雷鑫亭， 劉曉祺， 唐文竹， 李憲臻

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

鹵代化合物，是與制藥、化學(xué)和農(nóng)化工業(yè)相關(guān)的生物活性物質(zhì)的重要中間體或成分[1],它存在于各種天然產(chǎn)品中，包括氯霉素、吡咯多霉素、植物生長調(diào)節(jié)劑噻諾林和抗真菌劑吡咯硝酸酯等[2]。在農(nóng)業(yè)化學(xué)中，大約20%的小分子藥物和30%的活性化合物是鹵代物。其中色氨酸鹵化物應(yīng)用最為廣泛，色氨酸又稱β-吲哚基丙氨酸，其結(jié)構(gòu)中的吲哚環(huán)是鹵化物進(jìn)行取代的位置[3]。常見的鹵素有氟、氯、溴和碘，其中氯和溴的鹵代產(chǎn)物是目前最常見也是研究最多的。近年來隨著對鹵化酶研究的逐漸深入，酶合成法以其優(yōu)點(diǎn)正逐漸成為合成鹵代物的主要方法[4]。尤其是色氨酸鹵化酶對底物的高選擇性使色氨酸可以在特定的位置進(jìn)行鹵代，得到人們想要的產(chǎn)物。另外，對色氨酸鹵化酶結(jié)構(gòu)的改變也可以改變其鹵代的位置，因此色氨酸鹵化酶逐漸得到關(guān)注。本文對色氨酸鹵化酶的分類和來源、酶學(xué)性質(zhì)、異源表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能以及催化機(jī)理等方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 色氨酸鹵化酶的分類和來源

黃素依賴型鹵化酶(Flavin-dependent halogenases, FDHs)是一類依賴黃素參與，催化天然產(chǎn)物鹵化生成鹵代化合物的酶[5-6]。其中研究最多的是色氨酸鹵化酶(tryptophan halogenase)，它是將鹵素原子特異性地鹵化在色氨酸中的吲哚環(huán)上，產(chǎn)生相對應(yīng)的鹵化產(chǎn)物的一種酶。根據(jù)鹵素在吲哚環(huán)上取代位置的不同可以分為色氨酸2-鹵化酶[7]、色氨酸5-鹵化酶、色氨酸6-鹵化酶和色氨酸7-鹵化酶。自從1959年在海洋中發(fā)現(xiàn)第一株產(chǎn)生色氨酸鹵化酶的Caldariomycesfumago(煙霉卡爾霉菌)[8-9]之后，目前已知能夠獲得色氨酸鹵化酶的菌株有如下幾種：Streptomycestoxytricini(毒三素鏈霉菌)[10]、Lechevalieriaaerocolonigenes(產(chǎn)氣列契瓦尼爾氏菌)[11]、Streptomycesalbogriseolus(白淺灰鏈霉菌)[12]、Streptomycesalbus(白色鏈霉菌)[13]、Streptomycesviolaceusniger(紫黑鏈霉菌)[14]、Saccharomonosporasp.(糖單孢菌)[15]、Pseudomonasfluorescens(熒光假單胞菌)[16]，其中以放線菌為主。

2 色氨酸鹵化酶的酶學(xué)性質(zhì)

作為最重要的色氨酸鹵化酶之一，色氨酸7-鹵化酶PrnA是Hammer等[16]在1997年從P.fluorescens中的硝吡咯菌素生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)的。PrnA此前已被證明可以催化色氨酸以外的許多吲哚衍生物的氯化反應(yīng)。其分子量在55～60 kDa之間，最適作用溫度為30 ℃。在這個生物合成途徑中同時還發(fā)現(xiàn)了PrnC，也是色氨酸7-鹵化酶[17]。RebH也是色氨酸7-鹵化酶，它來自L.aerocolonigenes，同時存在的還有一種黃素還原酶RebF。RebH催化L-色氨酸氯化反應(yīng)的Kcat值為1.4 min-1，Km值為2.0 μmol/L[18]。從Kutzneriasp. 744中擴(kuò)增出KtzQ、KtzR和KtzS的基因，分別為色氨酸7-鹵化酶、色氨酸6-鹵化酶和黃素還原酶。其中KtzQ和KtzR進(jìn)行串聯(lián)作用，催化L-色氨酸氯化反應(yīng)生成6，7-二氯-L-色氨酸。通過對KtzQ的動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，以色氨酸和6-氯-色氨酸為底物的Km值均≤2 μmol/L，Kcat分別為0.19 min-1和0.07 min-1。KtzQ是一種區(qū)域特異性色氨酸7-鹵化酶，在未經(jīng)修飾的L-Trp的7位有鹵化傾向，但也會催化6-氯底物的鹵化[19]。

