宋云霄， 鄔建民， 張海晨

（1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 200031；2.上海市楊浦區(qū)精神衛(wèi)生中心檢驗科，上海 200093）

甲狀腺激素和甲狀腺相關抗體的檢測是輔助診斷甲狀腺疾病的主要方法之一。反三碘甲狀腺原氨酸（reverse triiodothyronine，rT3）是由甲狀腺素（thyroxine，T4）在外周組織中經(jīng)5-脫碘酶脫碘形成。rT3與三碘甲狀腺原氨酸（3，5，3'-triiodothyronine，T3）的結構基本相同，僅是3個碘原子在3、3'、5'位。雖然rT3與T3在化學結構上屬異構體，但rT3幾乎無生理活性。血清中T4、T3和rT3維持在一定比例，可以反映甲狀腺激素在體內的代謝情況[1]。rT3的生物轉化特征使其在甲狀腺功能減退（簡稱甲減）相關疾病的診療中有著重要的意義，尤其是在原發(fā)性甲減和正常甲狀腺病態(tài)綜合征（euthyroid sick syndrome，ESS）的鑒別診斷中，rT3有很高的臨床價值，可避免已罹患原發(fā)疾病，如肝臟疾病、腎臟疾病、心臟疾病、腫瘤、糖尿病等患者在甲狀腺功能異常時的非必要治療[1-3]。目前，臨床實驗室用于rT3檢測的方法主要有放射免疫法、酶免法、同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質譜法和化學發(fā)光法。放射免疫法由于方法學的局限性，對操作要求較高，試劑盒使用難度較大，檢測過程中存在安全隱患，其應用逐漸減少[4]。酶免法由于操作時間長，不可控因素較多，導致其無法被廣泛應用[5]。同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質譜法由于檢測成本高、儀器昂貴、對檢測人員的要求較高等原因而無法用于大批量樣本的檢測。目前，臨床應用較多的是化學發(fā)光法。本研究對化學發(fā)光法檢測rT3的主要分析性能進行了驗證，并初步評價了rT3在各類甲狀腺疾病患者中的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年12月—2017年12月上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院門診或住院的符合相關疾病診斷標準[6]的各類疾病患者131例，其中甲狀腺功能亢進（簡稱甲亢）初診未治療患者30例[甲亢組，男13例，女17例，年齡（40.23±12.12）歲；包括Graves'病25例、多結節(jié)性甲狀腺腫伴甲亢2例、甲狀腺自主性高功能腺瘤2例、碘甲亢1例]、甲亢治療1個月的患者28例[甲亢治療組，男12例，女16例，年齡（42.37±14.56）歲；包括甲硫咪唑治療者15例、丙硫氧嘧啶治療者9例、131I治療者4例]、甲減初診未治療患者25例[甲減組，男10例，女15例，年齡（46.17±9.68）歲；包括原發(fā)性甲減23例、中樞性甲減2例]、甲減治療1個月的患者23例[甲減治療組，男9例，女14例，年齡（45.12±9.38）歲；均服用左甲狀腺素治療]、明確原發(fā)基礎疾病的患者25例[ESS組，男16例，女9例，年齡（56.17±10.58）歲；包括肝臟彌漫性損傷4例、腎臟衰竭尿毒癥期4例、心肌梗死6例、乳腺癌7例、直腸癌4例]。甲狀腺疾病及治療患者均排除高血壓、糖尿病、血脂異常、肝臟疾病、腎臟疾病及心臟疾病，且近2個月無影響激素代謝的藥物服用史。另選取上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院體檢健康者50名作為正常對照組，其中男26名、女24名，年齡（43.23±13.72）歲，均無心血管、肺、腎、肝、膽、胰等器官的器質性疾病，甲狀腺功能檢測及甲狀腺超聲檢查無異常，隨訪6個月內無甲狀腺相關疾病發(fā)生。

