楊國棟，錢慧蓉，陳　林，王賢榮

（南京林業(yè)大學(xué) a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

種子是祼子植物和被子植物特有的繁殖體，對(duì)延續(xù)物種起著重要作用。被子植物個(gè)體發(fā)育過程中，胚的發(fā)育是在母體內(nèi)完成的，伴隨胚的發(fā)育，同時(shí)發(fā)生著胚乳和其他營養(yǎng)物質(zhì)的形成。在這一過程中外部種皮形態(tài)結(jié)構(gòu)特征也發(fā)生變化[1]。種皮是種子適于傳播或抵抗不良條件的結(jié)構(gòu)，為植物的種族延續(xù)創(chuàng)造了良好的條件；同時(shí)維持種子內(nèi)部的形態(tài)建成[2-3]，并且參與調(diào)節(jié)與種子休眠和萌發(fā)有關(guān)的生理活動(dòng)[4-5]。而在種子內(nèi)部進(jìn)行著一系列的生物化學(xué)變化，為種子的休眠創(chuàng)造了一定的條件。種子休眠，是有生命力的種子由于胚或種殼的因素在適宜的環(huán)境條件下仍不能萌發(fā)的現(xiàn)象。休眠是植物在長期系統(tǒng)發(fā)育過程中獲得的一種抵抗不良環(huán)境的適應(yīng)性，是調(diào)節(jié)種子萌發(fā)的最佳時(shí)間和空間分布的有效方法[6-7]。

短絲木犀Osmanthus serrulatus又名寶興桂花，為木犀科Oleaceae木犀屬Osmanthus特有的春季開花種之一，具有較高的生態(tài)和園林價(jià)值[8]。但由于其獨(dú)特的生境需求和長期以來的人為干擾，短絲木犀呈片段化破碎分布，近年來僅在四川的西嶺雪山、峨眉山、東拉山、漢源、金口河等地區(qū)海拔1 800～2 000 m的山地林中有所發(fā)現(xiàn)，其中東拉山集中分布于海拔1 900 m的短絲木犀種群是迄今為止發(fā)現(xiàn)的面積最大的野生桂花種群。

短絲木犀是非常罕見珍貴的野生桂花資源，極具觀賞價(jià)值，但是由于其數(shù)量少，分布范圍狹小，且種子在自然生境下有隔年萌發(fā)現(xiàn)象，林下更新困難，其種質(zhì)資源亟待保護(hù)。但目前對(duì)短絲木犀的研究非常少[9-11]，尤其是對(duì)其種子的研究寥寥無幾。

通常種皮的機(jī)械障礙和種胚發(fā)育過程中內(nèi)源萌發(fā)抑制物等是引起種子休眠的主要因素[12-13]，而短絲木犀的種子在萌發(fā)過程中也存在生理后熟的現(xiàn)象。但休眠過程中短絲木犀種子的種皮特性、種胚發(fā)育狀況及內(nèi)源抑制物質(zhì)變化情況尚不明確[14]，而這種變化過程與種子休眠的形成有著直接聯(lián)系[15-16]。本研究借助顯微電鏡技術(shù)，著重研究其成熟過程種皮和胚乳的超微結(jié)構(gòu)變化，以期了解短絲木犀種子休眠產(chǎn)生的原因，找到更好地解除種子休眠的方法，為短絲木犀種質(zhì)資源的保護(hù)研究和推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料及處理

短絲木犀實(shí)驗(yàn)種子采集于四川省雅安市寶興縣東拉山大峽谷。實(shí)驗(yàn)前先對(duì)采收的短絲木犀種子進(jìn)行X-光檢測和TZ染色實(shí)驗(yàn)，測試質(zhì)量和活力。然后密封后放入冰箱進(jìn)行干燥低溫處理，以備長期保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取保存良好的、生活力后符合質(zhì)量要求的短絲木犀種子進(jìn)行自然層積處理。

