余佳佳， 劉婧嫻， 李媛睿， 俞 靜， 劉 瑛

（上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092）

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科細菌中常見的病原菌之一，臨床分離率高達14%[1]。目前肺炎克雷伯菌的耐藥形勢越來越嚴峻，對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率在10%以上[1-2]。對于此類耐藥菌，經(jīng)驗性單一抗菌藥物的使用可能會導致抗感染治療失敗[3]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）的主要耐藥機制是產(chǎn)碳青霉烯酶。我國流行的CRKP 70%以上為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌[4-5]。因此，及時、快速地檢測該型別肺炎克雷伯菌對指導臨床抗菌藥物的使用和控制院內(nèi)耐藥性的傳播有重要意義。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近幾年來用于微生物鑒定的有效工具，因具有快速、簡便等優(yōu)點使其在臨床微生物實驗室得到廣泛應用。根據(jù)國外文獻報道，MALDITOF MS除了可以用于細菌種屬鑒定外，還具有鑒別亞型的潛力[5-9]。本研究旨在利用MALDITOF MS篩選出ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰，從而在微生物實驗室臨床常規(guī)鑒定工作中可快速檢測該型別肺炎克雷伯菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選取2009—2016年上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院微生物實驗室前期收集并已進行碳青霉烯酶基因檢測以及多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）的肺炎克雷伯菌207株，其中118株（ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌67株，非該型別的肺炎克雷伯菌51株）作為特異峰篩選組；89株（ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌37株，非該型別的肺炎克雷伯菌52株）作為特異峰驗證組，其中9株產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌由復旦大學附屬華山醫(yī)院（5株ST423型，2株ST65型，1株ST11型）和上海交通大學附屬兒童醫(yī)院（1株ST11型）提供。隨機收集2016年10月—2017年2月MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌且質(zhì)譜評分＞2.00的臨床分離菌95株，用于評估特異峰的臨床應用價值。

1.1.2 試劑和儀器 甲酸和乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）基質(zhì)和標準蛋白校準品購自德國Bruker Daltonik公司；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物購自生工生物工程（上海）有限公司，PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。Microflex LT質(zhì)譜儀、96孔金屬靶板、Flex control 3.0軟件、MicroFlex Biotyper 3.0鑒定分析軟件、Clinpro Tools 3.0軟件以及Flex analysis 3.0圖譜分析軟件均購自德國Bruker Daltonik公司；Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR儀和微量移液器購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 特異峰篩選試驗 （1）質(zhì)量圖譜的獲?。簩?80 ℃保存的118株肺炎克雷伯菌在室溫下復蘇后接種至麥康凱平板上，35 ℃孵育16～24 h，然后挑取單個菌落轉(zhuǎn)種于血平板，35 ℃孵育16～24 h后挑取單個菌落混于70%（V/V）的乙醇溶液中，3 000×g離心5 min后去上清，在菌落沉淀中加入甲酸、乙腈混合溶液（1∶1），裂解細菌，取1 μL裂解液加入96孔靶板，自然干燥后加入1 μL HCCA基質(zhì)，自然干燥后進行MALDI-TOF MS檢測。利用Flex control 3.0軟件獲得質(zhì)量圖譜并保存，校準物質(zhì)為標準蛋白校準品。參數(shù)設置：m/z范圍2 000～20 000，shots 200，激光強度80%。將圖譜導入MicroFlex Biotyper 3.0鑒定分析軟件，與數(shù)據(jù)庫進行比對，當鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌且質(zhì)譜評分＞2.30時，再利用Flex analysis 3.0圖譜分析軟件對質(zhì)譜峰圖進行曲線光滑去噪及基線去除處理。（2）特異峰的篩選：將118株肺炎克雷伯菌中67株ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的圖譜作為A組，51株非該型別的肺炎克雷伯菌的圖譜作為B組，導入Clinpro Tools 3.0軟件，進行統(tǒng)計學分析，獲得按照統(tǒng)計學意義排列的質(zhì)量峰列表；繪制排名前5位質(zhì)量峰的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，比較曲線下面積（area under curve，AUC）；通過主成分分析（principal component analysis，PCA）獲得A組和B組的散點分布圖，綜合以上條件確定ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的最特異峰，并通過Flex analysis 3.0圖譜分析軟件對挑選出的特異峰進行肉眼觀察。

