楊國華 鄭圣斌 林彩鋒 黃若磊

結(jié)直腸癌發(fā)病率為惡性腫瘤第三位，病死率位居惡性腫瘤第四位，常見死亡原因?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中存在一群細(xì)胞表面表達(dá)CD133的亞組癌細(xì)胞，含有該組癌細(xì)胞的腫瘤組織其復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率明顯升高。外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)指外周循環(huán)血液中的腫瘤細(xì)胞，學(xué)者研究[1-2]發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量與病人預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，數(shù)量越多其預(yù)后越差。結(jié)直腸癌預(yù)后判斷一直是結(jié)直腸癌臨床研究熱點(diǎn)，本文擬對CD133聯(lián)合CTC兩因素在結(jié)直腸癌預(yù)后評估應(yīng)用的可行性作一研究。

資料與方法

一、一般資料

收集自2012年1月至2013年1月福建省立醫(yī)院胃腸外科及腫瘤外科132例結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本，年齡為(52.7±13.9)歲，年齡范圍為35～86歲。132例均行術(shù)前腸鏡及術(shù)后標(biāo)本病理證實(shí)，其中高分化29例，中分化72例，低分化31例；按美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南2016年第2版TNM分期Ⅰ期26例，Ⅱ期32例，Ⅲ期51例，Ⅳ期23例。

二、隨訪方法及內(nèi)容

采取病人門診隨訪及電話隨訪，術(shù)后前2年每3個月復(fù)查，第3年每半年復(fù)查，復(fù)查內(nèi)容：血常規(guī)、生化、癌胚抗原(CEA)、CTC，胸片、腹部B超；每半年復(fù)查全腹及胸部CT，每年復(fù)查腸鏡。

三、標(biāo)本組織中CD133測定

10%甲醛溶液固定新鮮組織標(biāo)本，連續(xù)薄切厚4 μm病理切片共3張，常規(guī)病理HE染色，采用ABC法行免疫組織化學(xué)病理染色。步驟如下：切片常規(guī)脫蠟后用梯度乙醇水化，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入一抗鼠抗人CD133單克隆(1∶40)，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后加入蘇木精復(fù)染，樹脂封片。參考文獻(xiàn)[3]標(biāo)準(zhǔn)：CD133陽性表達(dá)為境界清晰、突出于背景的棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜同時呈棕黃色亦為陽性。計分標(biāo)準(zhǔn)參照Hilbe等[4]的方法，隨機(jī)選取4個高倍視野約200個細(xì)胞，計數(shù)腫瘤細(xì)胞CD133陽性數(shù)，取三張陽性切片平均值作為計數(shù)結(jié)果，細(xì)胞數(shù)>10%為陽性，≤10%為陰性。

四、CTC測定

術(shù)前采外周血10 ml，置于50 ml離心管中1 500 r/min離心，后加入CS1血小板裂解液45 ml后再次離心，去除血清等上清至12 ml，搖勻加入CS2紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心去除上清，留下白細(xì)胞與特種細(xì)胞沉淀，加300 μl CS1搖勻沉淀細(xì)胞，加入磁微粒吸附離心，去除結(jié)合白細(xì)胞的磁微粒沉淀。再次離心去上清至100 μl，加CF1混勻細(xì)胞懸液涂片，置25℃～33℃無風(fēng)烘箱烘干。染色鑒定：將細(xì)胞干片加CF2固定液固定8 min后，浸泡SSC試劑10 min后，加入雜交探針，放入雜交儀雜交1.5 h后，取出浸泡43℃預(yù)熱后的甲酰胺試劑15 min，再次浸泡SSC試劑10 min，用BSA清洗標(biāo)本區(qū)后加入CD45孵育1 h后取出加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPA)染色，蓋上蓋玻片，放置4℃冰箱保存。最后使用熒光顯微鏡先在藍(lán)色通道下找到靶細(xì)胞層面，換到20倍物鏡，分別在三種通道(藍(lán)色、紅色、橙色或綠色)下觀看信號、細(xì)胞狀態(tài)、CD45著色等情況。CTC細(xì)胞表現(xiàn)為：單個細(xì)胞狀態(tài)，核質(zhì)均勻，未發(fā)現(xiàn)分層，細(xì)胞表面無或僅一顆結(jié)合白細(xì)胞磁微粒；紅色通道下未見CD45紅色，CD45陰性。橙色或綠色信號3個或3個以上，且在細(xì)胞核上。我們參考文獻(xiàn)[5]標(biāo)準(zhǔn)：CTC>3個/7.5 ml為高水平量(H-CTC)，≤3個/7.5 ml為低水平量(L-CTC)。

