閆佩毅， 袁 亞， 張 驥， 朱 琪， 鄒玉涵， 王高瑩， 金 姝

（1.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，上海 200060；2. 上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院病理科，上海 200060；3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院外科，上海 200060）

乳腺癌是一種性激素依賴性腫瘤，以往研究認為雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）是乳腺癌的獨立預(yù)后因子[1-2]。近年來有關(guān)雄激素、雄激素受體（androgen receptor，AR）與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系也越來越受關(guān)注[3]。HARDIN等[4]通過體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，ER陰性乳腺癌對雄激素刺激有應(yīng)答。SPEERS等[5]發(fā)現(xiàn)，在ER、PR和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor，HER-2/neu，又稱C-erbB-2）三陰性乳腺癌中，AR的富集表達在蛋白和RNA水平上有顯著的異質(zhì)性；所有乳腺癌亞型之間的AR RNA和蛋白表達存在很強的相關(guān)性（r=0.72，P＜0.01），提示AR可作為新的靶標用于指導(dǎo)臨床內(nèi)分泌治療，為ER陰性乳腺癌的激素療法提供一個新的思路。C-erbB-2基因的表達與乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后的判斷密切相關(guān)。TONG等[6]研究發(fā)現(xiàn)，C-erbB-2基因表達在乳腺癌組織中明顯上調(diào)，且其表達與ER、PR等相關(guān)。

激素受體的表達狀態(tài)與諸多基因的甲基化相關(guān)[7]，目前關(guān)于C-erbB-2基因甲基化狀態(tài)與AR表達的關(guān)系尚不明確。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上通過檢測乳腺癌組織、癌旁組織和乳腺良性腫瘤組織AR表達水平，分析其與對應(yīng)臨床病理資料的關(guān)系，以期為乳腺癌的激素治療及預(yù)后轉(zhuǎn)歸的預(yù)測提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2006年10月—2010年12月上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的乳腺癌患者76例，均為女性，年齡35～89歲，臨床資料完整。按照美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）乳腺癌TNM分期第6版（2003年）標準（當年術(shù)后病理診斷所依據(jù)的標準）分為0期29例、Ⅰ期36例、Ⅱ期3例、Ⅲ期8例。另外選取乳腺良性腫瘤患者55例，均為女性，年齡20～65歲。術(shù)后立即從腫瘤樣本中取癌組織和癌旁組織（距離腫瘤中心3 cm及以外處、外觀正常的組織，均避開壞死、炎癥部位，最終經(jīng)病理確認）及乳腺良性腫瘤組織，置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。供病理學(xué)分析的癌組織、癌旁組織及良性組織按常規(guī)用甲醛固定24 h，行石蠟包埋后備用。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 蛋白酶K（Calbiochem公司，德國），氯仿（上海大合化學(xué)品有限公司），苯酚（0.1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷飽和，pH值8.0），CpGenome DNA Modification Kit（Chemicon公司，美國），dNTP、Taq DNA Polymeraser、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，美國），瓊脂糖[生工生物工程（上海）有限公司]，SYBR Premix Ex Taq（寶生物工程有限公司），TRIzol Reagent（Invitrogen公司，美國）。EnVision Detection System、Peroxidase/DAB+（DAKO公司，丹麥），鼠抗人AR[基因科技（上海）有限公司]。

1.2.2 主要儀器 Universal 16R臺式冷凍離心機（Hettich公司，德國）；Tanon 1600R凝膠成像系統(tǒng)（上海天能儀器有限公司）； NanoDrop 2000c 紫外可見分光光度計（Thermo公司，美國）；PCR擴增儀（BIO-Rad公司，美國）；RM2235石蠟切片機、HI1210展片機、HI1210切片機（Leica公司，德國）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 每份樣本剪取0.3～0.5 cm2的組織塊，加500 μL TES緩沖液[10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-HCL，1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），0.1 mmol/L十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS]，組織勻漿后轉(zhuǎn)移到1.5 mL的無菌Eppendorf管中。加入SDS和蛋白酶K消化處理，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，洗滌吹干后加三羥甲基氨基甲烷-EDTA液溶解，測定DNA水平后，置-20 ℃保存。

