周偉, 胡熠, 張進(jìn)杰, 徐大倫, 樓喬明，楊文鴿

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波，315211)

可食膜是以天然可食性物質(zhì)(蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等)為原料，添加可食用的活性功能成分，通過(guò)分子間的相互作用而形成的具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的薄膜，能夠防止氣體、水分和溶質(zhì)等的遷移，保持食品質(zhì)量，延長(zhǎng)食品貨架期，因而，可食性膜已成為食品保鮮與包裝領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1]。明膠是由多種氨基酸組成且具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì)，可由動(dòng)物的骨頭或皮膚膠原經(jīng)過(guò)熱變性或者是物理和化學(xué)降解得到，由于其無(wú)毒并且可降解等特性，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2]。目前全球大部分明膠來(lái)源于豬、牛等哺乳動(dòng)物，但由于部分地區(qū)的宗教信仰問(wèn)題以及攜帶致病因子的威脅，導(dǎo)致此類(lèi)明膠的應(yīng)用受到限制[3]。因此尋找并開(kāi)發(fā)新的明膠來(lái)源進(jìn)行代替就顯得尤為重要。

魚(yú)類(lèi)明膠是一種豐富、安全的膠原蛋白來(lái)源，尤其是魚(yú)類(lèi)在加工過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄?mèng)~皮和魚(yú)鱗下腳料都提取利用。我國(guó)是一個(gè)漁業(yè)大國(guó)，其中羅非魚(yú)2014年產(chǎn)量高達(dá)169萬(wàn)t，加工過(guò)程中產(chǎn)生大量魚(yú)鱗下腳料[4]。目前，相關(guān)研究人員已從狹鱈魚(yú)[5]、秘魯魷魚(yú)[6]、羅非魚(yú)[7]等魚(yú)皮中提取明膠制膜并改性，證明魚(yú)類(lèi)明膠具有良好的成膜性。但目前在水產(chǎn)加工研究中對(duì)魚(yú)鱗明膠的研究較少[8]。隨著加工技術(shù)的進(jìn)步，魚(yú)鱗明膠將會(huì)是一大宗可得的制膜原材料。同時(shí)，為了改善明膠膜質(zhì)脆、吸濕性高的缺點(diǎn)，添加天然活性物質(zhì)以改進(jìn)明膠膜的性能已成為一大研究熱點(diǎn)[8]。

天然植物多酚由于其特殊的結(jié)構(gòu)特性和抗氧化、抑菌和生物活性受到廣泛研究[9]。研究表明，酚類(lèi)化合物可與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用或反應(yīng)，使得明膠材料的凝膠或膜性能得到改善[9]。BENBETTAIEB等[10]往魚(yú)明膠膜中加入槲皮素和阿魏酸等多酚，發(fā)現(xiàn)膜具有較高的拉伸強(qiáng)度和斷裂生長(zhǎng)率。氫鍵是酚類(lèi)物質(zhì)與明膠分子之間形成的一種主要相互作用[11]。楊梅素是典型的酚類(lèi)化合物(如圖1)，楊梅素含有6個(gè)羥基，有與其他物質(zhì)形成氫鍵的潛力。另外，楊梅素具有優(yōu)良的生物活性和良好的溶解性[12]，可與膜很好地相融合并賦予膜一定的抗氧化和抑菌特性，因此是改良魚(yú)鱗明膠膜的優(yōu)選多酚類(lèi)物質(zhì)。多手段結(jié)合改進(jìn)明膠膜的性能也是常見(jiàn)的明膠膜改性手段。

