取上述最優(yōu)結果，分別選擇THPC和THPS作為前體物質(zhì)制備THP用于固定化，然后進行酶活測定。

1.3.4 固定化條件研究

選用上述最優(yōu)固定化載體、絮凝劑和交聯(lián)劑，以酶活為考察指標，詳細優(yōu)化以下各條件，具體為：

(1)確定最佳細胞裝載量。選用細胞裝載量分別為3、4、5、6、7和8 g，其他同1.3.2，進行細胞固定化。

(2)確定Mn2+添加摩爾濃度。取上述最優(yōu)結果，在加入載體后，分別加入3、5、10、15和20 mmol/L Mn2+，其他同1.3.2，進行細胞固定化。

(3)確定PEI最佳體積分數(shù)。取上述最優(yōu)結果，選用PEI絮凝劑母液體積分數(shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%和6%，其他同1.3.2，進行細胞固定化。

(4)確定最佳絮凝時間。取上述最優(yōu)結果，選用絮凝時間分別為0、0.5、1、1.5、2和2.5 h，其他同1.3.2，進行細胞固定化。

(5)確定最佳THP體積分數(shù)。取上述最優(yōu)結果，設定所用THP體積分數(shù)分別為0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%，其他同1.3.2，進行細胞固定化。

(6)確定最佳交聯(lián)時間。取上述最優(yōu)結果，分別選用以下交聯(lián)時間1、1.5、2、2.5、3和3.5 h，其他同1.3.2，進行細胞固定化。

1.3.5 GI酶活測定

參照賈東旭等[16]，略做修改，測酶活體系包括：200 mmol/LD-葡萄糖、10 mmol/L Mg2+、1 mmol/L Co2+、0.25 g固定化產(chǎn)物(或細胞)，用50 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.0)補齊至5 mL。異構化反應于85 ℃反應20 min，置于冰上10 min終止反應，離心吸取上清液進行D-果糖的HPLC檢測。酶活定義：每min生成1 μmolD-果糖所需的酶量定義為1個活力單位U。

1.3.6 HPLC分析D-果糖和D-葡萄糖

色譜柱Hypersil NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(依利特分析儀器有限公司)。Waters 2414示差折光檢測器。柱溫30 ℃，流動相80%(體積分數(shù))乙腈，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。D-果糖和D-葡萄糖出峰時間分別為8.73和10.39 min。

1.3.7 固定化顆粒操作穩(wěn)定性研究

20 mL催化體系包括：50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 7.0)、1 100 mmol/LD-葡萄糖、8 mmol/L Mn2+、1 g固定化細胞顆粒。異構化反應于85 ℃反應2 h，反應液經(jīng)離心，少量上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾后用HPLC檢測D-果糖濃度；收集的THP固定化顆粒經(jīng)緩沖液洗滌，用于下一批的生物轉化。

2 結果

2.1 篩選固定化載體、絮凝劑和交聯(lián)劑

2.1.1 確定最佳DE類型

工業(yè)應用的固定化載體應廉價易得、對酶活力無過多損害。在各種有機和無機載體中，較為常用的有樹脂、殼聚糖、幾丁質(zhì)、DE和SiO2等[13]。其中，DE擁有吸附和抗溶脹的性能，可以改善固定化顆粒傳質(zhì)特性，是固定化GI最為常用的載體[15]。例如，張帆等以DE為載體，選擇殼聚糖絮凝-GLU交聯(lián)法固定ThermobifidafuscaGI所制成的固定化細胞酶活為2 579 U/g，酶活回收率達到70.5%[17]。本實驗考察不同粒徑DE對固定化細胞酶活的影響，結果如圖1所示。當使用的DE粒徑從9.6 μm增大至36.8 μm，固定化細胞的相對酶活提高了37.5%，并且，使用36.8 μm DE的固定化細胞酶活同樣優(yōu)于采用Celite 545的固定化產(chǎn)物的酶活。該現(xiàn)象的原因可能是高粒徑載體的比表面積與負載量大，能夠耦聯(lián)更多的酶細胞[18]。本實驗確定固定化DE的最佳粒徑為36.8 μm。

圖1 不同粒徑DE對固定化酶活的影響Fig.1 Effect of different diatomite on the activity of immobilized product