1.2 儀器與試劑

血清rT3分別采用化學發(fā)光法[CL2000i全自動化學發(fā)光免疫系統(tǒng)（深圳邁瑞公司）及配套試劑盒（批號2017120100）]和放射免疫法[SN-693型γ放射免疫計數(shù)器（上海日環(huán)公司）、125I放射免疫分析試劑盒（批號20170710C，北京北方生物技術研究所）]檢測。血清促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、血清總T3和血清總T4采用ARCHITECT i2000化學發(fā)光免疫分析儀（美國雅培公司）及配套試劑（化學發(fā)光法）檢測。rT3免疫測定用國家標準品（批號150552-0004）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 方法學評價

1.3.1 精密度評價 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A3文件[7]，連續(xù)測定高、低值質控品20次，計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），以此作為批內精密度。每天重復檢測高、低值質控品2次，連續(xù)檢測20 d，計算CV，以此作為日間精密度。

1.3.2 正確度評價 采用rT3免疫測定用國家標準品配制低值（0.84 ng/mL）和高值（2.98 ng/mL）2個水平的樣本。參照CLSI EP15-A文件[8]，連續(xù)檢測上述樣本5 d，每天重復檢測5次。計算檢測結果與標定值之間的相對偏移。

1.3.3 分析靈敏度（最低檢測限）評價 參照《體外診斷試劑分析性能評估指導原則——檢測限》[9]，在儀器校準后，連續(xù)重復測定rT3零濃度校準品20次，得到相應的相對發(fā)光值（relative light unit，RLU），計算均值和標準差（s）。將對應的RLU代入主定標曲線方程中，得到最低檢測限。

1.3.4 分析特異性評價 （1）類似物干擾實驗：準備不含rT3的零值樣本，向樣本中分別添加類似物（T3、T4、三碘甲狀腺素乙酸、3，5-二碘甲狀腺素、3，5-二碘酪氨酸、T3鈉鹽、3-碘酪氨酸），制備干擾樣本。檢測干擾樣本中的rT3水平，計算交叉反應率（交叉反應率=樣本均值/類似物水平×100%）。（2）血清內源性干擾物干擾實驗：根據(jù)CLSI EP7-A2文件[10]，通過添加不同量的rT3標準品，配置高、低水平的血清樣本，此為基礎樣本。準確稱取干擾物質，配置干擾物母液，按廠商試劑說明書中聲明的最高干擾物濃度（甘油三酯20 mg/mL、膽紅素200 mg/L、血紅蛋白1 000 mg/L、白蛋白100 g/L）向基礎樣本中加入干擾物，此為干擾樣本。分別檢測基礎樣本和干擾樣本中的rT3水平，計算二者的相對偏差[相對偏差=（干擾樣本-基礎樣本）/基礎樣本×100%]。

1.3.5 線性范圍評價 取1份接近預期上限的混合血清樣本（H），測定rT3水平。采用原裝樣本稀釋液（L），按體積比5L、4L∶1H、3L∶2H、2L∶3H、1L∶4H、5H配制成6個水平的系列樣本，每份樣本測定2次，取預期值（X）計算公式：X=（CL×VL+CH×VH）/（VL+VH），式中C為濃度，V為體積。按CLSI EP6-A文件[11]提供的方案初步檢查數(shù)據(jù)、離群值，判斷重復性，之后進行多元線性回歸分析，將結果分別擬合一次、二次、三次多項式，并繪制散點圖。

1.3.6 參考區(qū)間驗證 在正常對照者中隨機抽取20名，男、女各10名，年齡18～48歲。在檢測系統(tǒng)質控在控的情況下檢測rT3，根據(jù)公式計算樣本的陽性率，進行參考區(qū)間的驗證。陽性樣本率=（高于參考區(qū)間上限的例數(shù)+低于參考區(qū)間下限的例數(shù)）/總樣本數(shù)×100%。

1.3.7 方法學比對 根據(jù)CLSI EP9-A3文件[12]，同時采用化學發(fā)光法和放射免疫法分別隨機檢測70份血清樣本，以放射免疫法（比較方法）的檢測結果為橫坐標，以化學發(fā)光法（實驗方法）的檢測結果為縱坐標，繪制散點圖，明確實驗方法和比較方法之間的相關性，若所得結果線性良好，比較二者檢測數(shù)據(jù)，得回歸方程Y= aX+ b，計算r值。