明膠作為膠原蛋白產(chǎn)物，蛋白的性質(zhì)改良方式也適用于明膠的改性[2]。糖基化是一種蛋白修飾手段，通過(guò)糖與蛋白共價(jià)結(jié)合從而賦予蛋白質(zhì)新的功能特性[13]。 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)是除常見(jiàn)美拉德反應(yīng)外的另一種蛋白糖基化途徑，其主要作用是催化蛋白肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基(?；w)與?；荏w之間進(jìn)行酰基的轉(zhuǎn)移[14]。而殼寡糖是高分子殼聚糖降解后的低分子質(zhì)量多羥基糖類(lèi)，其具有伯胺結(jié)構(gòu)可作為?；荏w(圖1)。劉金玲等[15]用TG酶催化殼寡糖修飾玉米谷蛋白；陸姣含等[16]利用TG酶催化殼寡糖修飾魚(yú)皮明膠，都證實(shí)了殼寡糖基團(tuán)導(dǎo)入蛋白現(xiàn)象并改善了蛋白溶解性和乳化穩(wěn)定性。因此TG酶催化殼寡糖修飾羅非魚(yú)鱗明膠制膜是一種可行的膜改性手段。

圖1 殼寡糖和楊梅素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formula of chitosan oligosaccharide and myricetin

本文以魚(yú)鱗明膠為研究對(duì)象，研究糖基化和添加楊梅素協(xié)同對(duì)魚(yú)鱗明膠可食膜的改性作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú) (Tilapia) 魚(yú)鱗明膠：購(gòu)買(mǎi)時(shí)間2016年12月，純度88.8%(11.2%水分)，A型240凝凍強(qiáng)度，廣東歐帝瑪生物工程有限公司；甘油：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼寡糖：相對(duì)分子質(zhì)量MW<3 000，上海源葉生物科技有限公司；楊梅素：98%，西安貝拉生物科技有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶：1 000 U/g，江蘇一鳴生物股份有限公司；MD34透析袋：截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000～14 000，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)SMSTA公司；SpectraMax i3酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；Hitachi S-3400N掃描電鏡，日本日立公司；DSC200F3差示掃描量熱儀，德國(guó)NETZSCH公司；Jasco FT/IR4700傅立葉紅外光譜儀，日本分光公司；日立 L-8900高速氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氨基酸組成分析

根據(jù)GB 5009.124—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中氨基酸的測(cè)定方法，利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定魚(yú)鱗明膠氨基酸組成。

1.3.2 魚(yú)鱗明膠膜-SG制備

稱(chēng)取1.2 g干樣羅非魚(yú)鱗明膠，于去離子水中吸水溶脹20 min，再50 ℃水浴20 min充分溶解，制備60 g/L的明膠液；加入0.3 g/g(甘油/明膠)的甘油，磁力攪拌5 min混勻；將成膜液4 000 r/min(轉(zhuǎn)速)離心1 min脫除氣泡；20 mL成膜液傾倒入聚苯乙烯制膜平板中(直徑90 mm)，放入恒溫恒濕箱(25 ℃，相對(duì)濕度50%)中干燥72 h。揭膜后再進(jìn)行各項(xiàng)性能指標(biāo)測(cè)試[17]。

1.3.3 糖基化魚(yú)鱗明膠膜G-SG制備

參照陸姣含等[16]明膠糖基化最優(yōu)方法作適當(dāng)修改。按照1.3.2方法制備60 g/L的明膠液；加入0.16 g/g(殼寡糖/明膠)殼寡糖，調(diào)節(jié)pH=8；加入1 500 U/g蛋白的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；45 ℃水浴反應(yīng)3 h；85 ℃水浴滅酶5 min，待冷卻；將反應(yīng)液裝入透析袋中透析48 h除去未結(jié)合的殼寡糖；將透析明膠液倒入量筒中，于50 ℃揮發(fā)至未透析前的體積，以保證各成膜液中明膠濃度前后一致；將透析明膠液中加入0.3 g/g(甘油/明膠)的甘油，磁力攪拌5 min混勻；將成膜液4 000 r/min離心1 min脫除氣泡；20 mL成膜液傾倒入聚苯乙烯培養(yǎng)皿中(直徑90 mm)，放入恒溫恒濕箱(25 ℃，相對(duì)濕度50%)中干燥72 h。揭膜后再進(jìn)行各項(xiàng)性能指標(biāo)測(cè)試。

