李霞，趙金雨，婁興丹，張根林

(石河子大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子，832003)

番茄紅素(lycopene)是一種抗氧化活性很強(qiáng)的萜類物質(zhì)，具有猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等多種生理功能活性[1-2]，在癌癥預(yù)防，抗衰老，保護(hù)心腦血管和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有廣泛應(yīng)用，被世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定為A類營(yíng)養(yǎng)素，市場(chǎng)前景較好[3-4]。目前生產(chǎn)番茄紅素常用的方法有直接提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。由于原料番茄的供應(yīng)受到氣候與季節(jié)的影響，使得直接提取法生產(chǎn)成本較高[5]?；瘜W(xué)合成法一般以β-紫羅酮為原料，合成過(guò)程步驟繁瑣，且化學(xué)試劑殘留問(wèn)題限制了產(chǎn)品的使用范圍[6]。而微生物發(fā)酵法由于不受氣候和季節(jié)影響、生產(chǎn)周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)逐漸受到人們的關(guān)注。釀酒酵母因具有遺傳可操作性以及成熟的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)使其在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[7-8]。作為安全的模式微生物，釀酒酵母存在能合成萜類的甲羥戊酸(MVA)途徑，已經(jīng)作為生產(chǎn)青蒿酸[9]、玉米黃質(zhì)[10]、β-香樹(shù)脂醇[11]、人參皂苷[12]等天然產(chǎn)物的優(yōu)良宿主使用。通過(guò)引入外源的八氫番茄紅素合成酶(CrtB)、八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)可以實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中合成番茄紅素[13](圖1)。如YAMANO等將歐文氏菌的番茄紅素合成基因引入釀酒酵母中，獲得了產(chǎn)量為113 μg/g番茄紅素[13]；王貝貝等將紅法夫酵母的CrtBY和CrtI基因?qū)脶劸平湍?，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到0.4 mg/g[14]；施明雨等將成團(tuán)泛菌來(lái)源的番茄紅素合成基因引入釀酒酵母后，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到13.23 mg/L[15]。研究認(rèn)為，合成途徑與宿主的適配性、宿主的生理狀態(tài)仍然是限制番茄紅素高效合成的重要因素，難以進(jìn)行全局調(diào)控[13-15]。因此，本研究從宿主選擇、途徑表達(dá)的適配性等方面綜合考慮，研究底盤(pán)宿主、啟動(dòng)子以及前體物庫(kù)容對(duì)番茄紅素合成與細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化釀酒酵母合成番茄紅素提供參考。

ERG10-乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因；ERG13-HMG輔酶A合酶基因；tHMG1-HMG輔酶A還原酶基因；ERG12-甲羥戊酸激酶基因；ERG8-磷酸甲羥戊酸激酶基因；ERG19-磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因；IDI-IPP異構(gòu)酶基因；ERG20-FPP合酶基因；BTS1-GGPP合酶基因； CrtB-八氫番茄紅素合酶基因；CrtI-八氫番茄紅素脫氫酶基因圖1 釀酒酵母合成番茄紅素的途徑優(yōu)化策略Fig.1 Strategy for construction of lycopene biosynthetic pathway

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶SalI、BamH I購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；核酸Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、酵母DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；氨芐青霉素、潮霉素、G418、半乳糖、番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

T100型PCR儀，Bio-Rad公司；LightCycler 96型熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；MLS33750型高壓滅菌器，日本三洋公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；LC-A10型液相色譜儀，日本島津公司；GC2010型氣相色譜儀，日本島津公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g/L、蛋白胨10 g/L和NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基添加15 g/L的瓊脂粉。LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

BMMY培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L和半乳糖20 g/L。固體培養(yǎng)基添加20 g/L的瓊脂粉。BMMY培養(yǎng)基用于含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子釀酒酵母工程菌的培養(yǎng)。

YPD培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L和葡萄糖20 g/L。固體培養(yǎng)基添加20 g/L的瓊脂粉。YPD培養(yǎng)基用于釀酒酵母的培養(yǎng)。

