孫玉琴，楊 莉，陳中堅(jiān)，王朝梁，韋美麗，黃天衛(wèi)，施莉屏

(文山學(xué)院文山三七研究院，云南 文山 663000)

【研究意義】屏邊三七(PanaxstipuleanatusH.T.Tsai et K.M.Feng)是五加科人參屬植物，又名野三七、竹節(jié)七等，其根具有散瘀定通、療傷止血、滋補(bǔ)等功效，僅分布于云南東南部(屏邊、馬關(guān)、麻栗坡)及越南北方(老街)的低海拔(1100～1700 m)山谷潮濕林內(nèi)[1]，貴州水城也有分布，目前屏邊三七在野外采集已經(jīng)比較困難，資源處于嚴(yán)重缺乏的處境，因此被國(guó)家列為二級(jí)保護(hù)植物[2]。通過(guò)長(zhǎng)期對(duì)屏邊三七的人工栽培中觀察到，它的栽培環(huán)境與五加科人參屬植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen]類似，并且，作為三七的近緣物種屏邊三七在其相同的生長(zhǎng)環(huán)境下抗病性狀表現(xiàn)優(yōu)異，與三七在同一蔭棚內(nèi)種植的屏邊三七極少感病，對(duì)三七的地上部分病害表現(xiàn)免疫[3]。在人參屬的所有物種中，由于三七沒(méi)有姊妹種，屏邊三七和三七具有次最近的共同祖先，是三七的一種重要近緣種[4]，目前對(duì)三七的抗病品種選育起了不可替代的作用，同時(shí)對(duì)西南地區(qū)人參屬植物種質(zhì)資源圃的建立有重要意義。【前人研究進(jìn)展】種子是種子植物特有的繁殖體，對(duì)于植物也是種質(zhì)資源保存的重要材料。和其他人參屬植物一樣，屏邊三七也具有種子后熟的特性。種子休眠，是植物體延遲萌發(fā)時(shí)間，以免外界不良環(huán)境對(duì)植物體造成危害，而慢慢形成的特性[5]，許多研究表明，植物種子中存在萌發(fā)抑制物質(zhì)是導(dǎo)致種子休眠的一個(gè)主要因素[6], 種子中的很大一部分發(fā)芽抑制物質(zhì)是一些簡(jiǎn)單的小分子有機(jī)物質(zhì)，其中有一部分是水溶性的[7]。能從果皮、種皮、種胚中提取出萌發(fā)抑制物，是酸性或中性等物質(zhì)[8]。在種子休眠的過(guò)程中，內(nèi)源抑制物的種類是在不斷變化的[9]。至今對(duì)屏邊三七的研究主要針對(duì)化學(xué)成分[10]、分類[11]、地理分布[12-13]、生物學(xué)特性[14-15]、光和日變化[16]，分子生物學(xué)[17-20]、葉型[21]等方面?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】針對(duì)屏邊三七種子發(fā)芽抑制物的研究，前期做了鮮種內(nèi)源抑制物質(zhì)的粗提取及生物活性測(cè)定[22]，發(fā)現(xiàn)屏邊三七種子中確有發(fā)芽抑制物質(zhì)存在，種子中各部位的抑制物活性依次為果肉>胚乳>種皮。但屏邊三七種子層積后，內(nèi)源抑制物變化情況未見(jiàn)報(bào)道，為此對(duì)層積不同天數(shù)的屏邊三七種子進(jìn)行內(nèi)源抑制物的粗提取及生物活性測(cè)定，旨在為屏邊三七種子休眠機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，也是三七與屏邊三七的雜交育種的重要前期工作?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)層積不同天數(shù)的屏邊三七種子的內(nèi)源抑制物粗提取及生物活性測(cè)定，了解內(nèi)源抑制物質(zhì)在屏邊三七種子后熟期間的變化趨勢(shì)，以及對(duì)種子休眠的影響程度，為今后打破屏邊三七種子休眠特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)源于文山三七研究院硯山試驗(yàn)場(chǎng)種質(zhì)資源圃中的多年生屏邊三七種子，于2015年7月采集，采集后用濕沙層積備用。