1.3.4 楊梅素-魚(yú)鱗明膠膜M-SG制備

按照1.3.2方法制備60 g/L的明膠液；將0.03 g楊梅素溶解于5 mL無(wú)水乙醇中，倒入20 mL成膜液；加入0.3 g/g(甘油/明膠)的甘油，磁力攪拌5 min混勻；將成膜液4 000 r/min離心1 min脫除氣泡；成膜液傾倒入聚苯乙烯培養(yǎng)皿中(直徑90 mm)，放入恒溫恒濕箱(25 ℃，相對(duì)濕度50%)中干燥72 h。揭膜后再進(jìn)行各項(xiàng)性能指標(biāo)測(cè)試[17]。

1.3.5 楊梅素-糖基化-魚(yú)鱗明膠膜 M-G-SG制備

參照陸姣含等[16]明膠糖基化最優(yōu)方法作適當(dāng)修改。按照1.3.3方法制備糖基化成膜液；將透析明膠液倒入量筒中，于50 ℃水浴揮發(fā)至未透析前的體積，以保證各成膜液中明膠濃度前后一致；將0.03 g楊梅素溶解于5 mL無(wú)水乙醇中，加入20 mL糖基化明膠液中攪拌均勻；將成膜液4 000 r/min離心1 min脫除氣泡；成膜液傾倒入聚苯乙烯培養(yǎng)皿中(直徑90 mm)，放入恒溫恒濕箱(25 ℃，相對(duì)濕度50%)中干燥72 h。揭膜后再進(jìn)行各項(xiàng)性能指標(biāo)測(cè)試。

1.3.6 機(jī)械性能

使用測(cè)厚規(guī)進(jìn)行膜厚度檢測(cè)。再使用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)量拉伸強(qiáng)度(TS)和斷裂伸長(zhǎng)率(EB)。抓距30 mm，拉伸速度5 mm/s。每組膜測(cè)5個(gè)平行。測(cè)試之前將20×50 mm的膜保存在25 ℃，相對(duì)濕度50%的恒溫恒濕箱中平衡48 h[18]。

1.3.7 水分含量

膜在恒溫恒濕箱(25 ℃，50%RH)中放置24 h后，取1 cm×4 cm的膜條稱(chēng)重，記為mi；將膜在105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，稱(chēng)重，記為mf。每張膜做3次平行[19]。

水分含量公式如下：

(1)

式中：mi為初始膜重；mf為最終膜重。

1.3.8 水蒸氣滲透性

膜在恒溫恒濕箱中放置24 h后，用5 mL的小燒杯，加入5 mL去離子水，用膜封口，置于含有硅膠的干燥器中，用±0.000 1 g分析天平稱(chēng)重，10 h內(nèi)每2 h進(jìn)行一次稱(chēng)量，試驗(yàn)環(huán)境25 ℃。通過(guò)線性回歸獲得質(zhì)量相對(duì)于時(shí)間變化的斜率。每組膜進(jìn)行3次平行試驗(yàn)[20]。

水蒸氣滲透性公式如下：

(2)

(3)

式中：Δm為稱(chēng)量質(zhì)量變化,g；Δt為時(shí)間變化,h；S為封口膜面積,m2；L是平均膜厚度,mm；ΔP為膜兩側(cè)水蒸氣分壓差,kPa。

1.3.9 透光度

用打孔器將膜制成直徑6 mm圓片，緊貼于微孔板底部，用SpectraMax i3酶標(biāo)儀進(jìn)行230～800 nm范圍的波長(zhǎng)掃描測(cè)量透光度，掃描波長(zhǎng)間隔5 nm[21]，繪制透光度曲線。

1.3.10 掃描電鏡

膜在干燥器中放置48 h后，取1 cm×4 cm膜樣品，用液氮浸沒(méi)之后人工折斷，將樣品粘貼于固定圓臺(tái)上，真空狀態(tài)下噴金，置于掃描電鏡中，電子束加速電壓為10.0 kV，觀察膜截面微觀結(jié)構(gòu)，在放大倍數(shù)10.0 k下拍照截圖[17]。

