唐虹，金鑫，閆曉娜

氯替潑諾是一種局部用新型的糖皮質激素類藥物，是根據(jù)軟藥的原理研究設計出來的。軟藥是容易代謝失活的藥物，在藥物完成治療作用后，按預先設定的代謝途徑和可以控制的速率分解、失活并迅速排出體外，從而避免藥物的蓄積毒性。氯替潑諾易被水解為無活性的有機酸，當用于眼睛后，迅速代謝為無活性的產(chǎn)物，降低了系統(tǒng)毒性，而抗炎作用比潑尼松龍更強。適用于治療眼睛角膜、結膜以及眼前部的炎癥，也可用于眼部手術后預防感染。文獻報道氯替潑諾在臨床上單獨應用或與其他藥物合用，治療干眼癥、過敏性結膜炎、急性前葡萄膜炎及眼部術后抗炎等，是既有效又安全的“原位”產(chǎn)生療效的糖皮質激素[1-6]。本研究將氯替潑諾口服給藥與滴眼給予含有氯替潑諾的滴眼劑后，比較不同給藥途徑血漿中氯替潑諾非活性代謝物PJ90與PJ91的藥動學行為，以評價氯替潑諾給藥后的安全性。

1 材料與方法

1.1 儀器 HP1100型高效液相色譜，檢測器為紫外-可見光檢測器(美國安捷倫公司)；數(shù)據(jù)采集：安捷倫工作站(美國安捷倫公司)；進樣器型號7725i Rheodyne(美國Rheodyne公司)；TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；XW-80A型渦流混合儀(上海醫(yī)科大學儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 試驗制劑：氯替潑諾滴眼液，每劑每毫升含氯替潑諾5 mg，批號：060901-1；氯替潑諾膠囊，每粒含氯替潑諾50 mg，批號：060901-2；對照品：PJ90(批號：060901-3，純度：97%)，PJ91(批號：060901-4，純度：98.5%)。內標：分子式C18H14O10，純度：99.0%。以上藥物均由沈陽華泰藥物研究有限公司提供。甲醇、乙腈均為色譜純，36%乙酸為分析純。

1.3 動物 健康成年比格犬共6只，3雌3雄，體質量為(10.3±0.5)kg，購自大連醫(yī)科大學，許可證號：SCXK(遼)2002-0002。

1.4 樣品采集 6只比格犬，試驗前12 h禁食，給藥后可以自由飲水，仍需禁食4 h。滴眼給藥時每只眼滴入1滴(50 μL)，滴眼給藥時按壓內眼角2 min，防止藥物進入鼻淚管?？诜o藥時每只犬給藥1粒(50 mg)。

采樣時間點如下：給藥前，給藥后15、30、45、60、90 min，2、3、4、6、8、12、24 h由后肢靜脈采血1 mL；全血樣品采集后即刻移入肝素化玻璃離心管內，以3 000 r/min離心10 min，將離心后的上層血漿移入另一干凈血漿樣品管內，-70 ℃冷凍保存待測。

1.5 試驗條件 反相高效液相色譜柱：Diamonsil C18，150 mm×4.6 mm I.D.，5 μm，北京迪馬公司；保護柱型號：DL-II YWG-C18，10 mm×4.0 mm，天津市色譜科學技術公司；流動相為乙腈∶甲醇∶水∶36%乙酸(體積比為50∶6∶56∶0.5)，流速為1.3 mL/min，色譜柱溫度：25 ℃，紫外檢測波長：245 nm。

1.6 血漿樣品預處理 精密移取血漿樣品200 μL，依次精密移取甲醇10 μL，內標溶液C18H14O10甲醇10 μL，內標濃度為15 mg/L。將溶液渦流混勻后，精密移取乙腈500 μL，渦流混合1 min，以3 000 r/min離心10 min。將離心后的樣品上清液移入另一試管中，移取后的上清液在室溫下，用氮氣吹干，流動相100 μL復溶，取20 μL進樣分析。

1.7 專屬性 精密移取200 μL空白比格犬血漿，依上述血漿樣品預處理操作，不加入內標，所得樣品20 μL進行HPLC-UV分析，獲得色譜圖1a(見封三)；空白血漿分別加入濃度為1.5 mg/L的PJ90、1.0 mg/L的PJ91標準溶液，按上述血漿樣品預處理操作，獲得色譜圖1b(見封三)。PJ90、PJ91和內標的保留時間分別為5.2、7.0、10.2 min。1只比格犬口服給予氯替潑諾0.75 h后的血漿樣品，依上述血漿樣品預處理操作，獲得色譜圖1c(見封三)。由所得色譜圖可見，比格犬空白血漿中的內源性物質不干擾測定結果，在PJ90、PJ91和內標的出峰位置均無內源性物質的干擾峰出現(xiàn)。

