★ 魏飛亭　董嘉皓　唐怡　李斐　陳洋　陳海芳　楊武亮　袁金斌*（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

阿爾茨海默病，又稱老年癡呆，是一種神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為記憶功能下降，日常生活自理能力減退，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。目前此疾病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但是過度的氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是其重要的原因之一［1］。H2O2是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物，極易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生高活性的自由基，進(jìn)而損傷細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，而神經(jīng)細(xì)胞的過氧化氫酶活性低，使其比其他類細(xì)胞更容易受到氧化損傷［2］。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞，來源于1970年建立的SH-N-SH細(xì)胞系經(jīng)三次克隆后的亞系。其形態(tài)、生理及生化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，作為擬神經(jīng)細(xì)胞模型，被廣泛用于神經(jīng)退行性疾病的研究中［3］。

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根莖［4］，具有鎮(zhèn)靜、抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)等作用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥理活性［5］，其在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的防治中具有廣泛的應(yīng)用前景?，F(xiàn)階段對(duì)石菖蒲的神經(jīng)系統(tǒng)藥理作用的研究中，大多以揮發(fā)油和水提物為研究對(duì)象［6-8］，而對(duì)醇提物鮮有提及。本文以石菖蒲醇提物為研究對(duì)象，用H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型，探討石菖蒲醇提物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響和對(duì)H2O2引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為石菖蒲用于氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的治療及研究提供理論依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材與試劑 石菖蒲藥材采自于江西南昌，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)舒積成副教授鑒定為天南星科植物石菖蒲Acori tatarinowii Schott的干燥根莖。DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基、牛胎血清、青霉素-鏈霉素（美國(guó)GIBCO公司）；0.25%胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司）；30 %過氧化氫（西隴化工股份有限公司）；0.22μm微孔濾膜（廣州潔特生物過濾股份有限公司）。

1.2儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）；SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；XDS-1B倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；ELx800紫外可見光酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；96孔板（美國(guó)Corning公司）。

1.3細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %滅活胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)液中。于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)基底部70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2　方法

2.1藥液的配置 石菖蒲藥材凈制，放入60℃烘箱，烘2h，粉碎，稱取約50g（過二號(hào)篩），置于1000mL圓底燒瓶中加入500mL 70%乙醇，回流2h，趁熱抽濾，藥渣再重復(fù)提取2次，合并濾液，濃縮，將濃縮液置于-80℃中冷凍12h，制成凍干粉，再精密稱取石菖蒲凍干粉適量，用培養(yǎng)基配制成含藥培養(yǎng)基，過0.22μm濾膜，于4℃避光保存，備用。

2.2不同濃度石菖蒲培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，制成濃度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞液，接種至96孔板，每孔200μL，培養(yǎng)24h后，小心吸棄培養(yǎng)液。設(shè)置石菖蒲組、對(duì)照組和調(diào)零組。石菖蒲組加入200μL不同濃度的含藥培養(yǎng)基（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00g/L，同一濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔）；對(duì)照組常規(guī)加入等量培養(yǎng)基，不含石菖蒲醇提物；調(diào)零組加入終體積的培養(yǎng)基，不含細(xì)胞和石菖蒲醇提物。培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL的MTT，37℃避光孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)液，加入100μL DMSO，震蕩，用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，制成濃度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞液，接種至96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24h后，小心吸棄培養(yǎng)液。設(shè)置模型組、對(duì)照組和調(diào)零組。模型組［9］加入H2O2致終濃度為200μmol/L；對(duì)照組用等量的空白培養(yǎng)基代替H2O2溶液；調(diào)零組加入終體積的培養(yǎng)基，不含細(xì)胞和H2O2。培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL的MTT，37℃避光孵育4h，小心吸棄培養(yǎng)液，加入100μL DMSO，震蕩，用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4石菖蒲培養(yǎng)基對(duì)H2O2引起的SH-SY5Y損傷的保護(hù)作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，制成濃度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞液，接種至96孔板，每孔200μL，培養(yǎng)24h后，小心吸棄培養(yǎng)液，并設(shè)置保護(hù)組、對(duì)照組、模型組和調(diào)零組。保護(hù)組加入200μL不同濃度的石菖蒲醇提物（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00g/L，同一濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔）；對(duì)照組和模型組用等量的空白培養(yǎng)基代替含藥培養(yǎng)基溶液；調(diào)零組加入終體積的培養(yǎng)基，不含細(xì)胞和石菖蒲醇提物。培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組和模型組加入H2O2致終濃度為200μmol/L，對(duì)照組和調(diào)零組加入等體積的空白培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL MTT，37℃避光孵育4h，小心吸棄培養(yǎng)液，加入100μL DMSO，震蕩，用酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)定吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法 細(xì)胞存活率計(jì)算方法如下（A實(shí)驗(yàn)為石菖蒲組、模型組或保護(hù)組的吸光度）。使用分析軟件（Graphpad Prism 5.0）對(duì)各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

