應(yīng) 曉， 王育瑛， 王再紅， 王振華

（1.衢州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 衢州 324002；2.杭州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310007）

在各類癌癥中，前列腺癌是男性群體中發(fā)病率和死亡率都很高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅男性健康[1]。對于早期的前列腺癌患者而言，手術(shù)和放療是目前最有效的治療方法，然而對于中晚期前列腺癌患者而言，化療是必不可少的治療手段[2]。多西他賽是用于前列腺癌治療的一線化療藥物[3]。然而，由于腫瘤細(xì)胞的耐藥性，有相當(dāng)比例的前列腺癌患者對多西他賽治療不敏感[4-5]，因此尋找輔助治療藥物以降低前列腺癌細(xì)胞對多西他賽的抵抗性，提高其治療效果，具有十分重要的意義。黃芩素是從天然藥物黃芩根部提取的主要活性成分，具有抗過敏、抗菌、抗病毒的功效。近期有研究結(jié)果顯示黃芩素有一定的腫瘤抑制作用，如黃芩素能通過抑制蛋白38（protein 38，p38）信號通路的活化抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，能靶向于前列腺癌細(xì)胞中的小窩蛋白-1/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路，抑制其生長和轉(zhuǎn)移[6-7]。但黃芩素是否對前列腺癌的化療有輔助治療作用仍不清楚。有研究結(jié)果顯示，將化療藥物與一些天然藥物活性成分進(jìn)行聯(lián)合治療能降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抵抗性，有效提高化療藥物的療效[8-9]。因此，本研究探討了黃芩素對多西他賽體外抗前列腺癌活性的影響和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑來源

多西他賽、噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、黃芩素、二甲亞砜和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自德國Sigma-Aldrich公司。Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）購自美國Gibco公司。細(xì)胞蛋白提取液、JC-1線粒體膜電位染料和線粒體分離試劑盒購自江蘇碧云天生物科技有限公司。TRIzol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。鼠雙微體2 （murine double minute 2，MDM2）、蛋白53（protein 53，p53）、受p53基因上調(diào)表達(dá)的凋亡調(diào)控基因（p53 upregulated modulator of apoptosis，Puma）、佛波醇-12-肉豆酸酯-13-乙酰基誘導(dǎo)蛋白1（phorbol-12-myriistate-13-acetate-induced protein 1，PMAIP1，又稱Noxa）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteine-containing aspartatespecific protease，Caspase）-9、Caspase-3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自美國Cell Signaling公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購自美國Pierce公司。SYBR Green試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。LNCaP細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM在37 °C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MDM2過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

人MDM2基因的開放閱讀框架全長序列經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接，構(gòu)建成MDM2重組過表達(dá)質(zhì)粒。MDM2過表達(dá)質(zhì)粒采用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，簡要步驟如下：將2 μg/mL質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000包裹后加入到無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行混合，將貼壁生長的LNCaP細(xì)胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6 h，棄去無血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24 h。嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行操作。

1.4 方法

1.4.1 分組 將LNCaP細(xì)胞接種在96孔板（5×103/孔）上，按不同處理方式分為對照組、黃芩素組、多西他賽組、多西他賽+黃芩素組和多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組。（1）對照組：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48 h；（2）多西他賽組：在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞中加入1 nmol/L多西他賽培養(yǎng)48 h；（3）黃芩素組：在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞中加入10 μmol/L黃芩素培養(yǎng)48 h；（4）多西他賽+黃芩素組：在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞中加入1 nmol/L多西他賽和10 μmol/L黃芩素培養(yǎng)48 h；（5）多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組：在MDM2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞中加入1 nmol/L多西他賽和10 μmol/L黃芩素培養(yǎng)48 h。

1.4.2 細(xì)胞活力檢測 各組處理完畢后在各培養(yǎng)孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT再培養(yǎng)4 h，小心吸去上清液，往培養(yǎng)孔中加入150 μL 二甲亞砜，充分震蕩后在570 nm波長下用Sunrise Microplate Reader酶標(biāo)儀 （瑞士TECAN公司）檢測吸光度（A）值。LNCaP細(xì)胞活力抑制率計算公式：抑制率=（A值對照組-A值藥物處理組）/A值對照組×100%。