1.3.8 臨床應用評價 分別檢測甲亢組、甲亢治療組、甲減組、甲減治療組、ESS組和正常對照組的甲狀腺功能相關指標（TSH、T3、T4及rT3），比較不同甲狀腺疾病患者的甲狀腺激素檢測結果及rT3輔助診斷ESS的價值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Microsoft Excel 2013及SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。對檢測數(shù)據(jù)進行K-S正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的計量資料以呈正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析及q檢驗。兩變量間的相關性采用Pearson線性相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 精密度評價

化學發(fā)光法檢測rT3高值和低值質控品的批內精密度（CV）分別為4.82%和4.95%，批間精密度（CV）分別為7.51%和5.90%，均低于廠商聲明的CV（≤10%）。見表1。

表1 精密度評價

2.2 正確度評價

高值和低值樣本的相對偏移分別為-1%和1%，均在可接受標準（相對偏差≤±10%）之內。見表2。

表2 正確度評價結果

2.3 分析靈敏度（最低檢測限）評價

rT3零濃度校準品的RLU的為 2 507 565.00，s為84 664.30，CV為3.38%，的值為2 676 894.00，對應的rT3水平為0.05 ng/mL。最低檢測限在可接受標準（≤0.05 ng/mL）之內。

2.4 分析特異性評價

類似物檢測所得的交叉反應率分別為T30.2‰、T40.6‰、三碘甲狀腺素乙酸 0.5‰、3，5-二碘甲狀腺素 0.5‰、3，5-二碘酪氨酸0.8‰、T3鈉鹽 0.4‰、3-碘酪氨酸 0.2‰。所選類似物的交叉反應率均在可接受范圍（≤1‰）內；檢測內源性干擾物的檢測偏差均在可接受范圍內（相對偏差≤±10%）。

2.5 線性范圍評價

預期值和實測值均無離群值，最佳擬合方程為一次多項式，回歸方程為Y=1.008X+0.153（r=0.999）。6個水平的樣本相對偏移的絕對值為0%～7.9%，平均偏移為4.17%。以10%作為相對偏移的判斷標準，化學發(fā)光法測定rT3在0.05～10.07 ng/mL范圍內呈線性，與廠商聲明的線性范圍（0.05～10.00 ng/mL）基本一致。

2.6 參考區(qū)間驗證

20名正常對照者的rT3檢測結果均在廠商聲明的參考區(qū)間（0.20～0.95 ng/mL）內，樣本陽性率為0%，符合參考區(qū)間驗證的可接受標準（陽性率≤10%）。參考區(qū)間驗證通過。

2.7 方法學比對

以化學發(fā)光法為實驗方法（Y），放射免疫法為比較方法（X），得回歸方程為Y=1.055X-0.370（r=0.952）?；瘜W發(fā)光法與放射免疫法相關性良好。見圖1。

圖1 化學發(fā)光法與放射免疫法檢測rT3的相關性分析

2.8 rT3的臨床應用評價

2.8.1 不同甲狀腺疾病患者的rT3水平比較與正常對照組比較，甲亢組rT3、T3、T4水平明顯升高（P＜0.05），TSH水平明顯降低（P＜0.05）。與甲亢組比較，甲亢治療組rT3、T3、T4水平明顯降低（P＜0.05），TSH水平明顯升高（P＜0.05），rT3降低的程度低于T3、T4。與正常對照組比較，甲減組T4和rT3水平明顯降低（P＜0.05），TSH水平明顯升高（P＜0.05）。與甲減組比較，甲減治療組rT3、T4水平明顯升高（P＜0.05），TSH水平明顯降低（P＜0.05），T3和T4均有不同程度上升。甲亢組和甲減組rT3水平變化與T3、T4水平的變化平行。見表3。

2.8.2 rT3的鑒別診斷價值 ESS組rT3水平明顯高于甲減組和正常對照組（P＜0.05），T3和T4水平明顯低于正常對照組（P＜0.05），但與甲減組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），TSH水平明顯低于甲減組（P＜0.05），但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表3 甲狀腺疾病相關甲狀腺激素的檢測結果

