王念,魏純玲，蔣世雙，陶武，唐澤

急性肝損傷是指在較短時(shí)間內(nèi)迅速發(fā)生的肝細(xì)胞損傷[1]。目前，我國(guó)急性肝損傷患者主要以藥物性肝損傷為主，且發(fā)病率逐年增加[2]。研究表明[3]，蓮心堿對(duì)肝臟有保護(hù)作用，可清除氧自由基、減輕脂質(zhì)過氧化損傷。甲基蓮心堿屬于蓮心堿的一種，其可以有效清除氧自由基[4]。目前，國(guó)內(nèi)少有關(guān)于應(yīng)用甲基蓮心堿治療急性肝損傷的研究。本研究采用D-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)昆明種小鼠急性肝損傷，通過測(cè)定小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)、谷胱氨肽（GSH）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α)、白細(xì)胞介素-6（IL-6)和白細(xì)胞介素-10（IL-10)水平，觀察了甲基蓮心堿對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初探，以期為急性肝損傷的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器、藥品與試劑 80只昆明種雄性小鼠購(gòu)于重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2016-0001]，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量 15～25 g,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。Allegra25R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司），7600全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）、UV1800紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。甲基蓮心堿（HPLC≥98%）、脂多糖、D-半乳糖胺（大連美侖美生物技術(shù)有限公司），檢測(cè)ALT、AST、SOD、MDA、GSH、TNF-α、IL-6和IL-10試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 急性肝損傷小鼠模型構(gòu)建[5]將80只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組，每組20只。給予正常組和模型組小鼠生理鹽水灌胃，在小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠，分別給予100 mg.kg-1和300 mg.kg-1甲基蓮心堿溶液灌胃。在模型組、小劑量和大劑量甲基蓮心堿組小鼠，在末次給藥后1 h，按0.2 mL/10 g體積給予脂多糖（40 μg.kg-1）和 D- 半乳糖胺（600 mg.kg-1）腹腔注射，構(gòu)建急性肝損傷小鼠模型。觀察小鼠造模后表現(xiàn)，并給予少量水和飼料，12 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材。

1.3 觀察與檢測(cè)和檢查 造模12 h后，每組取10只小鼠，摘眼球取血。離心后取血清，行有關(guān)檢測(cè)。取血后，處死小鼠，解剖并取肝臟，制備切片，觀察其病理學(xué)變化。在每組剩余10只小鼠，觀察存活時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。對(duì)服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析各組小鼠存活率的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清ALT和AST水平比較 與正常組比，模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；甲基蓮心堿處理組動(dòng)物血清ALT和AST水平顯著低于模型組（P＜0.01）；大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清ALT和AST水平均顯著低于小劑量甲基蓮心堿組（P＜0.01，表1）。

表1 四組小鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

表1 四組小鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05；與小劑量甲基蓮心堿組比，③P＜0.05

只 ALT（U/L） AST（U/L）正常組 10 65.3±16.5 127.1±25.3模型組 10 272.4±42.8① 497.2±62.1①小劑量甲基蓮心堿 10 198.6±39.2①② 327.9±60.6①②大劑量甲基蓮心堿 10 138.8±28.9①②③ 223.0±45.5①②③

2.2 各組小鼠血清SOD、MDA和GSH水平比較 與正常組比，模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清SOD和GSH水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)，而血清MDA水平顯著升高（P＜0.01）；甲基蓮心堿處理組小鼠血清SOD和GSH水平顯著高于（P＜0.01），而血清MDA水平顯著低于模型組（P＜0.01）；大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清SOD和GSH水平顯著高于小劑量甲基蓮心堿組（P＜0.01），而血清MDA水平顯著低于小劑量甲基蓮心堿處理組（P＜0.01，表2）。

2.3 各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平比較 與正常組比較，模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平均顯著升高（P＜0.05)；甲基蓮心堿處理組小鼠血清TNF-α水平顯著低于模型組（P＜0.05），大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠血清IL-6和IL-10水平與模型組比較，差異顯著（P＜0.05）；大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平與小劑量甲基蓮心堿處理組比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表 3）。

表2 四組小鼠血清SOD、MDA和GSH水平（±s）比較

表2 四組小鼠血清SOD、MDA和GSH水平（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05；與小劑量甲基蓮心堿組比，③P＜0.05