1.8 定量限 根據(jù)相關規(guī)定[7]，定量下限要求能測定3～5個消除半衰期時未知樣品中的藥物濃度，或者能夠檢測出峰濃度1/10～1/20的藥物濃度。本項試驗中的血漿最低定量濃度分別為0.027 mg/L和0.018 mg/L，信噪比均>10，依據(jù)上述血漿樣品預處理操作，平行制備3樣本，制備三批定量下限樣品，PJ90和PJ91定量下限批內精密度RSD分別為：10.4%和9.8%；PJ90和PJ91定量下限批間精密度RSD分別為：12.9%和15.2%；PJ90和PJ91準確度為：94.2%和95.3%。符合試驗要求及相關規(guī)定。

1.9 血漿標準曲線制備 精密移取200 μL空白比格犬血漿，準確加入PJ90和PJ91的標準系列溶液10 μL，分別制備相當于PJ90血漿濃度0.027，0.067 5，0.135，0.45，1.5，3.0 mg/L和PJ91血漿濃度0.018，0.045，0.09，0.3，1.0，2.0 mg/L的血漿樣品，依據(jù)上述血漿樣品預處理操作，每一濃度平行制備3樣本，準確進樣20 μL。橫坐標為血藥濃度，縱坐標分別為PJ90或PJ91與內標的峰面積比值，采用加權最小二乘法進行回歸運算，權重w=1/x2。所得PJ90直線回歸方程為：y=5.219×10-1x-4.423×10-3，r=0.997 8；所得PJ91直線回歸方程為：y=3.29×10-1x+6.172×10-3，r=0.999 1。結果表明，PJ90血藥濃度在(0.027～3.0)mg/L內為線性關系良好，定量下限為0.027 mg/L；PJ91血藥濃度在(0.018～2.0)mg/L內為線性關系良好，定量下限為0.018 mg/L。

1.10 精密度和回收率 (1)血漿精密度：精密移取200 μL空白比格犬血漿，依照上述血漿樣品預處理操作，準確制備低、中、高三個濃度的質量控制樣品，每一個濃度的血漿樣品平行制備6樣本，相當于PJ90血藥濃度分別為：0.067 5，0.45，2.4 mg/L，相當于PJ91血藥濃度分別為：0.045，0.30，1.6 mg/L。根據(jù)以上濃度連續(xù)制備三批質量控制樣品，按照當批樣品隨行的標準曲線，計算出質量控制樣品的測得濃度。采用同一批質量控制樣品的測得濃度，計算本法的批內精密度RSD，PJ90為：2.8%、7.2%、7.0%，PJ91為：5.1%、5.8%、7.8%；根據(jù)連續(xù)三批的質量控制樣品結果，計算本法的批間精密度RSD，PJ90為：6.1%、9.5%、8.5%，PJ91為：4.5%、7.4%、14.7%。

(2)血漿回收率：用空白血漿配制,分別配置低、中、高三個濃度樣本，相當于PJ90血藥濃度分別為：0.067 5、0.45、2.4 mg/L，相當于PJ91血藥濃度分別為：0.045、0.30、1.6 mg/L。按上述血漿樣品預處理后進樣。將空白比格犬血漿樣品按上述血漿樣品預處理，不加入PJ90、PJ91及內標，移取上清溶液后，再分別加入PJ90和PJ91三個濃度等量的樣品及內標溶液，以此為標準與同等濃度質量控制樣品比較，計算兩組峰面積比值，獲得PJ90和PJ91提取回收率。PJ90三個濃度的血漿樣品提取回收率分別為：98.8%、97.0%、99.1%，PJ91三個濃度的血漿樣品提取回收率分別為：95.4%、98.6%、99.3%。

1.11 穩(wěn)定性 本試驗分別考察了PJ90和PJ91用高、中、低已知濃度的血漿質控樣品經(jīng)三次冷凍-解凍循環(huán)后的穩(wěn)定性，樣本在-70 ℃冷凍保存穩(wěn)定，血漿樣品經(jīng)反復3次凍融循環(huán)后穩(wěn)定，提取后的血漿樣品在室溫放置24 h后穩(wěn)定，血漿樣品融化后放置于室溫2 h后再提取、進樣，該樣品穩(wěn)定，樣本在-70 ℃保存長期放置1個月穩(wěn)定。結果表明，在上述條件下，PJ90和PJ91保持穩(wěn)定(RE值在±15 %內)。