1.2.2 特異峰驗證和重復性試驗 按照上述操作步驟獲得特異峰驗證組89株肺炎克雷伯菌的質(zhì)量圖譜，導入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件。采用肉眼觀察特異峰的方法對菌株進行分類，并從中隨機挑選出60株肺炎克雷伯菌（ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌及非該型別肺炎克雷伯菌各30株）。在血平板上獲得新鮮菌落后，挑取3個單菌落分別進行裂解，取1 μL單菌落的裂解液點樣在金屬靶板孔位上，分別在每個孔位的3個不同位置獲取圖譜，則1株菌共有9個質(zhì)量圖譜，將圖譜導入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件，肉眼觀察是否存在特異峰，計算特異峰的重復性。

1.2.3 臨床應用評估 隨機收集2016年10月—2017年2月日常工作中MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌且質(zhì)譜評分＞2.00的臨床菌株95株，觀察其臨床鑒定圖譜是否具有特異峰，并對所有菌株進行碳青霉烯酶基因檢測和MLST，從而計算特異峰的特異性和敏感性。

1.2.4 碳青霉烯酶基因檢測和MLST 利用PCR檢測用于臨床評估的95株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaGES、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2、blaNDM-1和blaOXA-48[10]，并對陽性擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果提交美國國立生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站進行Blast比對。根據(jù)MLST網(wǎng)站（http：//bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）的推薦，采用PCR檢測肺炎克雷伯菌的7個管家基因，即gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB，對擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果與MLST databases進行比對后獲得等位基因組合所對應的ST型。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Clinpro Tools 3.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用表達，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 特異峰篩選

特異峰篩選組菌株的碳青霉烯酶基因類型和MLST見表1。118株肺炎克雷伯菌的圖譜在Clinpro Tools 3.0軟件中通過統(tǒng)計學分析獲得質(zhì)量峰列表，其中排名前5位的質(zhì)量峰分別為m/z 4 521、4 510、2 763、6 514和4 648。排名第1位的質(zhì)量峰m/z 4 521，A組平均信噪比是5.74±2.69，B組平均信噪比是0.67±0.31，二者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），變異系數(shù)為46.88%。質(zhì)量峰的ROC曲線見圖1，其中質(zhì)量峰m/z 4 521的AUC最大，為1.000。雖然質(zhì)量峰m/z 2 763的AUC為0.998，但由于變異系數(shù)為62.31%，統(tǒng)計學意義低于m/z 4 510（AUC=0.947，變異系數(shù)=31.38%）。通過主成分分析獲得A組和B組的特異峰信噪比分析圖（圖2），圖中可看出在m/z 4 521的方向，A組和B組間分界明顯，而在m/z 4 510方向A組和B組有較多重合。

將特異峰篩選組菌株的質(zhì)量圖譜導入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件，并將質(zhì)量圖譜進行局部放大，m/z分析范圍設定為4 300～5 200，設定確認特異峰存在的條件為：信噪比＞3.000，容忍度為m/z ±3。

表1 118株特異峰篩選組菌株的碳青霉烯酶基因類型和MLST

圖1 質(zhì)量峰m/z 4 521、2 763、4 510、6 514和4 648的ROC曲線

圖2 ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌和其他型別肺炎克雷伯菌特異峰信噪比分析

2.2 特異峰的驗證和重復性試驗

89株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因類型和MLST見表2。將所有質(zhì)量圖譜導入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件，若肉眼觀察存在特異峰m/z 4 521，則判斷此菌株為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌，未出現(xiàn)該特異峰，則判斷為其他型別肺炎克雷伯菌（圖3）。肉眼觀察特異峰分類方法的敏感性為97.3%（36/37），特異性為98.1%（51/52）。