目前已經(jīng)報道的色氨酸6-鹵化酶有SttH、Thal、BorH、Th-Hal、Tar14、KtzR和SatH。從S.toxytriciniNRRL 15443中獲得的SttH作用溫度范圍為20～55 ℃，作用pH范圍為4.5～8.5，且在40 ℃和pH 6時活性最大。通過His6標(biāo)記的SttH在大腸埃希菌中表達(dá)后， SDS-PAGE檢測顯示其大小為59 kDa[10]。來自S.albogriseolus的Thal也被稱作ThdH，30 ℃，pH 7.2時活性最高。經(jīng)過純化后該酶分子量約為60 kDa。Thal的Kcat值為2.8 min-1，與色氨酸5-鹵化酶PyrH(0.5 min-1)、色氨酸7-鹵化酶PrnA(0.1 min-1)和RebH(1.4 min-1)的Kcat值相當(dāng)[12,20]。BorH與BorF是由氯化雙吲哚生物堿Borregomycin A的生物合成基因簇編碼的兩個蛋白質(zhì)。BorH氯化色氨酸的最佳反應(yīng)溫度為45 ℃，Kcat為4.42 min-1，Km為9.78 μmol/L。該酶屬于嗜熱性的色氨酸鹵化酶[21]。同樣作為嗜熱性的鹵化酶Th-Hal則來自于S.violaceusniger。其最適反應(yīng)溫度也為45 ℃，Kcat和Km值分別為5.1 min-1和20.4 μmol/L[14]。海洋細(xì)菌Saccharomonosporasp.可以催化L-色氨酸轉(zhuǎn)化為L-4-氯尿氨酸(L-4-Chlorokynurenine)，這一過程需要四種酶進(jìn)行催化，分別是Tar13、Tar14、Tar15和Tar16。其中Tar14為色氨酸鹵化酶，其動力學(xué)參數(shù)Kcat和Km值分別為0.4 min-1和12 μmol/L[15]。前文提到的KtzR，除了可以將色氨酸鹵化為6-氯-色氨酸，還可以將7-氯-色氨酸鹵化為6, 7-二氯-色氨酸[18,22]。并且以7-氯-色氨酸為底物的Kcat (1.4 min-1)比以色氨酸為底物的Kcat(0.08 min-1)高約18倍，而Km值則僅為后者的1/7，因此KtzR對于7-氯-色氨酸的選擇性高于未經(jīng)修飾的色氨酸。SatH是由Lee等[13]通過將BorH的基因進(jìn)行BLAST后在S.albus中發(fā)現(xiàn)的一種色氨酸6-鹵化酶，與Th-Hal、 SttH和PyrH相比，在氯化反應(yīng)中，SatH催化生成6-氯-色氨酸的產(chǎn)率僅低于Th-Hal，但在溴化反應(yīng)中，SatH的產(chǎn)物得率最高。

相比于色氨酸6-鹵化酶，色氨酸5-鹵化酶的報道相對較少，只有SpmH、PyrH、MibH和XszenFHal。SpmH來源于Streptomycessp. SCSIO 03032，Liu等[23]通過基因缺失，體外表達(dá)的方式確定了其為色氨酸5-鹵化酶。來自于StreptomycesrugosporusLL-42D005(盧氏鏈霉菌)中的PyrH，其最適反應(yīng)溫度為30 ℃，最適反應(yīng)pH為7.2[24]。Foulston等[25]通過缺失分析確定了Microbisporacorallina(珊瑚小雙孢菌)中幾個mib基因的功能并說明了MibH是5位的色氨酸鹵化酶。Jérémy等[26]克隆了Xenorhabdusszentirmaii(嗜線蟲致病桿菌)中148個可能的鹵化酶基因，表達(dá)后發(fā)現(xiàn)只有Fhal16對色氨酸具有鹵化活性并命名為XszenFHal。其最適反應(yīng)溫度為25 ℃，Kcat值為4.44 min-1，Km值為58.22 μmol/L。