1.3.2 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylationspecif i c polymerase chain reaction，MSP） （1）DNA亞硫酸氫鹽修飾及修飾效果的判斷：按CpGenome DNA Modification Kit說明書操作，取1 μL DNA在堿性條件下變性10 min后加入亞硫酸氫鈉50 ℃修飾16 h，繼續(xù)用乙醇脫鹽，最后獲得經(jīng)三羥甲基氨基甲烷-EDTA液洗脫并修飾的DNA10 μL，測定DNA濃度后置-20 ℃保存。（2）野生型引物擴增：修飾前后的DNA均用野生型引物擴增，以修飾前擴增出目的產(chǎn)物，而修飾后無擴增產(chǎn)物判為修飾成功。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物和產(chǎn)物序列見表1。反應(yīng)體系共20 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L） 1 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）3 μL，200 pmol/μL野生型正向引物（WF）1 μL，200 pmol/μL野生型反向引物（WR）1 μL，模板DNA100 ng，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，加雙蒸水至20 μL。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，33個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。（3）甲基化和非甲基化引物擴增：引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物和產(chǎn)物序列見表1。反應(yīng)體系同上。PCR擴增條件為預(yù)變性94 ℃5 min，變性94 ℃ 30 s，退火40 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，33個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。將正常人外周血DNA經(jīng)CpG甲基轉(zhuǎn)移酶處理后的樣本作為甲基化陽性對照，將設(shè)有甲基化陽性對照，甲基化引物MSP出現(xiàn)目的片段的樣本作為C-erbB-2基因啟動子CpG島甲基化的陰性對照（即非甲基化的陽性對照），將設(shè)有甲基化陽性對照、甲基化引物MSP結(jié)果出現(xiàn)目的片段而非甲基化引物MSP不出現(xiàn)目的片段的樣本作為非甲基化陰性對照，將去離子水作為空白對照。甲基化特異引物對（MF/MR）有擴增目的片段者為甲基化陽性；非甲基化特異引物對（UF/UR）有擴增目的片段且MF/MR引物對無擴增目的片段者為甲基化陰性[8]。

表 1 C-erbB-2基因啟動子區(qū)甲基化MSP檢測所用的引物序列

1.3.3 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）方法 組織切片，石蠟包埋，干燥后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，置新鮮配置的含3%過氧化氫去離子水室溫放置15 min，繼而用蒸餾水沖洗。將切片放入盛有枸櫞酸抗原修復(fù)液（pH值6.0）的容器中進行抗原修復(fù)，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌。滴加一抗（1∶200）100 μL，4 ℃過夜。PBS洗滌，滴加二抗100 μL，置于37 ℃電熱恒溫水浴箱30 min，PBS洗滌，滴加二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（diaminobenzidine，DAB）顯色，鏡下見棕黃色顆粒后終止反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，溫水返藍。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。將已知染色結(jié)果為陽性的乳腺癌樣本作為陽性對照，用PBS取代一抗作為陰性對照。

1.3.4 結(jié)果判定 乳腺癌組織切片經(jīng)IHC染色后，AR呈深棕色顆粒，位于細胞核上，陽性細胞≥10%為陽性[9]。

1.3.5 隨訪 全部乳腺癌患者自手術(shù)日起隨訪6年（72個月），隨訪時間以月為單位，患者的生存狀態(tài)通過查閱病歷、電話和信訪方式獲得。其中發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的病例則以首次局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移確診日為隨訪終點。發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病例的無瘤生存時間為手術(shù)日至首次局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移確診日的時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗進行各組間的比較。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)性分析法。用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，生存時間的比較應(yīng)用Log-Rank檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR的表達