1.2　種皮及胚乳的電鏡觀察

1.2.1種皮結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

考慮到短絲木犀的原始生境，在室內(nèi)培養(yǎng)箱中模擬短絲木犀自然生境下的溫度和濕度條件，對(duì)其種子進(jìn)行自然層積。從2014年9月20日開始對(duì)短絲木犀種子自然層積，于2015年4月、8月、12月和2016年4月、8月取樣，具體時(shí)間為每月的15號(hào)，共取6次。通過掃描電鏡對(duì)短絲木犀胚根端種皮的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)拍照。通過掃描電鏡（SEM）對(duì)短絲木犀種子中間部位及子葉末端種皮的縱切面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并拍照[17]。

1.2.2胚乳的透射電鏡觀察

取自然層積處理的短絲木犀種子（同上），用液氮處理后橫斷切開，觀察近胚根處和中部，通過透射電鏡（TEM）對(duì)胚乳超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行觀察并拍照[18]。

2　結(jié)果與分析

通過X-光檢測和TZ染色實(shí)驗(yàn)檢測短絲木犀種子的質(zhì)量和活力（如圖1a、1b）。結(jié)果顯示：短絲木犀種子平均飽滿率為60%，平均生活力為73%，滿足種子活力的基本要求，可以進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也能確保該批種子長期保存，以便后期實(shí)驗(yàn)。

2.1　自然層積短絲木犀種子種皮掃描電鏡觀察的結(jié)果

2.1.1胚根端種皮結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果

對(duì)短絲木犀種子胚根端種皮進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示，短絲木犀種子種皮表面、內(nèi)部均含有蠟質(zhì)，且隨著種子逐漸成熟，蠟質(zhì)不斷增加。自然層積6個(gè)月后，種皮表面蠟質(zhì)開始積累，但數(shù)量較少，色澤暗淡，種皮內(nèi)部開始形成形狀較小、顏色較淺的蠟質(zhì)顆粒（見圖2-a）；10個(gè)月后，種皮表面開始形成蠟層，但蠟層較薄呈下凹狀態(tài)（見圖2-b）； 12個(gè)月后，短絲木犀種子的種皮表面和內(nèi)部的蠟質(zhì)不斷增加，表面凸起了顆粒狀蠟質(zhì)，蠟層也顯著增厚（見圖2-c）；16個(gè)月后，種皮表面蠟質(zhì)濃度進(jìn)一步增加，積聚形成許多凸起的顆粒，蠟層顯著加厚，種皮內(nèi)部蠟質(zhì)也不斷增多、增大，并逐漸板結(jié)（見圖2-d）；19個(gè)月后，種子已經(jīng)接近成熟，種皮表面凸起的蠟質(zhì)顆粒被逐漸覆蓋，蠟層開始基本成形（見圖2-e）；23個(gè)月后，種子表面蠟層已經(jīng)完全成型，蠟質(zhì)分布均勻，種皮內(nèi)部蠟質(zhì)顆粒也進(jìn)一步增大并板結(jié)，形成不規(guī)則蠟塊（見圖2-f）。在整個(gè)種子發(fā)育成熟的過程中，種皮表面和內(nèi)部的蠟質(zhì)顆粒都不斷增多、增大，蠟層不斷積累加厚。

圖1　短絲木犀種子檢測Fig. 1　The results of seed detection

2.1.2中間部位及子葉末端種皮結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果

對(duì)短絲木犀種子中間部位及子葉末端種皮進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在種子發(fā)育初期（圖3-a），中間部位的種皮主要由幾層不同形態(tài)的薄壁細(xì)胞組成，隨著種子發(fā)育成熟，柵欄層不斷分化發(fā)育。

圖2　低溫層積短絲木犀不同時(shí)期種皮胚根端的表面結(jié)構(gòu)Fig. 2　The surface structure of the root surface of the embryo at different times

