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(濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250022)

目前被廣泛應(yīng)用的生防菌主要為芽孢桿菌，種類有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[1-2]、多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)[3]、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[4]、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)[5]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[6-7]、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等[8]，其中，生防芽孢桿菌抑制病害的機(jī)理主要為拮抗作用[9-10]。人們已從拮抗菌中提取出了多種抗菌物質(zhì), 有小分子的抗生素、蛋白性的抗菌物質(zhì)、多肽抗生素以及次生代謝產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)等[11]。

真菌的細(xì)胞壁主要由葡聚糖和幾丁質(zhì)構(gòu)成， 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶共同作用，可以破壞真菌菌絲體頂端細(xì)胞壁，使菌絲體頂端膨脹、破碎，最終死亡[12]。根據(jù)葡聚糖酶作用于糖苷鍵位點(diǎn)的不同，可分為β-1, 2、β-1, 3、β-1, 4、β-1, 6-葡聚糖酶。葡聚糖水解作用是由上述多種葡聚糖酶共同作用的結(jié)果。魏艷麗[13]等從巨大芽孢桿菌AP25中克隆了內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因。本文中以自行分離篩選得到的能夠產(chǎn)生β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因(glu)的天然芽孢桿菌S6為出發(fā)菌株，進(jìn)行g(shù)lu的克隆和序列分析，并在大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)中進(jìn)行表達(dá)，為開發(fā)高效的拮抗新產(chǎn)品提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　菌株和載體

菌株：BacillussubtilisS6，本實(shí)驗(yàn)室自主篩選；E.coliJM110和E.coliBL-21，本實(shí)驗(yàn)室保存；

載體：pGEM-T載體體系(帶有氨芐抗性)，天根生化科技(北京)有限公司；pET-21b(帶有氨芐抗性)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2　培養(yǎng)基及主要試劑

大腸桿菌液體培養(yǎng)基： 酵母粉5 g， 胰蛋白胨10 g， 氯化鈉10 g， 定容至1 000 mL， pH=7.0， 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

羧甲基纖維素培養(yǎng)基：羧甲基纖維素10 g，磷酸氫二鉀 1.87 g，檸檬酸1.252 g，瓊脂粉10～15 g，定容至1 000 mL，pH=7.0，121 ℃ 高壓蒸汽滅菌20 min。

瓊脂糖凝膠電泳： 稱取0.8 g瓊脂糖， 溶于100 mL電泳緩沖液， 混勻，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部溶解。

限制性內(nèi)切酶、 T4脫氧核糖核酸(DNA)連接酶，寶生物工程有限公司； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑，南京諾唯贊生物科技有限公司； 氨芐青霉素，國(guó)藥化學(xué)試劑公司； DNA分子量標(biāo)記物，北京博邁德公司； 蛋白分子量標(biāo)記物，北京天為時(shí)代公司； 回收試劑盒和β-半乳糖苷酶的顯色底物，Promega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，F(xiàn)ermentas公司。引物合成、測(cè)序工作，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成；其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.3　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

以芽孢桿菌S6基因組為模板，根據(jù)基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)登陸的β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因(登錄號(hào)為AP009484.1、 CP001982.1、 AE017355.1)同源性序列，設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物為上游序列(S-GLU-S02)：5’-ATGAAACGGTCAATCTCTAT-3’；下游序列(S-GLU-A02)：5’-CTAATTTGGTTCTGTTCCCC-3’。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性60 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)次數(shù)為35；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，使用北京博邁德瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段。

1.4　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因序列的測(cè)定和分析

將瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM110感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序。用SignalP3.0 Server 和TMHMM2.0在線軟件對(duì)基因序列及氨基酸序列進(jìn)行序列分析。

1.5　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因原核表達(dá)

以重組質(zhì)粒為模板，根據(jù)測(cè)序所得序列設(shè)計(jì)引物為上游序列(S-GLU-S03)：5’-GAATTCGCATATGAAACGGTC-3’；下游序列(S-GLU-A03)： 5’-CACCAAAGCTTCTAATTTGG-3’。將純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-21b分別用NdeI和HindIII雙酶切后進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coliBL21中， 挑取單菌落37 ℃培養(yǎng)至光密度(optical density，OD)值為0.6左右， 加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)至終質(zhì)量濃度為100 mg/L， 37 ℃培養(yǎng)3 h，收集菌體、裂解，以未誘導(dǎo)的菌體裂解液做對(duì)照，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析內(nèi)切葡聚糖酶基因的表達(dá)。