2.1.2 確定最佳PEI類型

固定化交聯(lián)之前，先加入多胺類物質(zhì)(PEI)作為絮凝劑，其伯胺基團會與后加的交聯(lián)劑反應，從而提高固定化產(chǎn)物的穩(wěn)定性[19]。例如，WILSON等在采用CLEAS法固定化脂肪酶時，先選用PEI進行絮凝，所制備的交聯(lián)酶聚集體表現(xiàn)出較高的有機溶劑耐受性[20]。但是，市售PEI的相對分子質(zhì)量不盡相同，因此，很有必要考察不同分子量的PEI作為絮凝劑對固定化產(chǎn)物酶活的影響。本實驗結果如圖2，當選用PEI分子質(zhì)量增大至70 000 Da，固定化細胞可以獲得最大相對酶活。原因是高分子量的PEI擁有更多分支[21]，其與交聯(lián)劑聯(lián)合使用會使細胞表面形成的聚合物膜包裹更加緊密，從而獲得更佳的固定化效果。本試驗確定絮凝劑PEI的最佳分子質(zhì)量為70 000 Da。

圖2 不同分子質(zhì)量的PEI對固定化酶活的影響Fig.2 Effect of PEI with different molecular weight on the activity of immobilized product

2.1.3 確定最佳交聯(lián)劑

THP是由四羥甲基磷化合物與堿類物質(zhì)(KOH)混合制備生成[12]。市場上能夠買到的四羥甲基磷化合物有THPS和THPC，前者的單價較低。因此，本實驗考察了兩者用于固定化對產(chǎn)物酶活的影響。由圖3可知，盡管兩者的有效成分相同，但與THPS制備的交聯(lián)劑相比，使用THPC制備的交聯(lián)劑所獲得的固定化細胞的相對酶活為95.7%。因此，結合固定化效果和成本兩因素，最終確定使用THPS制備THP交聯(lián)劑。另外，本實驗還考察了THP與傳統(tǒng)交聯(lián)劑GLU的固定化效果比較，結果顯示，經(jīng)GLU交聯(lián)的固定化細胞的相對酶活僅為85.4%，進一步說明THP與氨基物質(zhì)發(fā)生Mannich反應生成的P—CH2—N鍵有利于結合更多細胞。

圖3 不同交聯(lián)劑對固定化產(chǎn)物酶活的影響Fig.3 Effect of different crosslinker on the activity of immobilized product

2.2 固定化條件研究

2.2.1 確定細胞裝載量

載體的結合空間有限，當被過量含酶細胞占據(jù)時，底物和產(chǎn)物的擴散速率就會降低，這樣就限制固定化產(chǎn)物的催化能力，導致酶活降低[22]。因此，當載體定量，為了達到最佳固定化效果，需要優(yōu)化細胞裝載量。本研究考察3～8 g細胞裝載量對固定化酶活的影響，如圖4所示。

圖4 不同細胞裝載量對固定化酶活的影響Fig.4 Effect of different cell loading on the activity of immobilized product

當細胞量從3 g增加至6 g，固定化細胞的酶活隨之上升，當細胞量為6.0 g時，酶活達到最大107.9 U/g。細胞量繼續(xù)增加，酶活卻呈現(xiàn)下降趨勢，說明結合過量細胞導致載體通道堵塞，固定化產(chǎn)物酶活受到抑制[23]。因此，確定6 g細胞裝載量為最佳。

2.2.2 確定固定時Mn2+添加量

GI的活力及穩(wěn)定性與金屬離子有關，如Mg2+、Co2+和Mn2+對保持酶的有序構象、提高酶穩(wěn)定性和活力均有促進作用，而Fe3+、Ca2+則對催化反應起到抑制作用[7]。對于ToGI，本團隊已經(jīng)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時添加5 mmol/L Mn2+，能夠顯著提高ToGI酶活[9]。因此，在固定化過程中，本實驗繼續(xù)考察添加不同摩爾濃度的Mn2+對固定化細胞酶活的影響，實驗結果見圖5。當固定化過程中添加5 mmol/L Mn2+，固定化酶活升高至最大值110.3 U/g；當Mn2+摩爾濃度繼續(xù)增加至20 mmol/L，酶活已逐漸下降至94.3 U/g。酶活提高幅度較小的原因可能是菌體發(fā)酵時添加的Mn2+[16]已與酶的金屬結合位點飽和，固定化時繼續(xù)添加Mn2+只能維持該狀態(tài)。因此，可以在固定化時添加5 mmol/L Mn2+以提高固定化產(chǎn)品活力。