1.3.11 DSC

在測(cè)試前，膜在含硅膠干燥器中室溫下放置48 h以脫除水分。以打孔器制備6 mm直徑的圓形膜片(～5 mg)平鋪于鋁制坩堝中，壓片后置于差示掃描量熱儀中進(jìn)行測(cè)量。測(cè)試溫度范圍35～150 ℃，升溫速率10 ℃/min，N2作為吹掃氣和保護(hù)氣。以空白鋁制坩堝作為參照[17]。

1.3.12 FTIR

測(cè)試前，樣品保存在硅膠干燥器中室溫干燥48 h以脫除大部分水分。將膜樣品剪碎加入KBr研磨，壓片。使用傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。光譜范圍:4 000～400 cm-1；分辨率：4 cm-1；樣品掃描次數(shù)：32[17]。

1.3.13 二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算

利用Peakfit軟件對(duì)紅外酰胺Ⅰ帶進(jìn)行去卷積以及二階導(dǎo)擬合。確認(rèn)峰位歸屬，計(jì)算各分峰面積的相對(duì)百分含量[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以SAS 9.3統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤或標(biāo)準(zhǔn)差，以鄧肯多重比較方法進(jìn)行方差分析。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械性能

抗拉強(qiáng)度(TS)和斷裂伸長(zhǎng)率(EB)，反映可食膜的機(jī)械性能的優(yōu)劣[23]。圖2為SG、G-SG、M-SG和M-G-SG四種可食膜的厚度和TS-EB曲線。

圖2 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜厚度和拉伸曲線Fig.2 Bar chart of film thickness and graph of TS and EB of SG,M-SG,G-SG,M-G-SG films

如圖2所示，明膠膜SG、糖基化膜G-SG、楊梅素膜M-SG和聯(lián)合改性膜M-G-SG的厚度沒(méi)有顯著差異(p>0.05)。對(duì)照明膠膜SG的TS和EB值都較低，楊梅素膜M-SG的TS略有降低，糖基化膜G-SG的TS有所提升，但兩者EB值分別提高12%和63.4%；M-SG膜EB值的升高說(shuō)明楊梅素對(duì)明膠膜具有增塑效果。有研究表明，增塑劑插入到聚合物大分子之間，通過(guò)隔離作用(增加聚合物分子鏈之間距離)，從而起到增塑效果[24]。因而楊梅素的三環(huán)剛性平面結(jié)構(gòu)可能使得明膠鏈間的距離增大，引發(fā)了膜塑性的提升。ALKAN等[18]在玉米醇溶蛋白中添加肉桂酸、香草酸、麝香草酚、香芹酚、丁香酚、檸檬醛等天然酚制備玉米醇溶蛋白基質(zhì)的抗菌可食膜，發(fā)現(xiàn)抑菌膜EB都有所提升，玉米醇溶蛋白基質(zhì)膜變得更有彈性，這與本研究中添加楊梅素的結(jié)果相同。

G-SG膜TS無(wú)明顯變化，EB值明顯提高63.4%，反映了糖基化對(duì)于明膠膜的增塑效果。SOTHORNVIT等[25]發(fā)現(xiàn)，甘油等小分子增塑劑會(huì)通過(guò)羥基和多聚物之間形成氫鍵，增加膜的自由體積從而起到增塑作用。因?yàn)槎唷狾H殼寡糖修飾明膠中的谷氨酰胺殘基[15]，并與相鄰明膠鏈形成氫鍵連接，類(lèi)似親水性小分子增塑劑的增塑作用，從而使膜鏈移動(dòng)性增強(qiáng)；而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)明膠內(nèi)部的交聯(lián)作用比較微弱，因?yàn)楸久髂z中賴(lài)氨酸含量低至3.7%(表1)，導(dǎo)致TS沒(méi)有明顯提升。

表1 魚(yú)鱗明膠氨基酸組成分析Table 1 Composition analysis of amino acids in fish-scale gelatin