對于催化2號位取代的色氨酸鹵化酶的研究較少。有報道的色氨酸2-鹵化酶是CdmE,Rachid等[27]對ChondromycescrocatusCm c5(藏紅花軟骨霉?fàn)罹?的軟骨酰胺生物合成基因簇進(jìn)行了鑒定，證明CdmE是色氨酸2-鹵化酶。

3 色氨酸鹵化酶的異源表達(dá)

目前已知生產(chǎn)色氨酸鹵化酶的菌大多是放線菌，因此對于該酶的研究多集中于基因克隆以及在E.coli(大腸埃希菌)中的異源表達(dá)[28-29]。從P.fluorescensBL915菌株中分離到一個包含四種酶的基因簇(prnABCD)[17]，其中prnA基因產(chǎn)物催化L-色氨酸氯化生成7-氯-L-色氨酸。后來Burd等[30]將prnA基因連接到pUC18上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliTG1中進(jìn)行表達(dá)。同時又對在P.aureofaciensACN中發(fā)現(xiàn)的prnA基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)來自不同細(xì)菌的同種酶具有96%的同源性。從L.aerocolonige的基因組中擴(kuò)增出色氨酸7-鹵化酶RebH和RebF的基因[31]，連接到pET28a上，轉(zhuǎn)入E.coliBL21中進(jìn)行表達(dá)。通過體外酶反應(yīng)發(fā)現(xiàn)在沒有RebF的情況下，RebH表現(xiàn)出低水平的氯化活性。通過改變兩種酶組分的比例發(fā)現(xiàn)，RebF/RebH的比例為3∶1時活性最佳[18]。Zeng等[10]從S.toxytriciniNRRL 15443中克隆了色氨酸6鹵化酶基因stth，連接至pET28a中并轉(zhuǎn)入E.coliBL21 CodonPlus(DE3)-RIL中成功進(jìn)行了表達(dá)。Lee等[13]從S.albusN-16041擴(kuò)增出基因sath，克隆到pET28a中并轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得到色氨酸6-鹵化酶SatH。

4 色氨酸鹵化酶結(jié)構(gòu)與功能

為了進(jìn)行色氨酸鹵化酶一級結(jié)構(gòu)與功能的分析，選取了具有代表性的10個色氨酸鹵化酶，它們均來自于細(xì)菌，分別是催化2號位鹵化的CmdE，催化5號位鹵化的PyrH和MibH，催化6號位鹵化的Thal、KtzR和SttH，催化7號位鹵化的RebH、KtzQ、PrnA和PrnC。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索獲得它們的氨基酸序列后，使用CLC Sequence Viewer軟件對這10組氨基酸序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)(圖1)，色氨酸鹵化酶中有3個高度保守的關(guān)鍵基序，分別是GxGxxG、WxWxIP和FxxPxxSxG。其中N-末端附近的GxGxxG基序可能是與黃素進(jìn)行結(jié)合的位點(diǎn)，而序列中間的WxWxIP推測是為了防止酶催化單加氧反應(yīng)而存在的，最后的FxxPxxSxG基序目前并沒有明確的認(rèn)識。從圖1中可以看出KtzR并沒有GxGxxG基序，分析可能是因?yàn)樗怯脕泶呋孜?-氯-色氨酸鹵化的，很可能還存在其他的酶來幫助其完成反應(yīng)。目前雖然確定了KtzR具有鹵化酶特征，但哌嗪部分的氯化還沒有被詳細(xì)闡明，因此需要對Kutzneriasp.進(jìn)行進(jìn)一步的基因組分析。

從最早得到PrnA的晶體之后，已經(jīng)有1個色氨酸5-鹵化酶(PyrH)，2個色氨酸7-鹵化酶(PrnA和RebH)和4個色氨酸6-鹵化酶(SttH、Th-Hal、Thal和Tar14)的晶體結(jié)構(gòu)被解析出來。以PrnA為例(圖2A)，其結(jié)構(gòu)為1.95 ?，由2～518個殘基組成，是一個二聚體。每個單體都是一個單一的結(jié)構(gòu)域，形狀像一個盒子，一面連著一個三角形的金字塔。這個盒子推測是FAD的結(jié)合模塊，被兩個大的β折疊所占據(jù)。異咯嗪環(huán)的C4-N5邊緣位于反向平行的β折疊的一個面上方。序列比對表明，在黃素依賴型鹵化酶中，只有黃素結(jié)合模塊是保守的[32]。這些晶體結(jié)構(gòu)的闡明極大地促進(jìn)了對反應(yīng)機(jī)理和區(qū)域選擇性的理解[33-34]。