根據(jù)著色細胞比例和著色強度綜合分析，在76例乳腺癌組織中AR陽性59例（陽性率77.63%），在76例乳腺癌癌旁組織中AR陽性41例（陽性率53.94%），在55例乳腺良性腫瘤組織中AR陽性33例（陽性率60.00%）。癌組織與癌旁組織間以及癌組織與良性腫瘤組織間AR的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而癌旁組織和良性腫瘤組織間AR的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 乳腺組織AR的表達

2.2 乳腺癌及癌旁組織C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化分析

76例乳腺癌組織中有52例C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化陽性，76例乳腺癌癌旁組織中有60例C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化陽性，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）。

2.3 乳腺癌組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與AR蛋白表達的相關(guān)分析

在A R陽性的乳腺癌組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化率為74.58%（44/59），而在AR陰性的乳腺癌組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化率為47.06%（8/17），二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032）；在乳腺癌組織AR陽性患者的癌旁組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化率為81.36%（48/59），而在乳腺癌組織AR陰性患者的癌旁組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化率為70.58%（12/17），二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 乳腺癌組織AR蛋白表達水平和C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化與其他實驗室指標及臨床參數(shù)的關(guān)系

在乳腺癌患者各實驗室指標及臨床參數(shù)分組間，C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化陽性組AR蛋白的表達水平與陰性組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032），C-erbB-2蛋白表達陽性組C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化與陰性組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.020）。見表2、表3。經(jīng)進一步相關(guān)性分析，乳腺癌組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)不僅與AR蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.247，P=0.032），還與癌組織中C-erbB-2蛋白的表達水平呈負相關(guān)（r=-0.268，P=0.020）。

2.5 預(yù)后分析

乳腺癌組病例隨訪自手術(shù)日開始，至術(shù)后6年（72個月）截止。其中無瘤生存者62例（81.57%），局部復(fù)發(fā)1例（1.32%），遠處轉(zhuǎn)移4例（5.26%），死亡9例（11.84%）。在AR陽性的59例患者中，無瘤生存者51例（86.44%），局部復(fù)發(fā)1例（1.69%），遠處轉(zhuǎn)移2例（3.39%），死亡5例（9.80%），患者中生存者共54例（存活率91.52%）；在AR陰性的17例患者中，無瘤生存者11例（64.70%），遠處轉(zhuǎn)移2例（11.76%），死亡4例（23.53%），患者中生存者共13例（存活率76.47%）。乳腺癌AR陽性患者無瘤生存率高于AR陰性患者（P＜0.05），總生存曲線和無瘤生存曲線見圖2和圖3。乳腺癌AR陽性患者和AR陰性患者總生存曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.100），二者的無瘤生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.040）。

表2 乳腺癌組織中AR蛋白的表達水平與其他實驗室指標及臨床參數(shù)間的關(guān)系

2.6 AR與三陰性乳腺癌

76例病例中共有三陰性乳腺癌患者8例。三陰性乳腺癌患者中AR陽性5例，其中死亡2例（40%），轉(zhuǎn)移1例（20%）；AR陰性3例，其中死亡1例（33.33%）。二者間生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 乳腺癌組織C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)與臨床參數(shù)間的關(guān)系

圖2 乳腺癌患者AR不同表達狀態(tài)的總生存曲線

圖3 乳腺癌患者AR不同表達狀態(tài)的無瘤生存曲線

3 討論

DNA甲基化是癌基因的活化及抑癌基因失活的重要機制之一[10]。C-erbB-2基因在20%～30%的浸潤性乳腺癌中過表達[11]，C-erbB-2基因陽性與較差的預(yù)后相關(guān)，預(yù)示腫瘤具有更高的侵襲性。以往研究表明乳腺癌等腫瘤中DNA的甲基化與激素受體的表達狀態(tài)相關(guān)[7，12]。