表2 89株特異峰驗證菌株的碳青霉烯酶基因型別和MLST

圖3 不同型別肺炎克雷伯菌的MALDI-TOF MS質(zhì)量圖譜

用于重復性分析的30株ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌共有270個質(zhì)量圖譜，其中有7個圖譜（分別屬于不同的菌株）無特異峰m/z 4 521，其余263個圖譜均有該特異峰，該特異峰重復率為97.4%（263/270）。另外30株非該型別肺炎克雷伯菌的270個質(zhì)量圖譜均無特異峰m/z 4 521。

2.3 臨床應用評估

2016年10月—2017年2月共收集了95株肺炎克雷伯菌及其臨床鑒定圖譜，菌株的碳青霉烯酶基因和MLST檢測結(jié)果見表3，其中ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌32株，非該型別肺炎克雷伯菌63株，肉眼觀察臨床鑒定圖譜是否存在特異峰m/z 4 521的方法對ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌進行鑒別的特異性為95.2%（60/63），敏感性為96.9%（31/32）。

表3 95株臨床菌株碳青霉烯酶基因型別及MLST

3 討論

碳青霉烯類藥物是治療腸桿菌科細菌重癥感染的一線抗菌藥物，但近年來CRKP的檢出率日益增加，CRKP對包括碳青霉烯類在內(nèi)的多種不同類型抗菌藥物廣泛耐藥，從而導致臨床治療失敗，嚴重威脅患者生命。根據(jù)耐藥機制研究和流行病學分析可知，我國CRKP的主要流行株為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌。目前檢測肺炎克雷伯菌產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的金標準是PCR，而確定其ST型則需對特定保守基因進行DNA測序，這2種方法都較為繁瑣，需要特殊的試劑和儀器，且對操作人員有較高的要求，在臨床微生物實驗室無法得到常規(guī)開展。MALDI-TOF MS在臨床微生物實驗室已常規(guī)用于病原菌鑒定，具有快速、簡便的優(yōu)點。通過質(zhì)量圖譜與數(shù)據(jù)庫的比對，可獲得細菌的種屬信息。質(zhì)量圖譜中包含的蛋白質(zhì)的表達信息不僅可用于種屬鑒定，對細菌的進一步分型也具有指導作用。

本研究采用MALDI-TOF MS對ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌和其他型別的肺炎克雷伯菌進行比對分析，篩選出ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰m/z 4 521。通過對特異峰m/z 4 521進行試驗驗證，發(fā)現(xiàn)利用該特異峰檢測ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌有很高的特異性和敏感性，并且該特異峰重復性很高，因此在日常臨床工作中可根據(jù)分離菌的單個鑒定圖譜是否有特異峰m/z 4 521快速檢測ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌。該方法快速、簡便且不需要增加額外的儀器、試劑、費用和工作量等。

本研究包含了各種型別肺炎克雷伯菌，除了ST11型產(chǎn)KPC-2、其他ST型產(chǎn)KPC-2、ST11型不產(chǎn)碳青霉烯酶以及其他ST型產(chǎn)其他碳青霉烯酶的CRKP外，還包括了對碳青霉烯類抗菌藥物敏感的其他ST型菌株，基本包含了臨床中分離的所有型別肺炎克雷伯菌。較多的菌株數(shù)量和豐富的菌株型別充分證明質(zhì)量峰m/z 4 521是ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰。