色氨酸鹵化酶的產(chǎn)物立體選擇性非常高， 即每種酶通常只能有一個取代鹵化位置，得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)十分確定[31]。對于天然底物L(fēng)-Trp，依賴于黃素的色氨酸鹵化酶的鹵化位點(diǎn)不是由底物的電子因素決定，而是由底物在活性位點(diǎn)的取向決定的。在色氨酸7-鹵化酶PrnA與底物色氨酸復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)中(圖2B)，賴氨酸(K79)和谷氨酸殘基(E346)位于底物附近，兩者都是酶催化所必需的氨基酸。Flecks等[35]認(rèn)為次氯酸與賴氨酸和谷氨酸殘基的協(xié)同作用能增加鹵素原子的親電性，并且還能確保鹵素離子的正確定位。吲哚環(huán)中的其他活性位置被大的芳香族氨基酸色氨酸(W455)和苯丙氨酸(F103)所遮蔽，底物被夾在中間。色氨酸的羧酸和氨基與兩個酪氨酸殘基和一個谷氨酸殘基相互作用，吲哚的NH基團(tuán)與肽鍵氧原子形成氫鍵，導(dǎo)致吲哚環(huán)的7號位指向隧道(酶中的一條通道)，進(jìn)而使得色氨酸吲哚環(huán)的7號位置成為鹵素原子唯一可以進(jìn)行結(jié)合的位置。因此PrnA的結(jié)構(gòu)決定了其只能催化色氨酸在7號位進(jìn)行鹵化。該理論同時被色氨酸5-鹵化酶PyrH的結(jié)構(gòu)所證實(shí)，在色氨酸5-鹵化酶PyrH的三維結(jié)構(gòu)中，催化所涉及的氨基酸殘基與異丙嗪環(huán)的位置與它們在色氨酸7-鹵化酶PrnA中的位置相同。同樣在色氨酸5-鹵化酶PyrH與底物色氨酸復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)中，色氨酸吲哚環(huán)的5號位置是指向隧道的，因此進(jìn)行的是5位上的鹵化[8]。

圖1 色氨酸鹵化酶氨基酸序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of tryptophan halogenasesRebH, GenBank:AAN01206.1；Thal, GenBank:ABK79936.1；KtzQ, GenBank:ABV56597.1；PrnA, GenBank:AAB97504.1;KtzR,GenBank:ABV56598.1；SttH, GenBank:ADW94630.1；PyrH,GenBank:AAU95674.1；MibH,GenBank: ADK32653.1； PrnC, GenBank:AAY92872.1； CmdE, GenBank:CAJ46693.1

圖2 色氨酸鹵化酶PrnA結(jié)構(gòu)(A)以及與底物的結(jié)合位點(diǎn)(B)[32]Fig.2 Structure of tryptophan halogenase PrnaA(A) and bingding site with substrate(B)[32]

2010年，Lang等[8]對PrnA的氨基酸殘基苯丙氨酸(F103A)進(jìn)行突變，使其從7位鹵化變?yōu)?位鹵化為主，首次證明了色氨酸鹵化酶的區(qū)域選擇性可以通過定點(diǎn)突變來實(shí)現(xiàn)。對色氨酸6-鹵化酶Thal進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，盡管Thal在序列和結(jié)構(gòu)上更接近色氨酸7-鹵化酶RebH而不是色氨酸5-鹵化酶PyrH，但Thal活性位點(diǎn)上的吲哚結(jié)合形式更接近PyrH。Moritzer等[36]將Thal活性位點(diǎn)上的5個氨基酸與RebH中的相應(yīng)氨基酸進(jìn)行了交換，產(chǎn)生了5個突變體Thal-RebH5。Thal-RebH5突變體對色氨酸的總體轉(zhuǎn)化能力與野生型Thal相似，但其氯化和溴化的區(qū)域選擇性幾乎完全從6位轉(zhuǎn)變?yōu)?位，雖然仍有少量6位鹵代產(chǎn)物存在。因此，以少量殘基為靶點(diǎn)的基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程是改造色氨酸鹵化酶的有效途徑之一[37]。