五、觀察指標(biāo)

觀察CD133、CTC與臨床病理各因素之間的關(guān)系，并進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)分為4個組，第1組為CD133陰性(CD133-)L-CTC，第2組為CD133-H-CTC，第3組為CD133陽性(CD133+)L-CTC，第4組為CD133+H-CTC，繪制各組的3年生存曲線。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、隨訪情況

本組完整隨訪了124例，失訪8例；隨訪病例中CD133-L-CTC共59例，CD133-H-CTC共21例，CD133+L-CTC共35例，CD133+H-CTC共9例。

二、臨床各因素與CD133、CTC之間的關(guān)系

CD133陽性組與CD133陰性組病人在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯等因素方面比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；而在結(jié)腸癌位置(P=0.755)、病人性別(P=0.069)、年齡(P=0.697)、腫瘤浸潤深度(P=0.231)、CEA水平(P=0.054)方面兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。CTC高水平量組與CTC低水平量組病人在腫瘤位置、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯等因素方面比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。(表1)

三、各組生存曲線關(guān)系

CD133-L-CTC組生存時間與CD133+L-CTC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.452)；但明顯高于CD133-H-CTC 組(P=0.037)及CD133+H-CTC

表1 臨床各因素與CD133、CTC之間的關(guān)系(例)

組(P<0.01)；CD133+L-CTC組生存時間明顯高于CD133-H-CTC組(P=0.042)及CD133+H-CTC組(P<0.01)；CD133-H-CTC組生存時間明顯高于CD133+H-CTC組，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)。(表2、圖1)

表2 各組生存時間及95%可信區(qū)間(d)

注：與CD133-L-CTC組比較，aP<0.05；與CD133-H-CTC組比較，bP<0.05；與CD133+L-CTC組比較，cP<0.05

四、CTC鏡下特征

CTC在鏡下表現(xiàn)：細(xì)胞呈單個細(xì)胞狀態(tài)，核質(zhì)均勻，紅色通道下未見CD45紅色，CD45陰性。橙色或綠色信號3個或3個以上，且在細(xì)胞核上。(圖2、3)

圖1 4組3年生存曲線圖

圖2 CTC在熒光顯微鏡(×40)鏡下表現(xiàn) A．CTC單個細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞核上呈3個橙色及1個綠色信號，核質(zhì)均勻，CD45陰性，未見紅色；B．CTC單個細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞核上呈3個橙色及2個綠色信號，核質(zhì)均勻，CD45陰性，未見紅色

圖3 CD133免疫組織化學(xué)染色切片(×20) CD133陽性表達(dá)為境界清晰、突出于背景的棕黃色(箭頭所示)，定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜

討 論

結(jié)直腸癌是全球腫瘤死亡的主要原因之一，其致死的主要原因?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，大約有15%～25%的病人就診時同時合并肝轉(zhuǎn)移，25%～50%在原發(fā)灶切除術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)：結(jié)直腸癌組織中CD133陽性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯明顯相關(guān)。這可能與CD133表達(dá)上調(diào)在結(jié)直腸癌中增高肝轉(zhuǎn)移率，其預(yù)后更差;學(xué)者研究表明對于結(jié)直腸癌CD133陽性干細(xì)胞樣細(xì)胞，它們與結(jié)直腸腫瘤的侵襲和分化呈正相關(guān)[8-11]。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD133陽性與陰性病人在術(shù)后3年內(nèi)二者生存曲線無明顯差異，但術(shù)后2年時CD133陽性病人其生存時間開始低于CD133陰性組，遠(yuǎn)期生存時間有待進(jìn)一步隨訪。

近年來國內(nèi)外學(xué)者從結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病人外周血發(fā)現(xiàn)CTC，血液中CTC的分子表征提供了替代或補(bǔ)充的非侵入性方法組織活檢[12-13]；CTC可作為結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移病人的獨(dú)立預(yù)后因素，CTC陽性組的總生存期及無病生存期明顯低于陰性組[14]。本研究結(jié)果表明：CTC數(shù)量與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腹膜種植、組織分化、神經(jīng)脈管侵犯呈明顯正相關(guān)，而上述幾個因素是結(jié)直腸癌術(shù)后預(yù)后不良主要因素[15]；本研究結(jié)果表明：CTC低水平量組其3年生存期明顯好于高水平量組，CD133-L-CTC組生存時間為(1 002.8±39.1) d，CD133+L-CTC-組為(980.5±38.8) d，明顯高于CD133-H-CTC組的(782.5±75.8) d及CD133+H-CTC組的(368.6±31.0) d，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明CTC高水平的結(jié)直腸癌預(yù)后差，其原因與上述結(jié)直腸癌預(yù)后不良因素相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，CTC還與腫瘤位置有關(guān)，左半結(jié)腸CTC水平明顯高于右半結(jié)腸，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這與臨床左半結(jié)腸癌預(yù)后明顯差于右半結(jié)腸相符，其具體分子機(jī)制目前尚不明，有待進(jìn)一步分子機(jī)制研究。