明膠膜糖基化改性并加入分子具有6個(gè)—OH黃酮的楊梅素之后，M-G-SG膜的TS明顯提高了487%，可能是因?yàn)檎?fù)電荷作用以及氫鍵結(jié)合作用共同引起了加入楊梅素的糖基化明膠膜的TS的提高。ALKAN等[18]研究表明，負(fù)電荷的酚組分會(huì)與正電荷的膜基質(zhì)基團(tuán)結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)明膠中正電荷氨基酸占據(jù)11.58%(如表1所示，賴(lài)氨酸3.7%，組氨酸0.64%，精氨酸7.24%)，黃酮多羥基使得黃酮負(fù)電荷增多，因而明膠中正電荷氨基酸更加容易與黃酮中負(fù)電荷部位發(fā)生相互作用，使黃酮分子與糖基化明膠分子結(jié)合更緊密。陸國(guó)弟等[26]研究顯示，B環(huán)上羥基數(shù)目越多，黃酮類(lèi)化合物與人血清蛋白通過(guò)氫鍵形成的親和力越強(qiáng)。因而楊梅素B環(huán)上3個(gè)—OH的存在，使其可能通過(guò)氫鍵連結(jié)更多的糖基化明膠鏈部位，并且殼寡糖基團(tuán)的多—OH結(jié)構(gòu)也增進(jìn)了糖基化明膠鏈同多—OH楊梅素的結(jié)合。M-G-SG膜的EB值明顯提高了251%，因?yàn)辄S酮的—OH以氫鍵連接附近分子鏈取代了原糖基化明膠鏈的直接連接，增大了分子鏈的自由體積，從而造成了EB的提高。

因此，楊梅素改性以及糖基化改性對(duì)明膠膜都具有不同程度的增塑效果，而糖基化協(xié)同楊梅素改性對(duì)于明膠膜抗拉強(qiáng)度(TS)和斷裂伸長(zhǎng)率(EB)的提升有協(xié)同增效作用，彌補(bǔ)了單一黃酮類(lèi)物質(zhì)制備活性明膠包裝膜造成的拉伸強(qiáng)度的損失。

2.2 水分含量、水蒸汽透過(guò)性

水分含量(MC)反映了膜截留水的能力[27]。SG、G-SG、M-SG和M-G-SG四種可食膜的水分含量和水蒸汽滲透性如圖3所示。

圖3 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜水分含量和水蒸氣透過(guò)性Fig.3 Moisture content and water vapor permeability of SG,M-SG,G-SG,M-G-SG films

對(duì)照SG膜的水分含量為13.3%，M-SG膜水分含量明顯降低為12%(p<0.05)，G-SG膜的水分含量為13.9%，M-G-SG膜水分含量為13.6%。

水蒸氣透過(guò)性(WVP)反映了膜對(duì)水汽的阻隔性能[28]。對(duì)照SG膜的WVP為1.36 g·mm/(kPa·h·m2)，M-SG膜WVP明顯降低為1.29 g·mm/kPa·h·m2(p<0.05)，G-SG膜WVP提升到1.92 g·mm/(kPa·h·m2)(p<0.05)；M-G-SG膜WVP為1.45 g·mm/(kPa·h·m2)。

各組膜的水分含量、水蒸氣透過(guò)性指標(biāo)顯示出相同的變化趨勢(shì)。M-SG膜水分含量、WVP降低，表明具備疏水性三環(huán)結(jié)構(gòu)的楊梅素具有提升明膠膜阻水性的作用；G-SG膜水分含量、WVP的升高，反映了親水性多—OH小分子殼寡糖修飾明膠膜基團(tuán)降低了明膠膜的阻水性；M-G-SG膜的水分含量、WVP相對(duì)于SG、M-SG膜略有提高，但低于G-SG膜；體現(xiàn)了楊梅素和糖基化協(xié)同改性調(diào)和了2種改性方式對(duì)膜阻水性的影響。