5 色氨酸鹵化酶的催化機(jī)理

色氨酸鹵化酶屬于黃素依賴型鹵化酶，目前關(guān)于黃素依賴型鹵化酶的催化機(jī)理已經(jīng)基本明確。要使底物鹵化，依賴于黃素的鹵化酶需要還原的黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)、分子氧和鹵化物鹽(通常是Cl-或Br-)共同參與[38]。通常黃素還原酶與黃素依賴型鹵化酶一起存在于生物合成的基因簇中，形成一個雙組分系統(tǒng)，例如RebH和RebF。因此其作用機(jī)理可以分為兩步：還原反應(yīng)和鹵化反應(yīng)。還原反應(yīng)是黃素還原酶將FAD還原為FADH2。之后進(jìn)入鹵化反應(yīng)，先前生成的FADH2與黃素依賴型鹵化酶中的FAD結(jié)合模塊結(jié)合，F(xiàn)ADH2就會與分子氧反應(yīng)生成黃素過氧化氫(FAD(C4a)-OOH)。然后，F(xiàn)AD(C4a)-OOH與鹵化物陰離子反應(yīng)，鹵素變成次鹵酸(HOX)，黃素過氧化氫變成FAD(C4a)-OH。次鹵酸向酶活性部位擴(kuò)散，主要是向催化必需的賴氨酸殘基的ε-氨基移動，在那里底物發(fā)生鹵化反應(yīng)。動力學(xué)分析證實(shí)，底物鹵化發(fā)生在黃素氧化還原反應(yīng)完成之后，底物不參與從FADH2到FAD(C4a)含氧物再到FAD的反應(yīng)[36]。圖3為催化機(jī)理示意圖。

圖3 黃素依賴型鹵化酶(FDH)催化機(jī)理圖[36]Fig.3 Catalytic mechanism of flavin dependent halogenase (FDH)[36]

色氨酸鹵化酶與黃素依賴型鹵化酶的催化機(jī)理基本相同，只是反應(yīng)底物為色氨酸。而色氨酸被鹵化的位置是通過底物相對于催化必須的賴氨酸的ε-氨基的定位來決定的。底物色氨酸的5、6、7號位與賴氨酸的接近程度，可以決定色氨酸在哪個位置發(fā)生鹵化。

此外人們對FAD還原機(jī)制的細(xì)節(jié)知之甚少。例如，F(xiàn)AD是在與黃素依賴型鹵化酶結(jié)合的情況下被還原，還是必須從鹵化酶上解離后才被還原，目前還不完全清楚[36]。

6 色氨酸鹵化酶的應(yīng)用

鹵代芳香化合物有廣泛的應(yīng)用，是醫(yī)藥、農(nóng)用化學(xué)品和其他貴重材料的重要合成成分[39]。傳統(tǒng)的鹵代芳香化合物的生產(chǎn)需要苛刻的反應(yīng)條件，往往需要有害的試劑、催化劑和溶劑。另外反應(yīng)選擇性較差，會產(chǎn)生多種副產(chǎn)物。不僅副產(chǎn)物分離困難，并且由于其在環(huán)境中的毒性或持久性而難以處理。因此，利用自然界的鹵化酶實(shí)現(xiàn)更清潔和更有區(qū)域選擇性的鹵化反應(yīng)一直是研究的重點(diǎn)[9]。

色氨酸鹵化酶具有在特定位置鹵化的特點(diǎn)，可以用來生產(chǎn)相應(yīng)的色氨酸鹵化衍生物。軟骨酰胺(Chondramides)是含有2氯色氨酸的化合物，色氨酸殘基可經(jīng)氯化修飾成軟骨酰胺B和軟骨酰胺D的中間產(chǎn)物。研究表明，軟骨酰胺是由CmdE(色氨酸2-鹵化酶)在色氨酸吡咯環(huán)的2號位氯化產(chǎn)生的[27]。吡咯烷霉素B(Pyrroindomycin B)是一種對革蘭陽性菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)有效的抗生素，是從S.rugoporus中分離出來的。其結(jié)構(gòu)包括一個聚酮大環(huán)和三糖連接到從氯化色氨酸衍生的吡咯吲哚部分。氯化反應(yīng)發(fā)生在吲哚環(huán)的5位，催化反應(yīng)的酶是MibH(色氨酸5鹵化酶)[25]。噻諾林(Thienodolin)是一種從S.toxytricini中分離出來的吲哚硫酚生物堿，其中關(guān)鍵的鹵化反應(yīng)是由兩個色氨酸6鹵化酶Thal和SttH共同催化完成的[10]。Kutznerides是從Kutzneriasp.中分離得到的具有抗真菌和抗細(xì)菌活性的環(huán)狀六肽，在6位和7位都有氯原子。與噻諾林類似，Kutznerides也是由兩個酶共同作用形成的，分別為KtzQ(色氨酸6-鹵化酶)和 KtzR(色氨酸7-鹵化酶)[19]。瑞貝卡霉素(Rebeccamycin)是從Saccharothrixaerocolonigenes(氣生菌落諾卡氏菌)中分離出來的一種抗腫瘤化合物，其關(guān)鍵性中間產(chǎn)物是在RebF的存在下，RebH催化L-Trp區(qū)域特異性氯化生成的7-氯色氨酸[18]。