只 SOD（U/mL） MDA(mol/L)GSH(μmol/L)正常組 10 92.4±7.4 4.0±0.8 33.0±2.9模型組 10 37.5±6.2① 9.2±1.4① 11.8±2.7①小劑量甲基蓮心堿 10 61.8±5.5①② 7.6±1.2①② 20.4±2.2①②大劑量甲基蓮心堿 10 82.5±7.3①②③ 6.1±0.9①②③ 26.6±2.8①②③

表3 四組小鼠血清細(xì)胞因子水平（pg/ml,±s）比較

表3 四組小鼠血清細(xì)胞因子水平（pg/ml,±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 TNF-α IL-6 IL-10正常組 10 440.2±52.5 100.6±19.8 81.0±8.4模型組 10 587.6±48.9① 153.4±18.0① 96.4±9.7①小劑量甲基蓮心堿 10 511.2±50.4①②136.6±18.4① 104.3±9.8①大劑量甲基蓮心堿 10 489.0±46.3①② 122.1±18.8①② 110.5±10.1①②

2.4 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)的變化 正常組小鼠肝組織細(xì)胞排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或細(xì)胞壞死；模型組小鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞呈灶性壞死；小劑量甲基蓮心堿處理組小鼠肝組織有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列較混亂；大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠肝組織病變減輕，僅有小部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，400×）

2.5 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物存活率比較 模型組小鼠12 h存活率為60.0%，24 h存活率為10.0%；小劑量甲基連心堿處理組小鼠12 h存活率為80.0%，24 h存活率為50.0%，而大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠12 h存活率為90.0%，24 h存活率為70.0%（圖2），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 三組小鼠存活率比較

3 討論

磷酸尿苷對(duì)維持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有著重要的作用[6]，D-半乳糖胺能夠降低肝細(xì)胞內(nèi)磷酸尿苷含量[7]。脂多糖可激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)而釋放大量的炎性細(xì)胞因子，阻礙肝臟微循環(huán)，引發(fā)肝臟缺血、缺氧和氧化應(yīng)激反應(yīng)等，引起肝損傷[8-9]。本研究通過觀察模型組小鼠存活情況，得知24 h內(nèi)死亡10只，存活率僅為10.0%。同時(shí)，血清ALT和AST水平急劇升高。進(jìn)一步觀察肝組織病理學(xué)表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，肝組織細(xì)胞排列混亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞呈現(xiàn)灶性壞死。以上結(jié)果表明，本次通過D-半乳糖胺和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型制備成功。

給予小鼠甲基蓮心堿預(yù)處理后，其血清ALT和AST水平降低，肝組織病理學(xué)切片觀察顯示肝損傷情況得到一定程度的緩解，而小鼠存活率也得到明顯提升，提示應(yīng)用甲基蓮心堿對(duì)于D-半乳糖胺和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，血清MDA水平升高[10]。本研究模型組小鼠血清MDA水平急劇升高，表明其氧化應(yīng)激程度較高。SOD可催化超氧陰離子分解，產(chǎn)生氧氣和過氧化氫[11]。GSH是谷胱甘肽過氧化物酶的底物，能反映機(jī)體抗氧化和清除氧自由基的能力，其與抗氧化酶共同作用，減弱氧化應(yīng)激損傷[12，13]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清SOD和GSH水平降低，表明其肝臟內(nèi)發(fā)生了劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，與以往研究結(jié)果一致[14-16]。給予甲基蓮心堿灌胃處理的小鼠，其血清MDA水平顯著降低，而血清SOD和GSH水平顯著升高，表明甲基蓮心堿可有效抑制肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效保護(hù)肝臟損傷。有研究[17，18]顯示，在肝臟發(fā)生急性損傷時(shí)，機(jī)體釋放大量的TNF-α和IL-6等炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)更趨嚴(yán)重。IL-10具有抗炎作用，能夠直接抑制TNF-α生成，間接抑制IL-6生成[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲基蓮心堿能夠降低急性肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平，升高IL-10水平，其結(jié)果說明甲基蓮心堿還可以調(diào)節(jié)炎性因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)肝臟作用。

綜上所述，甲基蓮心堿可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效保護(hù)肝臟損傷，其機(jī)制可能與降低血清MDA、TNF-α和IL-6水平，升高SOD、GSH和IL-10水平有關(guān)。下一步我們將檢測(cè)小鼠肝組織SOD、GSH、MDA、TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA水平，進(jìn)一步從基因水平研究甲基蓮心堿保護(hù)肝臟的分子機(jī)制。