1.4.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將LNCaP細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后將細(xì)胞用Annexin V染色孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測LNCaP細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin V陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.4 線粒體膜電位測定 將LNCaP細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后將細(xì)胞用JC-1染料孵育20 min，孵育完畢后用流式細(xì)胞儀檢測紅色熒光，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，線粒體膜電位越高[10]。各處理組的相對線粒體膜電位由各處理組與對照組的紅色熒光強(qiáng)度比值表示。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.5 熒光定量PCR 將LNCaP細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組進(jìn)行處理。LNCaP細(xì)胞總RNA用Trizol試劑提取。cDNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由總RNA合成。MDM2基因采用SYBR Green試劑盒進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，MDM2基因的相對表達(dá)量用2-△△CT法計算。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.6 免疫印跡法 將LNCaP細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后用蛋白提取液提取細(xì)胞總蛋白并用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)由分離膠轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，用MDM2、p53、Puma、Noxa、Caspase-9、Caspase-3、細(xì)胞色素c和GAPDH抗體孵育過夜，再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.7 線粒體分離 為了檢測細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)中的水平，需除去LNCaP細(xì)胞的線粒體。將LNCaP細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后用線粒體分離試劑盒將細(xì)胞的線粒體從胞質(zhì)中分離。檢測胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c蛋白水平，無線粒體的胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c蛋白水平越高，說明線粒體的細(xì)胞色素c的釋放水平越高。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對多西他賽抗LNCaP細(xì)胞活性的影響

多西他賽+黃芩素組對LNCaP細(xì)胞活力的抑制率和LNCaP細(xì)胞凋亡率明顯高于多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組、多西他賽組、黃芩素組及對照組（P＜0.05），多西他賽組、多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組明顯高于黃芩素組及對照組（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組LNCaP細(xì)胞的活力抑制率和凋亡率比較（%，±s ）

表1 各組LNCaP細(xì)胞的活力抑制率和凋亡率比較（%，±s ）

注： 與對照組比較，*P＜0.05；與黃芩素組比較，#P＜0.05；與多西他賽+黃芩素組比較，△P＜0.05

組別 細(xì)胞活力抑制率 凋亡率對照組 0 1.5±0.2黃芩素組 8.8±0.7 4.5±0.5多西他賽組 19.8±1.6*#△ 10.6±0.8*#△多西他賽+黃芩素組 68.6±6.3*# 38.1±3.3*#多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組27.9±2.4*#△ 14.6±1.3*#△

2.2 黃芩素對LNCaP細(xì)胞表達(dá)MDM2的影響

黃芩素組和多西他賽+黃芩素組LNCaP細(xì)胞MDM2 mRNA和MDM2蛋白水平均低于多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組、多西他賽組和對照組（P＜0.05），而黃芩素組與多西他賽+黃芩素組之間、多西他賽組與對照組之間MDM2 mRNA和MDM2蛋白水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、圖3。

圖1 各組LNCaP細(xì)胞的凋亡率比較

2.3 黃芩素對多西他賽誘導(dǎo)的凋亡信號的影響

圖2 黃芩素和多西他賽對LNCaP細(xì)胞MDM2 mRNA表達(dá)的影響

圖3 黃芩素和多西他賽對LNCaP細(xì)胞MDM2蛋白表達(dá)的影響

多西他賽+黃芩素組p53蛋白水平、Puma蛋白水平、Noxa蛋白水平、細(xì)胞色素c釋放水平及Caspase-9、Caspase-3活化水平均高于多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組、多西他賽組、黃芩素組和對照組（P＜0.05），而相對粒體膜電位則低于其他各組（P＜0.05）；多西他賽+黃芩素+MDM2質(zhì)粒組、多西他賽組、黃芩素組和對照組之間各項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4～圖6。