本研究在進行特異峰篩選和驗證試驗時，對菌株孵育時間、接種平板種類、裂解方法以及質(zhì)譜參數(shù)都進行了嚴格規(guī)定，確保獲得的鑒定圖譜評分＞2.30，使細菌準確鑒定至種水平。由于麥康凱平板上生長的肺炎克雷伯菌形態(tài)更易與其他腸桿菌科細菌區(qū)分，本實驗室在臨床日常工作中常規(guī)利用MALDI-TOF MS直接對麥康凱平板上生長的菌落進行質(zhì)譜鑒定，并且根據(jù)質(zhì)譜儀廠商規(guī)定，鑒定圖譜評分只需＞2.00，即可將菌株鑒定至種水平，因此日常工作中質(zhì)量圖譜的獲取很難按照試驗設計的條件進行。為了確保利用特異峰m/z 4 521的存在與否來判斷菌株是否為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的方法具有臨床應用價值，本研究對95株肺炎克雷伯菌的常規(guī)臨床鑒定圖譜進行了特異峰觀察，發(fā)現(xiàn)該方法的特異性和敏感性均＞95.0%。由此證明在臨床日常工作中，即使是未按照試驗條件而獲取的質(zhì)量圖譜，也可根據(jù)特異峰m/z 4 521的存在與否，快速、準確地判斷菌株是否為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌。

本研究對特異峰進行了臨床應用價值評估，發(fā)現(xiàn)在2株ST11型不產(chǎn)碳青霉烯酶和1株ST29型不產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的臨床鑒定圖譜中存在特異峰m/z 4 521，1株ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的臨床圖譜中并不存在特異峰m/z 4 521，這些菌株按照試驗條件重新獲取圖譜后觀察到特異峰，結(jié)果與臨床鑒定圖譜一致。本研究還對這4株菌重新進行了紙片擴散法藥物敏感性試驗、改良Hodge試驗以及碳青霉烯酶失活試驗，檢測耐藥表型和碳青霉烯酶活性，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果相符。由于質(zhì)量峰m/z 4 521是ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰，故推測該特異峰對應的蛋白質(zhì)可能參與ST11型肺炎克雷伯菌產(chǎn)生并分泌KPC-2型碳青霉烯酶的過程，且編碼基因有可能位于質(zhì)粒上，因此出現(xiàn)上述2種情況的原因可能是含有特異峰對應蛋白質(zhì)編碼基因的質(zhì)粒穩(wěn)定性略差，在傳代過程中有可能發(fā)生丟失和傳播，這還有待后續(xù)研究進一步證實。

據(jù)報道，日本學者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的特異峰m/z 11 109，該特異峰的本質(zhì)為PKPQIL-p019蛋白，編碼該蛋白的基因與blaKPC毗鄰位于PKPQIL型質(zhì)粒的Tn4401轉(zhuǎn)座子內(nèi)[11-12]。但該質(zhì)粒僅在日本流行，在其他地區(qū)流行的不攜帶該質(zhì)粒的產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌無法檢測到該特異峰[13]。在本實驗室獲得的鑒定圖譜中亦未發(fā)現(xiàn)特異峰m/z 11 109，查閱文獻發(fā)現(xiàn)本地區(qū)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌blaKPC主要位于IncFⅡ或IncX質(zhì)粒上的Tn1721和Tn3轉(zhuǎn)座子內(nèi)[7]。因此我們推測，對于遺傳背景不同的菌株，其特異峰也不盡相同。在本研究中，我們納入了復旦大學附屬華山醫(yī)院和上海交通大學附屬兒童醫(yī)院的菌株，試驗結(jié)果表明，利用特異峰m/z 4 521存在與否來鑒別菌株是否為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的方法在上海地區(qū)可能具有普遍適用性。該方法具有快速、簡便、經(jīng)濟和適用性強等優(yōu)點，因此在區(qū)域流行病學研究中有良好的應用前景。

綜上所述，本研究利用MALDI-TOF MS篩選出ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰m/z 4 521，并且驗證了該特異峰具有良好的臨床應用前景。該特異峰可快速、準確地檢測ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌，對此類臨床常見型別肺炎克雷伯菌的用藥指導和流行病學研究有重要的意義。

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