自然層積10個(gè)月后（圖3-b），靠近種皮外側(cè)的薄壁細(xì)胞開始分化形成柵欄細(xì)胞，此時(shí)的柵欄細(xì)胞長度較短，排列松散；12個(gè)月后（圖3-c），柵欄細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育，顯著縱向伸長，排列緊密，基本形成柵欄層。柵欄細(xì)胞的細(xì)胞壁強(qiáng)烈增厚并木質(zhì)化，增強(qiáng)了種皮的厚度和硬度，并成為水分進(jìn)入種子的主要屏障，長達(dá)一年的自然層積并沒有解除短絲木犀種殼的機(jī)械障礙和透性問題。自然層積16個(gè)月后（圖3-e），內(nèi)側(cè)薄壁細(xì)胞明顯分化為漏斗細(xì)胞，種皮形成由外到內(nèi)依次為角質(zhì)層、柵欄細(xì)胞層、薄壁細(xì)胞層的明顯3層結(jié)構(gòu)，柵欄細(xì)胞層占據(jù)種皮的絕大部分；到19個(gè)月后（圖3-f），種皮內(nèi)形成大量螺旋狀管胞結(jié)構(gòu)，且薄壁細(xì)胞分泌出大量膠狀物質(zhì)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清；最終在23個(gè)月時(shí)厚壁組織降解變薄，種殼出現(xiàn)裂口，通透性增強(qiáng)，逐漸消除機(jī)械障礙。

圖3　自然層積短絲木犀種子不同時(shí)期種皮中間部位及子葉末端的縱切面結(jié)構(gòu)Fig. 3　The longitudinal section structure of the middle part of the seed coat and the end of the cotyledon at different stages

2.1.3種子細(xì)胞壁加厚過程

短絲木犀自然層積的過程中種殼逐漸栓質(zhì)化。從種殼縱切面掃描電鏡可以看出，種殼角質(zhì)層和柵欄組織發(fā)生強(qiáng)烈的次生增厚（圖4-a），維管束具有單紋孔、多數(shù)呈橫向排列，且排列致密（圖4-b）。在短絲木犀種子成熟的中期（自然層積16個(gè)月），外表皮細(xì)胞壁加厚，比皮下組織改變的規(guī)模要大，在有一定結(jié)構(gòu)序列的種壁上，形成囊泡狀突起（圖4-c），這些大小不一的“囊泡”似乎是與次生壁增厚形成相關(guān)的纖維狀物質(zhì)的儲(chǔ)集層。相比于種壁外表皮的明顯加厚過程，次生壁的加厚過程就不是那么顯眼。圖4-d可以出，種壁次生層的活動(dòng)跡象是在主要細(xì)胞壁交界處的球體，箭頭所指的區(qū)域就是次生層增厚即將發(fā)展的地區(qū)。

2.2　自然層積短絲木犀種子胚乳透射電鏡觀察的結(jié)果

2.2.1種子胚中部位置胚乳細(xì)胞內(nèi)含物超微結(jié)構(gòu)研究

短絲木犀種子成熟時(shí)胚中部位置胚乳細(xì)胞的顯著特點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)存在液泡和少量近圓形的脂滴。由于胞質(zhì)脂滴與液泡密切接觸，使得脂滴之間散布著大量黑色沙粒狀的高電子致密物質(zhì)（圖5-a）。自然層積12個(gè)月，胚乳細(xì)胞中高爾基體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等細(xì)胞器清晰可見（圖5-b），液泡開始降解，高電子致密物質(zhì)開始聚集形成較大的塊狀結(jié)構(gòu)。自然層積16個(gè)月，細(xì)胞核清晰可見（圖5-c），大液泡分解為小液泡，脂滴數(shù)量增多且更加飽滿，線粒體、高爾基體依然存在（圖5-d）。自然層積19個(gè)月，液泡已完全降解，高電子致密物質(zhì)已聚積成較大的塊狀，脂滴體積增加，更加飽滿，充滿整個(gè)細(xì)胞，但細(xì)胞核依然存在（圖5-e），脂滴之間依然散布著大量沙粒狀的高電子致密物質(zhì)，線粒體也開始降解（圖5-f）。自然層積23個(gè)月，胚乳已發(fā)育完全，大量脂滴和高電子致密物質(zhì)充滿了整個(gè)細(xì)胞（圖5-g），細(xì)胞核形態(tài)模糊，在脂滴之間依然存在很多體積較小而電子密度更高的高電子致密物質(zhì)（圖5-h）。這一期間胚中部胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化較大，脂類物質(zhì)消融，大部分高電子致密物質(zhì)降解，仍存在部分碎片狀的高電子致密物質(zhì)（見表1）。