畢宏生是第十二屆、十三屆全國(guó)人大代表，著名眼科專家，從事眼科臨床、教學(xué)及科研工作30多年，在白內(nèi)障、視光及采用眼顯微外科手術(shù)解決復(fù)雜疑難性眼病、中西醫(yī)結(jié)合眼病的臨床及研究領(lǐng)域均取得突出成就。他還高度關(guān)注民生工程，注重承擔(dān)社會(huì)職責(zé)，連續(xù)多年為防盲治盲奔波勞力，多次協(xié)助政府推動(dòng)重大公共衛(wèi)生項(xiàng)目?；顒?dòng)中，畢宏生不僅介紹了眼科常見(jiàn)病保健知識(shí)，還積極呼吁全社會(huì)要高度重視眼健康，關(guān)注青少年視力保健。

1.1.3 菌種與質(zhì)粒

研究所需的菌種與質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 菌種和質(zhì)粒Table 1 The strains and plasmids

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體和酵母工程菌的構(gòu)建

以釀酒酵母基因組為模板，利用特異性引物擴(kuò)增啟動(dòng)子GAL1p、GAL7p、TEF1p、FBA1p和終止子CYC1t、TYS1t。以質(zhì)粒pUC57-CrtB和pUC57-CrtI為模板，擴(kuò)增分別獲得來(lái)源于歐文氏菌的八氫番茄紅素合成酶基因CrtB(GenBank: KC954270.1)和來(lái)源于紅法夫酵母的八氫番茄紅素脫氫酶基因CrtI(GenBank:AY177424.1)。然后通過(guò)重疊延伸PCR方法構(gòu)建獲得基因表達(dá)盒GAL1p-CrtB-CYC1t、GAL7p-CrtI-TYS1t、TEF1p-CrtB-CYC1t和FBA1p-CrtI-TYS1t。用限制性內(nèi)切酶SalI和BamH I對(duì)質(zhì)粒pRS41H和pRS42K進(jìn)行線性化。線性化的質(zhì)粒和基因表達(dá)盒通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，利用釀酒酵母的同源重組實(shí)現(xiàn)組裝[16]，形成含有不同表達(dá)途徑質(zhì)粒的工程酵母(表2)。為了平衡釀酒酵母MVA途徑的庫(kù)容，選擇rDNA重復(fù)單元序列作為MVA途徑基因表達(dá)盒的整合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了如圖2的構(gòu)建策略，形成工程酵母W5和W6(表2)。

ADH1p、ALA1p、FBA1p、TDH3p、TYS1p、GPM1p、TEF1p-啟動(dòng)子；SDH2t、ILV1t、VPS8t、PIM1t、REI1t、LRP1t、 CYC1t-終止子，hphNT1-潮霉素B抗性篩選標(biāo)記基因圖2 MVA途徑優(yōu)化設(shè)計(jì)示意圖Fig.2 Schematic diagram of MVA pathway optimization

1.2.2 酵母工程菌的篩選

利用pRS41H或pRS42K為載體、使用半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p和GAL7p控制番茄紅素合成途徑時(shí)，轉(zhuǎn)化所得的酵母工程菌使用BMMY抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)；利用pRS41H或pRS42K為載體、使用組成型啟動(dòng)子TEF1p和FBA1p控制番茄紅素合成途徑時(shí)，轉(zhuǎn)化所得的酵母工程菌使用YPD抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞均置于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落，經(jīng)菌落顏色變化(合成番茄紅素的菌株顯粉紅色)和菌落PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆菌株。

1.2.3 酵母工程菌的發(fā)酵

1.2.4 番茄紅素的提取

菌株發(fā)酵結(jié)束后，采用改進(jìn)的XIE等提取類胡蘿卜素的方法[17]。取發(fā)酵液50 mL轉(zhuǎn)入離心管中，8 000 r/min離心5 min棄上清，無(wú)菌水清洗沉淀2次后加入10 mL 3 mol/L的HCl溶液，混合均勻后沸水浴4 min，迅速放入冰水浴冷卻3 min，8 000 r/min離心5 min棄去上清，無(wú)菌水清洗沉淀2次后倒掉上清，加入10 mL丙酮，并加少量石英砂渦旋混合細(xì)胞5 min，最后充分萃取脂溶性代謝產(chǎn)物，8 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μmol/L有機(jī)濾膜過(guò)濾后用高效液相色譜儀分析番茄紅素的含量。