細(xì)胞存活率=（A實(shí)驗(yàn)-A調(diào)零）/（A對(duì)照-A調(diào)零）×100%

3　結(jié)果

3.1不同濃度的石菖蒲醇提物作用于SH-SY5Y細(xì)胞后的細(xì)胞存活率 與對(duì)照組相比較，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同濃度石菖蒲醇提物作用24h后，0.25g/L和0.50g/L組細(xì)胞數(shù)目增多，突觸增加，貼壁功能和折光性上升，其余組分細(xì)胞形態(tài)未有明顯改變。見圖1。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞存活率，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析測(cè)算發(fā)現(xiàn)，藥物的各個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響不同，見圖2。當(dāng)石菖蒲醇提物濃度為0.25g/L和0.50g/L時(shí)，其對(duì)細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01），而其他濃度下的藥物均無(wú)顯著促進(jìn)作用或抑制作用（P＞0.05）。

圖1　不同濃度石菖蒲醇提物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2　不同濃度石菖蒲醇提物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

3.2石菖蒲培養(yǎng)基對(duì)H2O2引起的SH-SY5Y損傷的保護(hù)作用 與對(duì)照組相比，H2O2模型組細(xì)胞密度降低，突觸消失，胞膜破裂，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間隙增大。而預(yù)先加入不同濃度石菖蒲醇提物培育24h后再加H2O2的組分，其細(xì)胞形態(tài)與模型組相比較，損傷程度較輕微，細(xì)胞密度也較大，見圖3。

圖3　不同濃度石菖蒲醇提物對(duì)H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

各組分用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析測(cè)算，結(jié)果見圖4，由圖可知，與對(duì)照組相比，H2O2模型組SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01），表明成功構(gòu)建細(xì)胞損傷模型；與模型組相比，0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲培養(yǎng)基組細(xì)胞存活率顯著提高（P＜0.01），表明0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲培養(yǎng)基可對(duì)H2O2引起的細(xì)胞損傷起保護(hù)作用，且0.25g/L濃度下抗損傷效果最強(qiáng)。

圖4　不同濃度石菖蒲醇提物對(duì)H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

4　討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在受到有害刺激的情況下，產(chǎn)生過多的活性氧自由基和活性氮自由基，使體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織受損［1］。而H2O2是人體內(nèi)重要的活性氧自由基之一，能夠與多種生物靶標(biāo)分子反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷［2］。本實(shí)驗(yàn)以H2O2體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，建立氧化損傷模型。用MTT法和倒置相差顯微鏡評(píng)價(jià)細(xì)胞的存活和繁殖情況，同時(shí)考察了不同濃度石菖蒲醇提物對(duì)正常SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響和對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入200μL濃度分別為0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲醇提物培養(yǎng)基時(shí)，與對(duì)照組和模型組相比細(xì)胞的存活率均顯著升高（P＜0.01），而其他濃度的石菖蒲醇提物組并無(wú)顯著性促進(jìn)、抑制或抗氧化損傷作用。表明石菖蒲醇提物在一定濃度下對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用，即石菖蒲醇提物對(duì)于氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病可能具有治療作用。