1.2 內(nèi)源抑制物的粗提取方法

層積后每35 d，采集含100粒種子，分離種皮、胚乳(含胚)，分別稱重、磨碎后，裝入3個(gè)50 mL三角瓶中，加入50 mL甲醇，室溫下浸提72 h。用濾紙分離濾液和殘?jiān)?殘?jiān)糜? ℃冰箱保存)，濾液用60 ℃水浴揮干甲醇，所得濃縮液加入25 mL石油醚萃取后，分離水相和石油醚相。所得水相加入乙醚萃取，分離水相及乙醚相。所得水相繼續(xù)用乙酸乙酯萃取，分離水相及乙酸乙酯相。水相利用60 ℃水浴蒸干，除去水，所得干物質(zhì)加入25 mL甲醇后，用濾紙分離殘?jiān)凹状枷唷堅(jiān)屑尤胨?，得水相?/p>

1.3 抑制物的生物活性測(cè)定

(1)受體材料：選取白菜種子作為受體材料。為云南省昆明市春農(nóng)種業(yè)商貿(mào)有限公司的日本金黃58品種。

(2)各取3 mL內(nèi)源抑制物5種相(石油醚相，乙醚相，乙酸乙酯相，甲醇相及水相)，揮干有機(jī)溶劑后加入蒸餾水3 mL，水相直接取3 mL進(jìn)行抑制活性測(cè)定，重復(fù)3次，以蒸餾水為對(duì)照。

(3)將從上述各處理中獲得的組份，放入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，皿中放一直徑7 cm的濾紙，揮干有機(jī)溶劑后加入蒸餾水3 mL (水相則直接量取3 mL，不必再加蒸餾水)，每皿放白菜30粒，重復(fù)3次，培養(yǎng)皿應(yīng)傾斜放置，利用地心引力使胚根平直生長(zhǎng)，易于測(cè)量。在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h觀察發(fā)芽率，48 h測(cè)量胚根長(zhǎng)度。

1.4 供試有機(jī)溶劑的抑制作用檢測(cè)

取石油醚、乙醚、乙酸乙酯和甲醇各3 mL，放入培養(yǎng)皿內(nèi)揮干后加3 mL 蒸餾水進(jìn)行白菜發(fā)芽試驗(yàn)以確定其抑制活性。重復(fù)3次，以這4種有機(jī)溶劑作為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水做為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 屏邊三七種子層積處理不同天數(shù)對(duì)白菜種子發(fā)芽的影響

屏邊三七種子采收后常規(guī)處理要用濕沙儲(chǔ)藏，以完成種子后熟。一般儲(chǔ)藏時(shí)間為5～6 個(gè)月，因此，設(shè)置屏邊三七層積處理的時(shí)間為175 d，每35 d取出100粒種子用系統(tǒng)溶劑提取法，分別提取分離的種皮和種胚，用提取液對(duì)白菜種子做生物活性測(cè)定，白菜種子發(fā)芽率結(jié)果見(jiàn)表1，陽(yáng)性對(duì)照石油醚組白菜種子發(fā)芽率為70.44 %，乙醚組白菜種子發(fā)芽率為83.18 %，乙酸乙酯組白菜種子發(fā)芽率為75.61 %，甲醇組白菜種子發(fā)芽率為72.44 %，陰性對(duì)照蒸餾水組白菜種子發(fā)芽率為86.67 %。

白菜種子發(fā)芽率試驗(yàn)結(jié)果表明，屏邊三七種子層積35 d后，種皮、種胚提取相對(duì)白菜種子發(fā)芽抑制強(qiáng)度最大，發(fā)芽率最低，隨著種子層積時(shí)間的增加，發(fā)芽率逐漸升高，層積175 d后種子發(fā)芽率最高，層積后種皮、種胚各提取相的白菜種子發(fā)芽率依次為層積175 d>層積140 d>層積105 d>層積70 d>層積35 d。

隨著層積時(shí)間的增加，白菜種子的發(fā)芽率逐漸增高，說(shuō)明各提取液對(duì)白菜種子的發(fā)芽抑制作用隨層積時(shí)間的增加，抑制作用逐步減弱。種子各部位生物活性測(cè)定結(jié)果顯示，各提取相對(duì)白菜種子發(fā)芽抑制作用種胚的要大于種皮的，說(shuō)明發(fā)芽抑制物質(zhì)主要存在于種胚中。屏邊三七種子在層積105 d后，種皮、種胚提取相的發(fā)芽抑制物質(zhì)對(duì)白菜種子發(fā)芽的影響逐漸減弱，發(fā)芽率與陽(yáng)性對(duì)照組差別不明顯；種子層積到175 d時(shí)，發(fā)芽抑制作用基本解除，發(fā)芽率與陰性對(duì)照差別不明顯。