2.3 透光度

圖4顯示了SG、T-SG、M-SG和M-T-SG四種可食膜在紫外光區(qū)(230～300 nm)和可見(jiàn)光區(qū)(300～800 nm)的透光度[21]。

圖4 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜透光度曲線Fig.4 Curves of light transmittance for SG,M-SG,G-SG,M-G-SG films

在230～300 nm的紫外波段，明膠膜糖基化后，G-SG膜紫外透光度明顯下降。因?yàn)轸~(yú)鱗明膠膜中由于芳香族氨基酸的存在(表1中0.59%酪氨酸，2.07%苯丙氨酸)，本身具有一定的紫外吸收能力[29]。其次對(duì)明膠基團(tuán)進(jìn)行修飾的殼寡糖由于是具有一定脫乙酰度殼聚糖的分解產(chǎn)物，帶有的乙?；鶊F(tuán)增進(jìn)了對(duì)紫外的吸收。添加楊梅素的明膠膜M-SG和糖基化明膠膜M-G-SG的紫外透光度進(jìn)一步降低，但添加楊梅素的兩者紫外透光度沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明黃酮楊梅素中苯環(huán)的存在極大地促進(jìn)了膜對(duì)于紫外的吸收。

在300～800 nm的可見(jiàn)光區(qū)，M-G-SG膜達(dá)到了較低的光吸收，所以協(xié)同改性能夠極大地提升明膠膜的阻光性。

楊梅素和糖基化都提升了明膠膜對(duì)紫外的吸收，而楊梅素和糖基化協(xié)同改性則進(jìn)一步加強(qiáng)了明膠膜的光阻隔能力。

2.4 SEM

圖5為SG、G-SG、M-SG和M-G-SG四種可食膜表面和橫截面的掃描電鏡圖像，直觀展示了楊梅素改性、糖基化改性及其綜合改性對(duì)膜微觀性狀的影響。

圖5 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜截面掃描電鏡(SEM)Fig.5 Scanning electron microscope pictures of SG,M-SG, G-SG,M-G-SG films注：A1、B1、C1和D1分別為SG、M-G、G-SG、M-G-SG膜表面；A2、B2、C2和D2分別為SG、M-G、G-SG、M-G-SG膜橫截?cái)嗝?/p>

SG膜表面平滑，截面顯示部分微型平緩褶皺；而添加具備三疏水性環(huán)以及6個(gè)—OH的黃酮楊梅素后，M-SG膜表面分布部分凸起，截面也出現(xiàn)明顯紛亂的聚集性突起；已有研究利用核磁共振技術(shù)和分子建模技術(shù)測(cè)定黃酮和蛋白的相互作用，結(jié)果顯示其主要作用力是范德華相互作用，包括：(1)黃酮—OH基團(tuán)驅(qū)動(dòng)形成的氫鍵；(2)黃酮非極性芳香環(huán)和蛋白側(cè)鏈非極性部位的London相互作用；(3)離子相互作用[11]。因此這3種相互作用造成了黃酮楊梅素和明膠膜之間結(jié)合的增強(qiáng)，致使截面出現(xiàn)分子鏈凝集現(xiàn)象。

明膠膜糖基化之后，G-SG膜表面更加平滑，截面仍出現(xiàn)輕微程度的不平整，但增進(jìn)了膜截面的平滑度，反映了糖基化使得明膠分子結(jié)合良好，膜內(nèi)分子排列有序性提高。

楊梅素協(xié)同糖基化改性明膠后，M-G-SG膜表面性狀優(yōu)于SG、M-SG、M-G-SG膜，截面開(kāi)始出現(xiàn)更加規(guī)律排列的致密性條紋，表明黃酮楊梅素和糖基化改性提升了膜基質(zhì)內(nèi)部分子的相互作用，使分子聚集度增加，展現(xiàn)了黃酮和糖基化明膠鏈之間良好的相融性。 DERYA ALKAN等[18]在制備添加檸檬醛和牛至酚類(lèi)提取物的玉米醇溶蛋白膜時(shí)，發(fā)現(xiàn)由于其相融性差，導(dǎo)致膜基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了大的孔洞。因此，楊梅素協(xié)同糖基化改性使明膠膜微觀結(jié)構(gòu)更加規(guī)律致密，能夠改善單一楊梅素改性明膠膜的表觀。