圖4　短絲木犀種壁和次生層加厚過程Fig. 4　Seed wall and secondary layer thickening process

2.2.2種子胚根部位置胚乳細(xì)胞內(nèi)含物超微結(jié)構(gòu)研究

圖5　短絲木犀種子自然層積過程胚中部胚乳細(xì)胞內(nèi)含物變化Fig. 5　Changes on ultrastructure of the middle endsperm ofOsmanthus serrulatusduring natural stratification

表 1　短絲木犀種子胚中部位置胚乳細(xì)胞內(nèi)含物變化?Table 1　Variation of endosperm cell contents in the middle position of the embryo ofOsmanthus serrulatus

短絲木犀種子自然成熟時(shí)胚根部胚乳細(xì)胞的顯著特點(diǎn)是含有大量高電子致密物質(zhì)和脂滴，其形狀大小不一，高電子致密物質(zhì)體積比脂滴大，但沒有中部的體積大。胚根部胚乳細(xì)胞內(nèi)壁高電子致密物質(zhì)較多而且體積較大，脂滴排列較致密（圖6-b）。在近胚根處的胚乳細(xì)胞中（圖6-c），細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣，核仁消失（圖6-d）。自然層積12個(gè)月的種子，細(xì)胞器逐漸消失，近胚根處的胚乳細(xì)胞中，液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器均已觀察不到（圖6-e）。自然層積16個(gè)月的種子（圖6-f），細(xì)胞核被擠壓縮小變形。脂滴逐漸由半透明狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥该鳡顟B(tài)，且有一些脂滴開始溶解。高電子致密物質(zhì)不斷積聚，體積增大。自然層積19個(gè)月的種子（圖6-g），細(xì)胞核已經(jīng)擠壓縮小呈不規(guī)則的楔形或星形。脂滴都變?yōu)橥该鳡顟B(tài)，且不斷消融。脂蛋白進(jìn)一步增多，高電子致密物質(zhì)進(jìn)一步積累。自然層積23個(gè)月的種子（圖6-h），細(xì)胞核變得更小，呈不規(guī)則楔形（見表2）。

圖6　短絲木犀種子自然層積過程胚根部胚乳細(xì)胞內(nèi)含物變化Fig. 6　Changes on ultrastructure of the endsperm cap ofOsmanthus serrulatusduring natural stratification

表 2　短絲木犀種子胚根部位置胚乳細(xì)胞內(nèi)含物變化Table 2　Change radicel position endosperm cell contents

3　結(jié)論與討論

通過對(duì)短絲木犀種子種皮結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察和對(duì)胚乳結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在短絲木犀種子成熟過程中，薄壁細(xì)胞逐漸木質(zhì)化和栓質(zhì)化，分化形成柵欄細(xì)胞，柵欄層不斷增厚，種皮由數(shù)層薄壁細(xì)胞組成轉(zhuǎn)變?yōu)橛山琴|(zhì)層、柵欄細(xì)胞層、薄壁細(xì)胞層三層結(jié)構(gòu)組成。種子生理休眠的一個(gè)主要因素是角質(zhì)層和柵欄層的機(jī)械阻礙，導(dǎo)致吸水困難，延遲代謝活動(dòng)[19]，由于其角質(zhì)層和柵欄層增加了種皮的厚度，導(dǎo)致短絲木犀種皮的厚度對(duì)種子萌發(fā)時(shí)突破種皮形成了阻礙。

耿文娟等[20]對(duì)野生歐洲李種子萌發(fā)特性研究發(fā)現(xiàn)了柵欄層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化引起了種皮不透性。憨宏艷等[21]對(duì)水青樹種子萌發(fā)過程中也發(fā)現(xiàn)隨著種子成熟與種皮的硬實(shí)度呈現(xiàn)正相關(guān)，種皮的增厚與柵欄層細(xì)胞收縮有關(guān)。隨著短絲木犀種子發(fā)育成熟，種皮表面和內(nèi)部的蠟質(zhì)不斷積累。蠟質(zhì)通過細(xì)胞壁全透性轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外表面，沉積形成白色蠟被層。蠟層為種子抵御外界不良環(huán)境發(fā)揮了重要作用，但同時(shí)也阻礙種子自身與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，比如水、空氣，造成短絲木犀種子萌發(fā)的障礙。而隨著短絲木犀種皮內(nèi)部蠟質(zhì)的不斷增加，逐漸板結(jié)形成不規(guī)則的蠟塊，也阻礙水分和空氣的進(jìn)入。