目前已知的色氨酸鹵化酶對氯原子有明顯的偏好性，對于溴原子活性較低，其他鹵素碘和氟則基本沒有活性[40]。氯化色氨酸和溴化色氨酸在自然界中通常不以游離形式存在，而是作為復(fù)雜結(jié)構(gòu)中的生物合成前體存在。目前有文獻(xiàn)報道可以在低氯、高溴濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能表達(dá)RebH和RebF的谷氨酸單胞菌，從而生產(chǎn)7-Br-Trp[41]。另外，雖然色氨酸鹵化酶PrnA不能碘化其天然底物色氨酸，但可以催化一些非天然底物的碘化，盡管其轉(zhuǎn)化率僅在1%左右[42]。

7 展 望

目前國內(nèi)外對于鹵化酶的研究還不夠深入，特別是一些鹵代天然產(chǎn)物的生物合成途徑尚未完全明確。其中有機(jī)溴化合物在海洋中普遍存在，含氯化合物則主要來自于陸地，而天然有機(jī)碘化合物相對較少，含氟化合物更是少之又少。因此繼續(xù)開發(fā)新的鹵化產(chǎn)物，并找到催化鹵化的關(guān)鍵酶就顯得尤為重要。

在眾多鹵化酶中，色氨酸鹵化酶是其中被研究最廣泛的一類。雖然已經(jīng)獲得了多個色氨酸鹵化酶晶體，但是仍不能完全揭示其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的相互關(guān)系，特別是鹵化位點(diǎn)的選擇性機(jī)理還不十分明確。本課題組(微生物與生物催化課題組)最近從1株海洋放線菌中克隆到一個新的色氨酸鹵化酶基因，與已知的色氨酸鹵化酶的同源性較低。將其在E.coli(大腸埃希菌) BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，該酶可以催化色氨酸鹵化產(chǎn)生兩種產(chǎn)物；通過液質(zhì)聯(lián)用以及核磁共振氫譜測定，確定這兩種鹵化產(chǎn)物分別為7-氯色氨酸和6, 7-二氯色氨酸。因此這是一種全新的雙功能色氨酸鹵化酶，目前正在進(jìn)行這一新酶的結(jié)晶相關(guān)研究，同時也在通過理性和非理性設(shè)計(jì)改造該色氨酸鹵化酶，希望能增強(qiáng)其鹵化活性，同時獲得更多新的色氨酸鹵化產(chǎn)物。

另外，對于色氨酸鹵化酶的研究主要集中于5位、6位和7位，而對于能鹵化色氨酸吡咯環(huán)上其他位點(diǎn)的鹵化酶的研究則較少，需要不斷尋找和發(fā)現(xiàn)新的色氨酸鹵化酶。宏基因組數(shù)據(jù)分析是尋找新的鹵化酶的有力工具，其巨大優(yōu)勢在于其不僅提供了可培養(yǎng)微生物的基因組數(shù)據(jù)，而且還提供了非可培養(yǎng)微生物的基因組數(shù)據(jù)。但是，從沒有明顯特征的有機(jī)體中確定酶的天然底物仍然是一個不小的挑戰(zhàn)。不斷發(fā)展的現(xiàn)代化技術(shù)將為色氨酸鹵化酶基因的發(fā)現(xiàn)、功能的確定以及結(jié)構(gòu)的改造提供極大的便利，酶法鹵化取代化學(xué)方法將是一個必然趨勢。隨著研究的深入，關(guān)于色氨酸鹵化酶結(jié)構(gòu)和功能的研究必將會有新的突破，鹵化產(chǎn)物的人工合成也將進(jìn)入新的發(fā)展階段。