圖4 黃芩素和多西他賽對p53依賴的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 多西他賽和黃芩素對LNCaP細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖6 黃芩素和多西他賽對LNCaP細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3活化及細(xì)胞色素c釋放的影響

3 討論

多西他賽屬于紫杉烷類化療藥物，能誘導(dǎo)前列腺癌、肺癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。在前列腺癌的治療中，以多西他賽為代表的紫杉烷類化療藥物是目前治療前列腺癌的一線治療藥物。這些藥物能抑制腫瘤細(xì)胞骨架的合成，從而阻止其發(fā)生細(xì)胞分裂和增殖[11-13]。然而，在化療過程中，常常會出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對多西他賽耐藥。天然藥物活性成分黃芩素具有一定的抗腫瘤活性，并且毒性較低，但黃芩素是否能提高前列腺癌細(xì)胞對多西他賽治療的敏感性至今還不清楚。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩素單獨(dú)治療對LNCaP細(xì)胞的殺傷活性較弱，其半抑制濃度達(dá)到265 μmol/L，因此本研究嘗試探討低濃度黃芩素（10 μmol/L）對多西他賽化療是否有協(xié)同效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示黃芩素聯(lián)合多西他賽處理能顯著提高LNCaP細(xì)胞的活力抑制率和凋亡率，表明黃芩素是一種良好的化療輔助治療藥物，能顯著提高LNCaP細(xì)胞對多西他賽誘導(dǎo)的凋亡作用的敏感性。

野生型p53是一種重要的腫瘤抑制分子，能通過促進(jìn)下游靶基因，如Puma和Noxa[14]的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，在多種腫瘤細(xì)胞中，p53基因會發(fā)生表達(dá)缺失或發(fā)生突變，使p53蛋白喪失對腫瘤的抑制作用。盡管如此，在多數(shù)前列腺癌細(xì)胞中，p53仍以野生型的形式存在并發(fā)揮抗腫瘤活性[15]。因此，在前列腺癌的治療中，p53是一個潛在的重要靶點(diǎn)。在一般情況下，p53蛋白的穩(wěn)定性和活性受MDM2蛋白的調(diào)控，細(xì)胞中的MDM2蛋白能與p53結(jié)合，從而抑制p53的生物活性并誘導(dǎo)其發(fā)生降解。因此，前列腺癌細(xì)胞中的p53蛋白水平會維持在一個較低水平。當(dāng)前列腺癌細(xì)胞處于化療藥物作用下時，p53蛋白能從MDM2-p53復(fù)合物中游離出來，從而增加其穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)的水平[16-17]。由此可見，前列腺癌細(xì)胞中的p53蛋白水平受細(xì)胞中MDM2蛋白和化療藥物的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)LNCaP細(xì)胞單獨(dú)用多西他賽處理時，細(xì)胞中的p53蛋白水平稍有升高；當(dāng)用黃芩素和多西他賽聯(lián)合處理時，LNCaP細(xì)胞中的p53蛋白水平明顯升高。當(dāng)LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染MDM2質(zhì)粒，使MDM2在LNCaP細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)后，細(xì)胞中的p53蛋白水平明顯下降，對LNCaP細(xì)胞活力的抑制率和LNCaP細(xì)胞凋亡率明顯降低，表明黃芩素和多西他賽的協(xié)同抗前列腺癌活性受到了明顯抑制。由此可見，黃芩素是通過抑制LNCaP細(xì)胞中MDM2的表達(dá)，間接增強(qiáng)了多西他賽對p53蛋白的活化，由此促進(jìn)了多西他賽的抗前列腺癌活性。

Puma和Noxa是MDM2/p53信號通路的下游蛋白。本研究結(jié)果顯示黃芩素與多西他賽聯(lián)合處理能明顯上調(diào)LNCaP細(xì)胞中Puma和Noxa蛋白的表達(dá)。同時，還發(fā)現(xiàn)黃芩素能明顯促進(jìn)多西他賽對LNCaP細(xì)胞線粒體途徑凋亡的誘導(dǎo)，使細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生改變，促使線粒體發(fā)生腫脹，釋放其中的凋亡活性物質(zhì)細(xì)胞色素c，從而使凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-9和Caspase-3發(fā)生活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，黃芩素能通過MDM2/p53途徑提高多西他賽的體外抗前列腺癌活性，為增強(qiáng)多西他賽的化療療效提供了新的思路和理論依據(jù)。