2.5 DSC

SG、T-SG、M-SG和M-T-SG四種可食膜的DSC熱特性曲線如圖6所示。熱變性溫度代表蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，焓變是分子聚集程度的體現(xiàn)[30]。對(duì)照明膠膜SG的熱變性溫度為75.4 ℃，楊梅素改性以及糖基化后熱變性溫度都有所下降，但兩者吸熱焓變由5.954 J/g分別升高到9.270 J/g和7.410 J/g。說(shuō)明楊梅素以及糖基化會(huì)降低明膠膜的熱穩(wěn)定性，但會(huì)一定程度地提升明膠分子聚集。這與掃描電鏡觀察到的截面致密性增強(qiáng)相一致；糖基化膜在結(jié)合楊梅素改性后，M-G-SG熱變性溫度升高至77.7 ℃，表明完全打斷膜內(nèi)化學(xué)鍵需要更高的溫度，反映了膜內(nèi)分子連接的增強(qiáng)，與膜的抗拉強(qiáng)度提高相印證；M-G-SG膜的焓變提高至8.215 J/g，介于M-SG膜和G-SG膜之間；這與SEM觀察到的協(xié)同改性膜比單一楊梅素改性膜和單一糖基化改性膜更加規(guī)律致密的表觀相一致。

圖6 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜熱特性曲線Fig.6 Thermal characteristic graph for SG,M-SG,G-SG, M-G-SG films

楊梅素協(xié)同糖基化改性提高了明膠膜的熱穩(wěn)定性，且優(yōu)于單一楊梅素改性明膠膜。此外，膜的焓變變化反映的聚集程度的變化同SEM電鏡表觀相互印證。DSC曲線從熱的角度反映了熱穩(wěn)定性、內(nèi)部分子作用的變化。

2.6 紅外光譜分析

圖7 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜紅外光譜Fig.7 FT-IR spectra for SG,M-SG,G-SG,M-G-SG films

由于酰胺Ⅰ帶含有水中的O—H吸收峰，故能反映膜基質(zhì)與水的結(jié)合能力[17]。對(duì)照明膠膜SG的酰胺A吸收峰為3 398.92 cm-1。M-SG的酰胺A峰向高波數(shù)3 401.82 cm-1發(fā)生位移，表明楊梅素改性降低了明膠分子與水的結(jié)合作用。G-SG該峰位低波數(shù)位移至3 365.17 cm-1，反映了糖基化使得明膠膜內(nèi)部分子對(duì)水分子的結(jié)合力增強(qiáng)。M-G-SG的酰胺A峰位移至3 398.24 cm-1，沒(méi)有明顯位移，則反映了協(xié)同改性對(duì)明膠膜的水結(jié)合能力沒(méi)有明顯影響，這與SG和M-G-SG膜的水分含量以及水氣滲透性都相近的結(jié)果一致。因而酰胺Ⅰ峰位的變化展示了各組明膠膜的水結(jié)合性變化[19]。

對(duì)照明膠膜SG中1 043.3 cm-1處的甘油中—OH吸收峰在經(jīng)過(guò)3種改性方式成膜后，呈現(xiàn)同酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ同樣的變化趨勢(shì)。反映了糖基化以及楊梅素也造成了增塑劑甘油中—OH參與形成氫鍵的增強(qiáng)，并且協(xié)同改性更進(jìn)一步增強(qiáng)了甘油的氫鍵作用。

因此，F(xiàn)TIR從內(nèi)部基團(tuán)峰位變化反映了楊梅素、糖基化以及兩者協(xié)同改性對(duì)魚(yú)鱗明膠膜水結(jié)合作用以及整體氫鍵作用的影響。

2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)