1.2.5 番茄紅素的測(cè)定

使用高效液相色譜儀對(duì)番茄紅素進(jìn)行定量測(cè)定。所用液相色譜儀為島津LC-10A，檢測(cè)器為PDA檢測(cè)器，色譜柱為ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=21∶21∶8，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm。每個(gè)待測(cè)樣品平行測(cè)定3次。

1.2.6 中間代謝產(chǎn)物的提取及測(cè)定

釀酒酵母中角鯊烯、法尼醇等代謝產(chǎn)物的提取參照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[18]。使用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。所用氣相色譜儀為島津GC2010，色譜柱為 TG-5MS(Thermo 30 m×0.25 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為300 ℃，分流進(jìn)樣，載氣為氮?dú)猓M(jìn)樣量1 μL，分流比30∶1，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，柱箱程序升溫起始溫度 80 ℃，然后以20 ℃/min 的速度升溫至300 ℃，保持40 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 底盤(pán)宿主對(duì)番茄紅素途徑表達(dá)的影響

以單拷貝質(zhì)粒pRS41H為表達(dá)載體，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p和GAL7p控制番茄紅素合成途徑，分別轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeINVSc1和CEN.PK2-1C，獲得釀酒酵母工程菌W1和W2，搖瓶發(fā)酵后提取產(chǎn)物，用HPLC進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果顯示，盡管在不同底盤(pán)宿主中導(dǎo)入番茄紅素合成途徑后，菌株的生物量差別不大，但合成番茄紅素的水平有較大區(qū)別。以釀酒酵母INVSc1為底盤(pán)宿主時(shí)，番茄紅素最高產(chǎn)量為0.025 mg/L，以釀酒酵母CEN.PK2-1C為底盤(pán)宿主時(shí)，番茄紅素最高產(chǎn)量為0.052 mg/L，是INVSc1為底盤(pán)宿主的2倍(如圖3所示)。說(shuō)明釀酒酵母CEN.PK2-1C較釀酒酵母INVSc1更適合作為底盤(pán)宿主合成番茄紅素，不同釀酒酵母菌株的遺傳背景對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物合成有一定的影響，這一結(jié)果與WESTFALL等通過(guò)釀酒酵母合成青蒿二烯的研究相似[19]，可能與CEN.PK株系具有更清楚的生理特點(diǎn)和有較強(qiáng)的合成萜類化合物前體的能力有關(guān)[20]。

圖3 底盤(pán)宿主對(duì)工程菌合成番茄紅素的影響Fig.3 Effect of chassis hosts on lycopene production by engineered S. cerevisiae

2.2 拷貝數(shù)對(duì)番茄紅素途徑表達(dá)的影響

為了研究基因拷貝數(shù)對(duì)途徑表達(dá)效果的影響，以釀酒酵母CEN.PK2-1C為底盤(pán)宿主，在其中轉(zhuǎn)入含有番茄紅素合成途徑的多拷貝質(zhì)粒pRS42K，構(gòu)建獲得釀酒酵母工程W3。分析顯示，拷貝數(shù)對(duì)工程菌株的生長(zhǎng)影響也較小，但對(duì)產(chǎn)物合成具有一定的影響。使用單拷貝質(zhì)粒pRS41H時(shí)，番茄紅素的最高產(chǎn)量為0.052 mg/L，而使用多拷貝質(zhì)粒pRS42K時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量可達(dá)到0.078 mg/L，產(chǎn)量提高了1.5倍(如圖4所示)。說(shuō)明番茄紅素的產(chǎn)量與途徑表達(dá)所用載體的類型有一定關(guān)系，功能基因的拷貝數(shù)影響了外源途徑的表達(dá)，由多拷貝質(zhì)粒pRS42K表達(dá)番茄紅素合成途徑時(shí)與酵母底盤(pán)的適配性更好。

圖4 拷貝數(shù)對(duì)工程菌合成番茄紅素的影響Fig.4 Effect of copy number on lycopene production by engineered S. cerevisiae

2.3 啟動(dòng)子類型對(duì)番茄紅素途徑表達(dá)的影響

以多拷貝質(zhì)粒pRS42K為表達(dá)載體，使用組成型啟動(dòng)子(TEF1p、FBA1p)調(diào)控番茄紅素合成途徑，轉(zhuǎn)化釀酒酵母底盤(pán)CEN.PK2-1C獲得了釀酒酵母工程菌W4，研究啟動(dòng)子對(duì)途徑表達(dá)效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)番茄紅素合成基因以組成型啟動(dòng)子控制表達(dá)時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量可達(dá)到0.152 mg/L，產(chǎn)量提高了2倍，但對(duì)菌株生長(zhǎng)具有一定的影響，相比初始菌株，生物量有顯著下降(如圖5所示)。