2.2 屏邊三七種子層積處理不同天數(shù)對(duì)白菜種子生長(zhǎng)的影響

2.2.1 層積試驗(yàn)中白菜種子生物活性測(cè)定結(jié)果屏邊三七種子層積不同天數(shù)生物活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，所用不同溶劑及蒸餾水對(duì)白菜種子生長(zhǎng)影響的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 層積不同天數(shù)的屏邊三七種子的內(nèi)源抑制物提取液對(duì)白菜種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effect of extract of PSS with different stratification duration on the rate of cabbage seed germination (n=90粒)

2.2.2 層積不同天數(shù)后，屏邊三七種子各部位不同提取相對(duì)白菜胚根、胚芽生長(zhǎng)比較 屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種皮中內(nèi)源抑制物，測(cè)定白菜胚根生長(zhǎng)情況，由表4可見(jiàn)，隨著屏邊三七種子層積時(shí)間的增加，白菜胚根長(zhǎng)度逐漸增加。SPSS軟件分析顯示，層積140和175 d的胚根長(zhǎng)度與層積35、70、105 d的胚根長(zhǎng)度之間達(dá)顯著性差異；層積140和175 d 兩者及層積35、70和105 d三者之間的差異均不大。同一種有機(jī)溶劑提取液提取層積不同天數(shù)處理的屏邊三七種皮，對(duì)白菜種子胚根生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

表2 屏邊三七種子層積不同天數(shù)對(duì)白菜胚根、胚芽生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of extract of PSS with different stratification duration on development of radicle and germ of cabbage seed

表3 不同溶劑對(duì)白菜胚根、胚芽生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of extracts with different solvents on development of cabbage seed

表4 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種皮不同提取相對(duì)白菜胚根生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of P. stipulenatus seed coat extract with different stratification duration on radicle development of cabbage seed

注：采用LSD法進(jìn)行顯著性分析，同一行不同小寫(xiě)字母為5 %差異顯著，下同。
Notes：LSD methods was used to analyze the significance, the different letters in the same line meant 5 % significant difference, the same as below.

表5 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種胚不同提取相對(duì)白菜胚根生長(zhǎng)的影響Table 5 Effect of PSS embryo extract with different stratification duration on radicle development of cabbage seed

屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種胚中內(nèi)源抑制物，測(cè)定白菜胚根生長(zhǎng)情況，由表5可見(jiàn)，隨著屏邊種子層積時(shí)間的增加，白菜胚根長(zhǎng)度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。SPSS軟件分析顯示，除乙醚提取相外，層積140 d的胚根長(zhǎng)度與層積175 d 的胚根長(zhǎng)度達(dá)顯著性差異；層積140和175 d的胚根長(zhǎng)度與層積35、70、105 d的胚根長(zhǎng)度之間達(dá)顯著差異；同一種有機(jī)溶劑提取液提取屏邊三七種胚，除140和175 d乙醚提取相外，層積不同天數(shù)的處理間都表現(xiàn)出顯著性差異。層積不同天數(shù)的屏邊三七種胚，使用同一種有機(jī)溶劑提取液提取的發(fā)芽抑制物對(duì)白菜種子胚根生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種皮中內(nèi)源抑制物，測(cè)定白菜胚芽生長(zhǎng)情況，由表6可見(jiàn)，隨著屏邊三七種子層積時(shí)間的增加，白菜胚芽長(zhǎng)度逐漸增加，SPSS軟件分析結(jié)果表明，層積140和175 d的胚根長(zhǎng)度與層積35 d的胚根長(zhǎng)度之間達(dá)顯著性差異；種皮水相對(duì)白菜胚芽生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果顯示，層積不同天數(shù)的處理間都表現(xiàn)出顯著性差異，其它4種有機(jī)溶劑提取相對(duì)白菜胚芽生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果顯示，層積不同天數(shù)的處理間不完全表現(xiàn)出顯著性差異。層積不同天數(shù)的屏邊三七種皮，使用同一種有機(jī)溶劑提取液提取的發(fā)芽抑制物對(duì)白菜種子胚芽生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

表6 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種皮不同提取相對(duì)白菜胚芽生長(zhǎng)的影響Table 6 Effect of PSS coat extract with different stratification duration on germ development of cabbage seed

表7 屏邊三七種子層積不同天數(shù)種胚不同提取相對(duì)白菜胚芽生長(zhǎng)的影響Table 7 Effect of PSS embryo extract with different stratification duration on germ development of cabbage seed