圖5 Mn2+添加量對固定化酶活的影響Fig.5 Effect of different Mn2+ concentration on the activity of immobilized product

2.2.3 確定PEI體積分數(shù)

上述實驗確定了絮凝劑PEI的最佳分子質(zhì)量為70 000 Da，本實驗隨即考察了1%～6%的PEI母液體積分數(shù)對固定化細胞酶活的影響，結果如圖6所示。當PEI母液體積分數(shù)處于1%～3%之間，固定化細胞酶活隨之升高；當PEI母液的體積分數(shù)為3%時，固定化細胞酶活達到最高的118.7 U/g。該結果表明該體積分數(shù)對細胞的絮凝程度較合適，過高的PEI體積分數(shù)會使其自身發(fā)生粘連，造成傳質(zhì)阻力過大，對酶活產(chǎn)生不利的影響[15]。丁為龍等在固定化β-呋喃果糖苷酶時，選定PEI體積分數(shù)為2.0%[24]；鄭劍鋒等通過PEI共沉淀技術制備海藻糖合酶交聯(lián)聚集體，確定了最優(yōu)PEI體積分數(shù)為1%[25]。本實驗選定了較高的細胞裝載量，所需的PEI體積分數(shù)僅為0.12%，說明本工藝具備一定的過程經(jīng)濟性。

圖6 聚乙烯亞胺體積分數(shù)對固定化酶活的影響Fig.6 Effect of different PEI concentration on the activity of immobilized product

2.2.4 確定PEI絮凝時間

確定了絮凝劑PEI的體積分數(shù)，還需要優(yōu)化其絮凝時間。鄭建永等在PEI/GLU交聯(lián)法固定化重組酯酶細胞過程中，確定PEI最佳絮凝時間為1.0 h[26]；海洪等在PEI對海藻酸固定化重組E.coli細胞的強化作用研究時，將細胞置于體積分數(shù)為0.2%～1% PEI溶液中間歇攪拌反應24 h，制得固定化細胞連續(xù)反應10批次，酶活無明顯下降[27]。本研究考察了PEI絮凝時間對固定化ToGI重組細胞酶活的影響，選用的絮凝時間為0～2.5 h，結果如圖7所示。

圖7 不同PEI絮凝時間對固定化酶活的影響Fig.7 Effect of different PEI flocculation time on the activity of immobilized product

隨著絮凝時間的增加，固定化產(chǎn)物酶活也上升。在絮凝時間為1.0 h時活力達到最高的121.7 U/g；繼續(xù)增加絮凝時間，酶活開始下降，絮凝2.5 h，酶活僅剩95.3 U/g。該結果說明絮凝時間過長導致固定化產(chǎn)物結構過于緊密，傳質(zhì)阻力變大，降低固定化細胞酶活。因此，最終選擇1.0 h為最佳絮凝時間。

2.2.5 確定THP交聯(lián)體積分數(shù)

在固定化交聯(lián)過程中，選取適當體積分數(shù)的交聯(lián)劑可以與細胞和載體形成最大的活性交聯(lián)體[28]。本實驗通過調(diào)整THPS和KOH的添加量，將THP控制在體積分數(shù)為0.5%～2.5%范圍內(nèi)，以考察不同交聯(lián)劑體積分數(shù)對固定化細胞酶活的影響。如圖8所示，當THP體積分數(shù)從0.5%提高至1.5%，固定化細胞酶活升高至最大值127.3 U/g，繼續(xù)提高THP體積分數(shù)，固定化酶活有所下降。該結果說明1.5%的THP體積分數(shù)剛好可以與載體和細胞上的氨基完全反應。梁欣欣以純棉浴巾為載體、PEI為吸附劑、利用THP為交聯(lián)劑固定脂肪酶，優(yōu)化所得THP的添加量也為1.5%[10]。但是，THP由等摩爾THPS和KOH混合而成，合成大量THP必然需要提高KOH添加量，但過量OH-加速催化生成沒有固定化能力的(HOCH2)3P=O(THPO)，該物質(zhì)會對固定化細胞的酶活產(chǎn)生不利影響[11]。因此，確定固定化時添加THP的最佳體積分數(shù)為1.5%。

圖8 不同THP體積分數(shù)對固定化酶活的影響Fig.8 Effect of different THP volume fraction on the activity of immobilized product