圖5 啟動(dòng)子類型對(duì)工程菌合成番茄紅素的影響Fig.5 Effect of promoters on lycopene production by engineered S. cerevisiae

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，較誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，組成型啟動(dòng)子在酵母合成其他萜類化合物如紫衫二烯時(shí)也具有一定優(yōu)勢(shì)[21]，組成型啟動(dòng)子可能更適合釀酒酵母中途徑的平衡表達(dá)。

2.4 平衡前體物供應(yīng)提高番茄紅素的合成

前期研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入番茄紅素或其他外源合成途徑后，酵母自身代謝平衡受到干擾，導(dǎo)致前體物供應(yīng)不足[22]。為了優(yōu)化番茄紅素生物合成工程菌中的前體物供應(yīng)，將MVA途徑合成模塊轉(zhuǎn)化到釀酒酵母工程菌W4中，獲得工程菌W5。結(jié)果顯示，強(qiáng)化酵母工程菌MVA途徑后，工程菌W5的番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到了3.62 mg/L，較工程菌W4提高了24倍(如圖6所示)，是初始工程菌株的70倍。

圖6 前體物供應(yīng)對(duì)番茄紅素合成的影響Fig.6 Effect of the precursor supply on lycopene production

這一產(chǎn)量與利用成團(tuán)泛菌來(lái)源基因合成番茄紅素產(chǎn)量為13.23 mg/L還有一定差距，可能是過(guò)表達(dá)MVA途徑tHMG1、GGPS以及其他一些同工酶的編碼基因有關(guān)[15]。進(jìn)一步分析工程菌W4、W5的中間代謝產(chǎn)物累積情況，發(fā)現(xiàn)工程菌W5較工程菌W4均有顯著提高(如圖7所示)。

為了驗(yàn)證相關(guān)因素對(duì)番茄紅素途徑表達(dá)的影響在強(qiáng)化MVA途徑后是否相同，構(gòu)建了使用單拷貝質(zhì)粒pRS41H為表達(dá)載體的酵母工程菌W6，工程菌W6的番茄紅素產(chǎn)量也能達(dá)到1.32 mg/L(如圖6所示)，與W1、W2、W3和W4菌株相比，合成番茄紅素的產(chǎn)量都有不同程度的提高，而相比工程菌W5產(chǎn)量有所下降。說(shuō)明強(qiáng)化MVA途徑后，基因拷貝數(shù)對(duì)途徑表達(dá)效果的影響相似，而通過(guò)強(qiáng)化MVA途徑，有效地平衡了釀酒酵母合成番茄紅素的前體物供給，強(qiáng)化了釀酒酵母類異戊二烯合成途徑的代謝通量，進(jìn)而增加了釀酒酵母合成番茄紅素的能力。

圖7 工程菌W4和W5中間代謝產(chǎn)物角鯊烯(a)和法呢醇(b)的積累曲線Fig.7 The accumulation curves of intermediate metabolite of lycopene synthesized by Saccharomyces cerevisiae

3 結(jié)論

(1)不同遺傳背景的酵母菌株在番茄紅素的異源合成中有差異，相同培養(yǎng)條件下，釀酒酵母CEN.PK2-1C較釀酒酵母INVSc1更利于合成番茄紅素。

(2)表達(dá)載體在底盤(pán)細(xì)胞中的拷貝數(shù)直接影響外源模塊中的表達(dá)水平，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量有影響，在相同培養(yǎng)條件下，多拷貝表達(dá)質(zhì)粒pRS42K較單拷貝表達(dá)質(zhì)粒pRS41H更有利于合成番茄紅素。

(3)半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子都能調(diào)控番茄紅素途徑的表達(dá)，相同培養(yǎng)條件下，組成型啟動(dòng)子較半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子更適合釀酒酵母中番茄紅素途徑的表達(dá)。

(4)強(qiáng)化MVA途徑有效地平衡了釀酒酵母合成番茄紅素的前體物供給，顯著提高了番茄紅素的合成。