2 結果

2.1 平均血藥濃度-時間曲線 6只比格犬分別經(jīng)不同途徑給藥后，滴眼給藥血漿中未測到藥物濃度，口服給藥后，不同時刻PJ90和PJ91平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 單次口服給藥后PJ90和PJ91的平均血藥濃度-時間曲線

2.2 藥物動力學參數(shù) 氯替潑諾口服給藥后，對其非活性代謝物PJ90和PJ91進行了藥動學參數(shù)的進算，計算軟件為DAS 2.0，結果見表1。

3 討論

本研究檢測方法參考文獻[8-9]并加以改進。本實驗模擬臨床給藥方式，考察糖皮質激素類藥物氯替潑諾不同給藥途徑在比格犬體內的藥物動力學行為，為臨床用藥安全提供參考。

表1 單次口服給藥后PJ90和PJ91的主要藥動力學參數(shù)

文獻報道研究氯替潑諾犬體內的藥動學行為時，犬口服給予氯替潑諾5 mg/kg后，只測到了代謝物，濃度約為0～200 μg/L，而未測到原形藥物[9]。本實驗室已完成的氯替潑諾家兔眼內藥物動力學試驗[10]亦證實無法測得原形藥物，故本次實驗通過檢測代謝物PJ90和PJ91的血藥濃度來考察給藥后的安全性。犬給藥劑量定為5 mg/kg，由于所購比格犬體質量相當，均為10 kg左右，故將50 mg氯替潑諾填膠囊后，每犬給藥1粒(約相當于給藥5 mg/kg)，并保證給藥時膠囊完整。氯替潑諾為原位生效藥物，給藥后迅速代謝為無活性的代謝物，本實驗對氯替潑諾比格犬口服給藥后的代謝物PJ90和PJ91的濃度進行了測定，并計算了此兩種代謝物的藥動學參數(shù)，可作為參考。

滴眼給藥時，考慮到滴眼液可能會通過鼻淚管進入口腔，不排除通過鼻黏膜吸收入血及通過口腔口服后吸收的情況，故在滴眼給藥時按壓內眼角2 min，盡量避免藥物進入鼻淚管。

通過6只成年健康比格犬不同給藥途徑的藥物動力學試驗考察，氯替潑諾即使全身給藥(口服)后，比格犬體內的代謝物PJ90和PJ91血藥濃度依然很低，約為0～400 μg/L，可保證氯替潑諾臨床用藥的安全性。通過本試驗可證實，氯替潑諾雖然是糖皮質激素類藥物，但由于其原位生效的作用機制，即使在臨床上兒童給藥也是可以保證其安全性的。

[1] 梁四妥，張西寧，龐彥英，等.氯替潑諾聯(lián)合環(huán)孢素滴眼液治療干燥綜合征型干眼的療效觀察[J].眼科新進展，2014，34(11):1073-1076.

[2] 林靜，趙桂秋，高昂，等.依碳酸氯替潑諾與雙氯芬酸鈉滴眼液對季節(jié)性過敏性結膜炎療效比較[J].齊魯醫(yī)學雜志，2014，29 (2):127-128.

[3] 方曉珊，楊鴻昌，余杰克，等.氯替潑諾妥布霉素和妥布霉素地塞米松在超聲乳化吸除術后抗炎效果的比較[J].國際眼科雜志，2015，15(5):887-889.

[4] 曹芃，劉李平，練海東，等.妥布霉素地塞米松聯(lián)合氯替潑諾治療前葡萄膜炎的療效分析[J].國際眼科雜志，2011，11(9):1648-1649.

[5] 曾鳳，盧亞梅，周元清，等.氯替潑諾治療中重度干眼抗炎作用的臨床分析[J].中南醫(yī)學科學雜志，2013，41(5):486-489.

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[7] 藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則[EB/OL].[2014-05-13].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1616/101019.html.

[8] Yasueda S, Higashiyama M, Shirasaki Y, et al.An HPLC method to evaluate purity of a steroidal drug, loteprednol etabonate[J]. J Pharm Biomed Anal，2004，36(2):309-316.

[9] Hochhaus G, Chen LS, Ratka A, et al.Pharmacokinetic characterization and tissue distribution of the new glucocorticoid soft drugloteprednol etabonate in rats and dogs[J]. J Pharm Sci，1992，81(12):1210-1215.

[10]李紅霞，金鑫，劉冠.等.氯替潑諾滴眼劑兔眼內藥物動力學[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10(35):452-454.