屏邊三七種子層積35、70、105、140、175 d后，分別用系統(tǒng)提取法提取種胚中內(nèi)源抑制物，測(cè)定白菜胚芽生長(zhǎng)情況，由表7可見(jiàn)，隨著屏邊三七種子層積時(shí)間的增加，白菜胚芽長(zhǎng)度逐漸增加，SPSS軟件分析顯示，層積175 d的胚芽長(zhǎng)度與層積35、70、105 d的胚芽長(zhǎng)度之間以及層積140 d的胚芽長(zhǎng)度與層積35 d的胚芽長(zhǎng)度之間均達(dá)顯著差異；測(cè)定種胚乙醚相和種胚水相對(duì)白菜胚芽生長(zhǎng)，層積不同天數(shù)的處理間都表現(xiàn)出顯著性差異，其它3種有機(jī)溶劑提取相對(duì)白菜胚芽生長(zhǎng)，層積不同天數(shù)的處理間不完全表現(xiàn)出顯著性差異。層積不同天數(shù)的屏邊三七種胚，使用同一種有機(jī)溶劑提取液提取的發(fā)芽抑制物對(duì)白菜種子胚芽生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)度依次為層積175 d<層積140 d<層積105 d<層積70 d<層積35 d。

3 討 論

(1)屏邊三七種子層積175 d后，發(fā)芽抑制作用基本解除，這與陳中堅(jiān)對(duì)于屏邊三七種子休眠研究中——屏邊三七種子的休眠期長(zhǎng)達(dá)165～180 d，在種子離開(kāi)母體后，種胚還在不斷生長(zhǎng)，直至成熟[2]的結(jié)論一致。層積后屏邊三七種子內(nèi)源抑制物質(zhì)不斷減弱，層積不同天數(shù)后屏邊三七種子中內(nèi)源抑制物對(duì)白菜種子發(fā)芽及生長(zhǎng)的抑制作用逐漸下降，與此同時(shí)，屏邊三七種子的胚芽也在生長(zhǎng)過(guò)程中，抑制物質(zhì)主要集中在種胚中，可以提示屏邊三七種子形態(tài)后熟的原因與內(nèi)源抑制物相關(guān)，內(nèi)源抑制物種類隨著層積時(shí)間是否會(huì)發(fā)生變化，有待進(jìn)一步研究。

(2)對(duì)新鮮屏邊三七種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的粗提取及生物活性測(cè)定結(jié)果表明，屏邊三七種子中所含的內(nèi)源抑制物主要集中在果肉及胚乳中(另文報(bào)道)，種子經(jīng)過(guò)層積后，果肉已經(jīng)不存在，種胚(含胚乳)內(nèi)源抑制物質(zhì)活性要明顯高于種皮，說(shuō)明胚乳中抑制物質(zhì)的存在，可能是胚形態(tài)較小、胚率值極小、種子休眠的主要原因。關(guān)于種子不同部位所含抑制物質(zhì)在活性上的差異，是因?yàn)樗种莆镔|(zhì)多少不同，還是因?yàn)樗种莆镔|(zhì)種類或性質(zhì)不同，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

層積試驗(yàn)對(duì)白菜種子的生物活性測(cè)定結(jié)果表明，隨著種子層積時(shí)間的增加，白菜種子的發(fā)芽率逐漸增高，且胚根、胚芽的長(zhǎng)度均有所增長(zhǎng)，說(shuō)明屏邊三七種子隨著層積時(shí)間的增加，種子中的內(nèi)源抑制物質(zhì)在減少，抑制白菜種子發(fā)芽的作用減弱；屏邊三七種子各提取相對(duì)白菜種子萌發(fā)的生物活性測(cè)定中，種皮各提取相測(cè)定白菜種子胚根、胚芽的長(zhǎng)度均大于種胚各提取相測(cè)定的白菜種子胚根、胚芽的長(zhǎng)度，說(shuō)明種胚各提取相對(duì)白菜種子生長(zhǎng)的抑制作用大于種皮各提取相，這也表明層積過(guò)程中屏邊三七種子的發(fā)芽抑制物主要集中在種胚中；屏邊三七種子層積到175 d時(shí)，發(fā)芽抑制作用基本解除，此時(shí)屏邊三七種子后熟過(guò)程已經(jīng)完成，休眠已經(jīng)完全被打破。