近年來有關(guān)AR與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系也越來越受關(guān)注。在一些研究中顯示雄激素是絕經(jīng)后女性乳腺癌發(fā)病的高發(fā)因素，且雄激素大多通過AR發(fā)揮作用[13]。BENEVOLENSKAYA等[14]研究發(fā)現(xiàn)高水平啟動子區(qū)甲基化與乳腺腫瘤激素受體陽性狀態(tài)密切相關(guān)；PARK等[8]報道基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化與不同組織病理學(xué)類型的乳腺癌特征有關(guān)，除了組織學(xué)類型、腫瘤級別外，與激素受體和C-erbB-2狀態(tài)等相關(guān)。

已有研究表明AR與C-erbB-2基因之間存在相關(guān)性。HODGSON等[15]研究發(fā)現(xiàn)AR缺失的雌性小鼠檢測到乳腺腫瘤的時間比對照組小鼠早近100 d，提示AR功能缺失的小鼠乳腺上皮細胞更容易表達C-erbB-2基因而發(fā)生癌變。尼杰等[16]報道，AR陽性的C-erbB-2基因過表達型乳腺癌（ER、PR均表達陰性）患者具有較低的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。SIMANAINEN等[17]報道，AR基因敲除顯著增加了雌性小鼠對二甲基苯蒽（dimethylbenzanthracine，DMBA）誘發(fā)乳腺癌的易感性。

本課題組近年來一直從事腫瘤組織C-erbB-2基因啟動子區(qū)甲基化的研究[18]。本研究分別采用MSP和IHC分析乳腺癌中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)和AR蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，癌組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化率低于癌旁組織，呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)；同時，癌組織中的AR蛋白的表達水平顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。乳腺癌組織中的AR蛋白表達水平與癌組織中C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化呈正相關(guān)（r=0.247，P=0.032）；乳腺癌組織中的C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)與癌組織中C-erbB-2蛋白表達呈負相關(guān)（r=-0.268，P=0.020）。

AR的表達與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)。LOIBL等[19]報道，與AR陰性的乳腺癌患者比較，AR陽性患者的無病生存期及總生存期更長，在三陰性乳腺癌中尤為明顯。CASTELLANO等[20]發(fā)現(xiàn)在938例ER陽性的乳腺癌患者中，AR陽性患者的復(fù)發(fā)時間及疾病特異生存期更長。但在本研究中，可能由于病例數(shù)較少（尤其是三陰性乳腺癌僅8例）的緣故，AR陰性和陽性患者的總生存曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.100），但乳腺癌AR陽性患者無瘤生存率卻顯著高于AR陰性患者（P=0.040）。隨著AR表達程度的升高，患者預(yù)后更好。結(jié)合前面的研究結(jié)果，我們推測：AR高表達的乳腺癌患者C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化水平較高，而C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的高甲基化水平導(dǎo)致C-erbB-2蛋白的低表達（預(yù)后較好，與生存分析結(jié)果一致），提示AR可能通過影響C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化水平來影響乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，C-erbB-2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化與AR蛋白的表達狀態(tài)呈正相關(guān)，與AR陰性患者相比，AR陽性患者具有更好的預(yù)后，乳腺癌組織AR蛋白表達狀態(tài)可作為乳腺癌預(yù)后轉(zhuǎn)歸的預(yù)測依據(jù)之一。本研究可為乳腺癌的激素治療及預(yù)后轉(zhuǎn)歸的預(yù)測提供新的理論依據(jù)。

[1] LEUNG E Y，ASKARIAN-AMIRI M E，SARKAR D，et al. Endocrine therapy of estroge receptor-positive breast cancer cells：early differential effects on stem cell markers[J]. Front Oncol，2017，7：184.

[2] SCHRIJVER WAME，SCHUURMAN K，VAN ROSSUM A，et al. Loss of steroid hormone receptors is common in malignant pleural and peritoneal effusions of breast cancer patients treated with endocrine therapy[J]. Oncotarget，2017，8（33）：55550-55561.