通過本研究表明，CD133聯(lián)合CTC可用于結(jié)直腸癌術(shù)后3年生存時間評估，CD133陰性且CTC低水平量組預(yù)后好，而CD133陽性且CTC高水平量組預(yù)后差。CD133可能與病人3年生存期無明顯相關(guān)，可能與遠(yuǎn)期生存時間有關(guān)；而CTC水平與病人近期生存時間明顯相關(guān)。其遠(yuǎn)期預(yù)后評估有待一步隨訪。

1 Rahbari NN, Aigner M, Thorlund K, et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology,2010,138:1714-1726.DOI:10.1053/j.gastro.2010.01.008.

2 Groot Koerkamp B, Rahbari NN,Buchler MW,et al.Circulating tumor cells and prognosis of patients with resectable colorectal liver metastases or widespread metastatic colorectal cancer: a meta-analysis. Ann Surg Oncol,2013,20:2156-2165.DOI:10.1245/s10434-013-2907-8.

3 Mia J,So YJ,Kim IU,et al.CD133 expression is not an independent prognostic factor in stage II and III colorectal cancer but may predict the better outcome in patients with adjuvant therapy.BMC cancer,2013,5:166-176.DOI: 10.1186/1471-2407-13-166.

4 Hilbe W,Dimhofer S,Oberwasserlechner F,et al.CD133 positive endothelial progenitor cells contribute to the tumour vasculature in non-small cell lung cancer.J Clin Pathol,2004,57:965-969.DOI:10.1136/jcp.2004.016444.

5 Matsusaka S,Suenaga M,Mishima Y,et al.Circulating tumor cells as a surrogate marker for determining response to chemotherapy in Japanese patients with metastatic colorectal cancer. Cancer Sci,2011,102:1188-1192.DOI:10.1111/j.1349-7006.2011.01926.

6 Jemal A,Bray F,Center MM,et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin,2011,61:69-90.DOI:10.3322/caac.20107.

7 Pawlik TM，Choti MA. Surgical therapy for colorectal metastases to the liver. Gastrointest Surg,2007,11:1057-1077.

8 Lim SH,Jang J,Park JO,et al. CD133-positive tumor cell content is a predictor of early recurrence in colorectal cancer.Gastrointest Oncol,2014,5:447-456. DOI: 10.3978/j.issn.2078-6891.2014.071.

9 Kishikawa J,Kazama S, Oba K,et al.CD133 Expression at the metastatic site predicts patients' outcome in colorectal cancer with synchronous liver metastasis.Ann Surg Oncol,2016,23:1916-1923.DOI:10.1245/s10434-016-5099-1.

10Kazama S,Kishikawa J,Yasuda K,et al.CD133 expression in lymph node metastases is associated with tumor aggressiveness during lymph node metastasis in colorectal cancer.Anticancer Res,2015,35:6599-6605.

11Chen S,Song X,Chen Z,et al.CD133 expression and the prognosis of colorectal cancer:a systematic review and meta-analysis.PLoS One,2013,8:e 56380.DOI:10.1371/journal.pone.0056380.

12Maheswaran S,Haber DA.Circulating tumor cells:a window into cancer biology and metastasis.Curr Opin Genet Dev,2010,20:96-99.DOI: 10.1016/j.ajpath.2010.12.003.

13Devriese LA,Voest EE,Beijnen JH,et al.Circulating tumor cells as pharmacodynamic biomarker in early clinical oncological trials.Cancer Treat Rev,2011,37:579-589.DOI:10.1016/j.ctrv.2011.04.006.

14Groot KB,Rahbari NN,Büchler MW,et al.Circulating tumor cells and prognosis of patients with resectable colorectal liver metastases or widespread metastatic colorectal cancer: a meta-analysis.Ann Surg Oncol,2013,20:2156-2165.DOI:10.1245/s10434-013-2907-8.

15Hinz S,Hendricks A,Wittig A,et al.Detection of circulating tumor cells with CK20 RT-PCR is an independent negative prognostic marker in colon cancer patients - a prospective study.BMC Cancer,2017,17:53-64.DOI:10.1186/s12885-016-3035-1.