FTIR酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最為敏感。如圖8 所示，將膜酰胺Ⅰ帶經(jīng)過(guò)去卷積、二階導(dǎo)分峰擬合處理，分峰數(shù)目在12～16之間，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999。其中1 600～1640 cm-1歸屬于β折疊，1 640～1 650 cm-1歸屬于無(wú)規(guī)則卷曲，1 650～1 660cm-1歸屬于α螺旋，1 660～1 670 cm-1歸屬于β轉(zhuǎn)角[22]。對(duì)分峰面積進(jìn)行分區(qū)計(jì)算得到二級(jí)結(jié)構(gòu)含量如圖9 所示。

圖8 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜酰胺Ⅰ帶擬合圖譜Fig.8 Fitting spectra in the amide Ⅰ region of SG,M-SG,G-SG,M-G-SG films

圖9 SG、M-SG、G-SG、M-G-SG膜二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 Bar chart for secondary structure of SG,M-SG,G-SG, M-G-SG films

本實(shí)驗(yàn)中，魚(yú)鱗明膠糖基化后，G-SG膜內(nèi)明膠的α螺旋結(jié)構(gòu)消失，轉(zhuǎn)化為β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和β折疊結(jié)構(gòu)；XUE等[33]研究表明，大豆蛋白經(jīng)過(guò)糖基化處理后也出現(xiàn)α螺旋結(jié)構(gòu)減少，β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲不同程度的增加。WANG等[34]研究顯示，乳清蛋白糖基化后出現(xiàn)了β折疊構(gòu)象增加的現(xiàn)象。因此，部分蛋白物質(zhì)經(jīng)過(guò)糖基化后會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似的空間構(gòu)象變化。

M-SG內(nèi)部β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和β折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)含量降低，轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪?；劉暉等[35]研究顯示，具備疏水性3環(huán)和3個(gè)—OH的黃苓素黃酮與人血清白蛋白結(jié)合，也造成其α螺旋含量增加2.2%。苗敏等[36]研究表明，加入黃酮類(lèi)化合物后，溶菌酶聚集過(guò)程中β片層結(jié)構(gòu)的吸收逐漸減小，α螺旋結(jié)構(gòu)吸收逐漸增多，并表明主要是由于黃酮疏水性芳香環(huán)與蛋白芳香氨基酸形成的堆積作用和疏水作用導(dǎo)致蛋白α螺旋含量增加。

M-G-SG中，楊梅素協(xié)同糖基化對(duì)明膠膜進(jìn)行改性后，β結(jié)構(gòu)(β折疊和β轉(zhuǎn)角)轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪蜔o(wú)規(guī)則卷曲。因而此二級(jí)結(jié)構(gòu)變化清楚顯示，協(xié)同改性造成明膠膜α螺旋以及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增加是楊梅素改性以及糖基化改性綜合互補(bǔ)作用的結(jié)果。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究得出，楊梅素與明膠的疏水性結(jié)合提升了明膠膜阻水性，其—OH加強(qiáng)了復(fù)合膜內(nèi)部羰基和氨基的氫鍵作用，造成明膠分子α螺旋結(jié)構(gòu)增多。魚(yú)鱗明膠糖基化后，糖基化基團(tuán)小分子的多羥基結(jié)構(gòu)同明膠氨基酸殘基結(jié)合，降低了膜阻水性，提升了內(nèi)部羰基和氨基的氫鍵作用，并造成α螺旋的消失。協(xié)同改性沒(méi)有明顯改變膜阻水性，但促進(jìn)明膠分子的β結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪蜔o(wú)規(guī)則卷曲，從而顯示出兩者對(duì)明膠的改性互補(bǔ)作用。糖基化和楊梅素均提升了魚(yú)鱗明膠膜的機(jī)械性能和紫外阻隔能力，而協(xié)同改性對(duì)膜的機(jī)械性能和光阻隔性能的提升起到了協(xié)同增效作用，并使膜內(nèi)部截面構(gòu)造更加規(guī)律致密，而不影響?hù)~(yú)鱗明膠膜的阻水性，同時(shí)提高了膜的熱穩(wěn)定性。