[3] NAHLEH Z. Androgen receptor as a target for the treatment of hormone receptor-negative breast cancer：an unchartered territory[J]. Future Oncol，2008，4（1）：15-21.

[4] HARDIN C，POMMIER R，CALHOUN K，et al. A new hormonal therapy for estrogen receptor-negative breast cancer[J]. World J Surg，2007，31（5）：1041-1046.

[5] SPEERS C，ZHAO S G，CHANDLER B，et al.Androgen receptor as a mediator and biomarker of radioresistance in triple-negative breast cancer[J]. NPJ Breast Cancer，2017，3：29.

[6] TONG Z J，SHI N Y，ZHANG Z J，et al.Expression and prognostic value of HER-2/neu in primary breast cancer with sentinel lymph node metastasis[J]. Biosci Rep，2017，37（4）：pii：BSR20170121.

[7] CALLAHAN C L，WANG Y，MARIAN C，et al.DNA methylation and breast tumor clinicopathological features：the Western NewYork Exposures and Breast Cancer（WEB） study[J]. Epigenetics，2016，11（9）：643-652.

[8] PARK S Y，KWON H J，CHOI Y，et al. Distinct patterns of promoter CpG island methylation of breast cancer subtypes are associated with stem cell phenotypes[J]. Mod Pathol，2012，25（2）：185-196.

[9] ZHAO L，NIU F，SHEN H，et al. Androgen receptor and metastasis-associated protein-1 are frequently expressed in estrogen receptor negative/HER2 positive breast cancer[J]. Virchows Arch，2016，468（6）：687-696.

[10] ESTELLER M，CORN P G，BAYLIN S B，et al.A gene hypermethylation prof i le of human cancer[J].Cancer Res，2001，61（8）：3225-3229.

[11] MOASSER M M. The oncogeneHER2：its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis[J]. Oncogene，2007，26（45）：6469-6487.

[12] ELSTRODT F，HOLLESTELLE A，NAGEL J H，et al. BRCA1 mutation analysis of 41 human breast cancer cell lines reveals three new deleterious mutants[J]. Cancer Res，2006，66（1）：41-45.

[13] SHIPPINGER W，REGITNIG P，DANDACHI N，et al. Evaluation of the prognostic significance of androgen receptor expression in metastatic breast cancer[J]. Virchows Arch，2006，449（1）：24-30.

[14] BENEVOLENSKAYA E V，ISLAM A B，AHSAN H，et al. DNA methylation and hormone receptor status in breast cancer [J]. Clin Epigenetics，2016，8：17.

[15] HODGSON M C，VANOSTRAN G，ALGHAMDI S，et al. Reduced androgen receptor expression accelerates the onset of ERBB2 induced breast tumors in female mice[J]. PLoS One，2013，8（4）：e60455.

[16] 尼杰，沈立杰，霍俊杰，等. 雄激素受體在Her-2過表達型乳腺癌中的表達及其臨床意義[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（17）：2854-2856.

[17] SIMANAINEN U，GAO Y R，WALTERS K A，et al. Androgen resistance in female mice increases susceptibility to DMBA-induced mammary tumors[J].Horm Cancer，2012，3（3）：113-124.

[18] 金姝，朱琪，秦華暉，等. 乳腺癌C-erbB-2蛋白表達與基因CpG島甲基化狀態(tài)和mRNA表達的關(guān)系[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2011，26（11）：750-755.

[19] LOIBL S，MüLLER B M，VON MINCKWITZ G，et al. Androgen receptor expression in primary breast cancer and its predictive and prognostic value in patients treated with neoadjuvant chemotherapy[J].Breast Cancer Res Treat，2011，130（2）：477-487.

[20] CASTELLANO I，ALLIA E，ACCORTANZO V，et al. Androgen receptor expression is a significant prognostic factor in estrogen receptor positive breast cancers[J]. Breast Cancer Res Treat，2010，124（3）： 607-617.