[1] SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A. Cancer statistics，2015[J]. CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

[2] KUMAR S S，PACEY S. The role of chemotherapy and new targeted agents in the management of primary prostate cancer[J]. J Clin Urol，2016，9（2 Suppl）：30-37.

[3] GRAFF J N，BEER T M. Should docetaxel be administered earlier in prostate cancer therapy?[J].Expert Rev Anticancer Ther，2015，15（9）：977-979.

[4] WANG Y，LIEBERMAN R，PAN J. miR-375 induces docetaxel resistance in prostate cancer by targeting SEC23A and YAP1[J]. Mol Cancer，2016，15（1）：70.

[5] GANJU A，YALLAPU M M，JAGGI M，et al.Nanoways to overcome docetaxel resistance in prostate cancer[J]. Drug Resist Updat，2014，17（1-2）：13-23.

[6] YAN X，RUI X，ZHANG K. Baicalein inhibits the invasion of gastric cancer cells by suppressing the activity of the p38 signaling pathway[J]. Oncol Rep，2015，33（2）：737-743.

[7] GUO Z，HU X，XING Z，et al. Baicalein inhibits prostate cancer cell growth and metastasis via the caveolin-1/AKT/mTOR pathway[J]. Mol Cell Biochem，2015，406（1-2）：111-119.

[8] 黃曄，廖陽，沈楊炳，等. 槲皮素通過抑制c-Jun的表達(dá)水平增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)活性[J]. 中國病理生理雜志，2018，34（2）：206-211.

[9] 黃志平，邵立龍，阮陽平，等. 雷公藤紅素通過ROS/JNK途徑誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞發(fā)生caspase依賴的凋亡[J]. 中國病理生理雜志，2015，31（8）：1457-1461.

[10] PRATHAPAN A，VINEETHA V P，RAGHU K G. Protective effect of Boerhaavia diffusa L. against mitochondrial dysfunction in angiotensin Ⅱ induced hypertrophy in H9c2 cardiomyoblast cells[J]. PLoS One，2014，9（4）：e96220.

[11] ALSHAKER H，WANG Q，KAWANO Y，et al.Everolimus（RAD001） sensitizes prostate cancer cells to docetaxel by down-regulation of HIF-1α and sphingosine kinase 1[J]. Oncotarget，2016，7（49）：80943-80956.

[12] TAO L，HUANG G，CHEN Y，et al. DNA methylation of DKK3 modulates docetaxel chemoresistance in human nonsmall cell lung cancer cell[J]. Cancer Biother Radiopharm，2015，30（2）：100-106.

[13] ZHANG H D，SUN D W，MAO L，et al. MiR-139-5p inhibits the biological function of breast cancer cells by targeting Notch1 and mediates chemosensitivity to docetaxel[J]. Biochem Biophys Res Commun，2015，465（4）：702-713.

[14] PARK S Y，JEONG M S，JANG S B.In vitrobinding properties of tumor suppressor p53 with PUMA and NOXA[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，420（2）：350-356.

[15] FENG F Y，ZHANG Y，KOTHARI V，et al.MDM2 inhibition sensitizes prostate cancer cells to androgen ablation and radiotherapy in a p53-dependent manner[J]. Neoplasia，2016，18（4）：213-222.

[16] DUFFY M J，SYNNOTT N C，MCGOWAN P M，et al. p53 as a target for the treatment of cancer[J].Cancer Treat Rev，2014，40（10）：1153-1160.

[17] LIU C，ZHU Y，LOU W，et al. Functional p53 determines docetaxel sensitivity in prostate cancer cells[J]. Prostate，2013，73（4）：418-427.