表3 甲狀腺疾病相關甲狀腺激素的檢測結果

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與甲亢組比較，#P＜0.05；與甲減組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) T3（nmol/L） T4（nmol/L） rT3（ng/mL） TSH（μIU/L）甲亢組 30 10.27±5.48* 398.23±121.54* 1.57±0.76* 6.40±4.50*甲亢治療組 28 5.23±2.31# 212.21±35.78# 1.22±0.32# 14.20±11.20甲減組 25 0.65±0.23 45.65±10.32* 0.29±0.11* 352.30±225.90*甲減治療組 23 1.98±1.01 68.34±15.23 0.42±0.17 52.40±44.70△正常對照組 50 1.51±0.37 100.94±20.32 0.55±0.10 24.10±13.30

表4 甲減組與ESS組甲狀腺激素檢測結果的比較

表4 甲減組與ESS組甲狀腺激素檢測結果的比較

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與甲減組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) T3（nmol/L） T4（nmol/L） rT3（ng/mL） TSH（μIU/L）ESS組 25 0.83±0.18 58.39±9.23* 0.93±0.23*# 32.70±14.60甲減組 25 0.65±0.23 45.65±10.32* 0.29±0.11* 352.30±225.90*正常對照組 50 1.51±0.37 100.94±20.32 0.55±0.10 24.10±13.30

3 討論

目前，血清rT3被認為是可有效鑒別原發(fā)性甲減和ESS的項目，且有研究結果表明，其水平與T3/rT3比值一樣，可用于評估某些疾病的預后[13-15]。因此，rT3的檢測越來越普遍。本研究采用的化學發(fā)光法檢測rT3的原理是競爭化學發(fā)光免疫分析，即待測物中的游離rT3與rT3抗體-堿性磷酸酶結合成復合物后，生物素化的rT3和鏈霉親和素磁珠競爭性結合rT3抗體-堿性磷酸酶，在化學發(fā)光底物的作用下，根據(jù)產生的光子數(shù)計算待測物中rT3的水平。該法特異性強，光信號持續(xù)時間長且穩(wěn)定，易于測定，大大提升了檢測敏感性。本研究根據(jù)相關標準文件的要求，對化學發(fā)光法檢測rT3的方法學性能進行了驗證。結果顯示化學發(fā)光法的精密度、準確度、分析特異性、線性范圍等性能指標均符合臨床應用要求。化學發(fā)光法的線性范圍的上限為10 ng/mL，而放射免疫法的線性范圍上限僅為3.2 ng/mL。分析特異性評價結果顯示內源性干擾物（T3、T4、三碘甲狀腺素乙酸、3，5-二碘甲狀腺素、3，5-二碘酪氨酸、T3鈉鹽、3-碘酪氨酸）造成的檢測偏差均在可接受范圍內。方法學比對結果顯示化學發(fā)光法與放射免疫法的相關性良好（r=0.952）。由圖1可見，當rT3水平較高時，放射免疫法的檢測結果普遍高于化學發(fā)光法。原因可能與2種方法使用的標準品不同有關。有研究結果表明，標準品對檢測結果的影響較大；另外，放射免疫法對放射性精準度的要求較高，微小、過量或不足均會導致檢測結果出現(xiàn)較大差異[3，14，16]。

本研究結果顯示，甲亢組rT3、T3、T4水平明顯升高（P＜0.05），rT3升高的程度與T3、T4一致。ESS組rT3水平明顯高于甲減組及正常對照組（P＜0.05），這一結果與其他研究相符。ESS非甲狀腺本身病變，而是由于嚴重疾病或饑餓等狀態(tài)導致循環(huán)甲狀腺激素水平降低，是機體的一種保護反應[17]。有研究結果表明，在心肌梗死、呼吸衰竭、卒中等急重癥患者中，rT3也可用于預后評價[18]。目前，在我國相關臨床指南中，不建議用甲狀腺激素替代治療，認為激素療法反而會帶來不良反應[19]。

綜上所述，化學發(fā)光法檢測rT3具有良好的精密度、準確度和特異性，線性范圍較寬，適用于臨床大規(guī)模樣本的檢測。rT3在甲狀腺相關疾病的診斷、鑒別診斷和臨床用藥指導中具有重要作用。

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