2.2.6 確定THP交聯(lián)時間

交聯(lián)時間對固定化效果的影響至關重要，交聯(lián)反應是否徹底、固定化是否牢固均會影響最終產(chǎn)物的酶活[29]。因此，本研究考察了交聯(lián)時間對固定化細胞酶活力的影響，見圖9。

圖9 THP交聯(lián)時間對固定化酶活的影響Fig.9 Effect of different THP crosslinking time on the activity of immobilized product

由圖9可知，隨著交聯(lián)時間的增長，THP固定化產(chǎn)物酶活呈現(xiàn)先升后降的趨勢；當交聯(lián)1.5 h時，固定化酶活出現(xiàn)峰值138.4 U/g。該結果說明交聯(lián)時間的延長致使更多PEI和細胞表面的氨基基團形成交聯(lián)，當所有活性基團均處于交聯(lián)飽和狀態(tài)后，酶活呈現(xiàn)峰值[28]；過度交聯(lián)會破壞酶的活性中心導致酶活降低。此外，THP易在空氣中氧化生成副產(chǎn)物(HOCH2)3P=O(THPO)，該物質(zhì)可能也會導致酶活下降[11]。因此，結合實驗結果，最終確定最佳的交聯(lián)時間為1.5 h。

2.3 固定化細胞的操作穩(wěn)定性研究

操作穩(wěn)定性是評價固定化產(chǎn)品應用性能的關鍵指標[30]。按上述優(yōu)化的固定化配方批量制備固定化細胞顆粒，考察其在85 ℃高溫條件下連續(xù)催化D-葡萄糖制備高濃度D-果糖的生物轉化情況。結果如圖10所示。

圖10 THP固定化產(chǎn)品的操作穩(wěn)定性Fig.10 The operational stability of immobilized biocatalyst

經(jīng)過10個批次的轉化，固定化細胞的酶活雖有下降，但仍保留91%以上初始酶活。整個轉化過程中，D-果糖得率均維持在51.7%以上。段緒果等使用殼聚糖絮凝-GLU交聯(lián)法固定ThermobifidafuscaGI，于70 ℃下重復使用8批次后，轉化率為42.1%[14]；劉芳等采用明膠GLU固定化乳糖酶和葡萄糖異構酶用于制備果糖，間歇操作6批次后，催化劑保留75%以上初始酶活[31]。與上述實例相比，本研究所用的固定化催化劑具備優(yōu)良的高溫穩(wěn)定性，并可以極大地提升使用率，展示了良好的操作穩(wěn)定性。

通過上述研究，應用固定化重組ToGI細胞，可以連續(xù)制備50%以上果糖質(zhì)量分數(shù)的HFCS，有效提升了現(xiàn)有的轉化工藝。但在使用固定化細胞作為催化劑的轉化過程中，很容易將E.coli細胞內(nèi)對人體有害的物質(zhì)帶入到產(chǎn)品中[32]。在后續(xù)研究中，為了更好滿足食品工業(yè)的安全要求，需要將E.coli的重組酶表達體系更換為符合食品安全的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)表達系統(tǒng)，以實現(xiàn)安全、高效生產(chǎn)HFCS的目的。另外，B.subtilis表達系統(tǒng)還具備一定的蛋白質(zhì)分泌功能[33]，便于蛋白的分離純化，再與固定化技術相結合，將制備的固定化酶顆粒用于生產(chǎn)，產(chǎn)物中不含任何細胞內(nèi)成分，這對于提高食品安全質(zhì)量極為有利。

3 結論

本研究詳細研究了經(jīng)THP交聯(lián)固定化重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI的關鍵過程條件。選取不同載體、絮凝劑和交聯(lián)劑，確定DE粒徑36.8 μm、PEI分子質(zhì)量為70 000 Da、交聯(lián)劑合成前體為THPC。運用最優(yōu)固定化體系，即0.3 g DE、5 mmol/L Mn2+、0.12% PEI絮凝1.0 h、1.5% THP交聯(lián)1.5 h，細胞具有最高酶活138.4 U/g。于85 ℃和1 100 mmol/LD-葡萄糖條件下連續(xù)轉化10批次，D-果糖得率均高于51.7%。以上研究說明該固定化產(chǎn)物滿足制備高果糖濃度HFCS的要求，為進一步開展該酶在食品安全的表達系統(tǒng)中的表達與固定化研究奠定了基礎。