王家源等[22]通過對(duì)青錢柳種子的研究發(fā)現(xiàn)胚乳內(nèi)脂類物質(zhì)的迅速增加可能與其種子萌發(fā)困難有關(guān)，種子的休眠只有在高電子致密物質(zhì)和脂滴徹底降解后才能被打破；賈書果[23]對(duì)秤錘樹種子的研究也得出了相同結(jié)論。可見，在短絲木犀種子發(fā)育過程中，胚乳內(nèi)含物由小分子物質(zhì)逐漸向大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化并積累，為種子營養(yǎng)物質(zhì)的貯藏提供保障，是種子成熟的重要生理生化過程。

短絲木犀種子發(fā)育成熟過程中，胚乳內(nèi)含物也在不斷變化，其中細(xì)胞核隨著角質(zhì)層的加厚而被逐漸擠壓縮小，由前期的橢圓形逐漸變?yōu)楹笃诘牟灰?guī)則楔形，而細(xì)胞器則逐漸隨著自身成熟而溶解消失，由脂蛋白組成的高電子致密物質(zhì)不斷增多、增大，因此，隨著種子的發(fā)育，脂蛋白含量升高，脂滴不斷增加，在高電子致密物質(zhì)周圍緊密排列，且由半透明狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥该鳡顟B(tài)，到種子發(fā)育后期，脂滴和高電子致密物質(zhì)充滿整個(gè)細(xì)胞。

胚乳中含有的大量脂滴和高電子致密物質(zhì)可能對(duì)胚生長發(fā)育造成一定的機(jī)械障礙。在自然層積過程中，短絲木犀種子胚中部位置的高電子致密物質(zhì)體積明顯大于胚根部，而胚根部的高電子致密物質(zhì)和脂滴的降解速率比胚中部快。當(dāng)短絲木犀種子層積23個(gè)月種胚突破胚乳時(shí)，種胚中部中仍含有大量的脂滴和高電子致密物質(zhì)，而胚根部的高電子致密物質(zhì)和脂滴降解比較徹底。

短絲木犀種子在自然生境中隔年萌發(fā)，存在生理后熟現(xiàn)象，這給短絲木犀的繁育造成了很大困難[24]。為了揭示短絲木犀種子休眠機(jī)制，有效解除休眠促進(jìn)萌發(fā)，本研究通過觀察種子發(fā)育過程中種皮結(jié)構(gòu)變化和胚乳內(nèi)含物變化，對(duì)短絲木犀種子休眠的形成原因進(jìn)行了分析。本實(shí)驗(yàn)得出導(dǎo)致種子休眠的三個(gè)因素：第一，短絲木犀種子種皮內(nèi)外均含有蠟質(zhì)，對(duì)種皮透水性產(chǎn)生阻礙；第二，種子發(fā)育過程中，種皮形成角質(zhì)層、柵欄層和薄壁細(xì)胞層三層結(jié)構(gòu)，角質(zhì)層和柵欄層結(jié)構(gòu)增強(qiáng)種皮硬度，給萌發(fā)時(shí)突破種皮造成障礙，并且阻礙水分進(jìn)入；第三，胚乳內(nèi)脂類物質(zhì)積聚，代謝活動(dòng)降低，這些因素都推動(dòng)了種子休眠的形成。種子休眠是個(gè)十分復(fù)雜的生理過程，外部環(huán)境及種子內(nèi)部水分、酶活性、生長激素、內(nèi)源抑制物等各方面因素都會(huì)對(duì)種子休眠造成或直接或間接的影響[25-26]。因此，要充分了解短絲木犀種子休眠產(chǎn)生的原因，還需要更深入更精細(xì)的研究。