1.6　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因功能鑒定

將轉(zhuǎn)入pET-21b-glu質(zhì)粒的BL-21菌株經(jīng)誘導(dǎo)后點(diǎn)接在羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)約2 h；在平板中加入1 mL(質(zhì)量濃度為1 g/L)的剛果紅溶液染色20 min，倒去染色液并用氫氧化鈉NaOH(濃度為1 mol/L)溶液沖洗，去掉表面附著的剛果紅，觀察是否出現(xiàn)透明水解圈。

2　結(jié)果與分析

2.1　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因的PCR擴(kuò)增

以芽孢桿菌S6基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得大小約1 500 bp的條帶(見(jiàn)圖1)，與預(yù)期的內(nèi)切葡聚糖酶基因大小一致。

M為200 bp蛋白分子量標(biāo)記物；1為PCR產(chǎn)物。圖1　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增芽孢桿菌S6基因組上的glu基因

2.2　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因序列的測(cè)定和分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)T載體克隆后驗(yàn)證并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析得到1 500 bp含有完整閱讀框的基因序列，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，初步確定該序列為內(nèi)切葡聚糖酶基因全長(zhǎng)序列，并于GenBank上注冊(cè)，GenBank登錄號(hào)為HQ650233。

分別將1 500 bp閱讀框架及其編碼產(chǎn)物在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)(見(jiàn)表1)和氨基酸序列比對(duì)(見(jiàn)表2)。芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因與Bacilluslicheniformiscellulase內(nèi)切葡聚糖酶基因具有98%相似，而與不同屬的PaenibacilluspolymyxaCel5A的僅有69%的一致性。說(shuō)明內(nèi)切葡聚糖酶基因在同屬菌株中序列相似性很高，進(jìn)化保守；而不同屬間的相似性低，進(jìn)化趨異。

2.3　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用SignalP3.0 Server在線軟件對(duì)芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶氨基酸序列中的信號(hào)肽序列進(jìn)行了分析， 結(jié)果如圖2所示。 用TMHMM2.0在線軟件對(duì)芽孢桿菌S6glu氨基酸序列中可能的跨膜區(qū)段進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。 芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶氨基酸序列第1—29氨基酸具有明顯的信號(hào)肽序列信號(hào)， 蛋白的成熟位點(diǎn)在第29、 30的氨基酸殘基之間， 第1—30氨基酸為跨膜螺旋信號(hào)， 初步推測(cè)第1—30個(gè)氨基酸序列是芽孢桿菌S6glu的信號(hào)肽序列。

表1　芽孢桿菌S6 β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因的序列對(duì)比分析結(jié)果

表2　芽孢桿菌S6 β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶的序列對(duì)比分析結(jié)果

圖2　芽孢桿菌S6 glu 信號(hào)肽序列分析結(jié)果

圖3　芽孢桿菌S6 glu跨膜螺旋信號(hào)分析結(jié)果

2.4　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因原核表達(dá)

將構(gòu)建好的表達(dá)載體進(jìn)行NdeⅠ和EcoRⅠ酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到大小約為1 500 bp的條帶，與預(yù)期的酶切條帶大小相符(見(jiàn)圖4)。將該重組質(zhì)粒進(jìn)一步測(cè)序，通過(guò)測(cè)序結(jié)果得知構(gòu)建完成pET-21b-glu表達(dá)載體，同時(shí)擁有正確的閱讀框。將含有pET-21b-glu重組質(zhì)粒的E.coliBL21菌株，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)之后，以未誘導(dǎo)的E.coliBL21菌株作為對(duì)照，通過(guò)聚丙烯酰氨凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在分子量約50 ku處有明顯的表達(dá)條帶，是內(nèi)切葡聚糖酶基因蛋白表達(dá)的產(chǎn)物，對(duì)照在該位置未出現(xiàn)明顯的表達(dá)條帶(見(jiàn)圖5)，表明了表達(dá)載體pET-21b-glu在E.coliBL21菌株中成功表達(dá)。

M為1 kb蛋白分子量標(biāo)記物；1為pET-21b-glu質(zhì)粒；2為NdeⅠ、Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒pET-21b-glu；3為菌落PCR。圖4　pET-21b-glu質(zhì)粒雙酶切與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)電泳結(jié)果

M為即時(shí)可用的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物MW,ku；1—3為GLU誘導(dǎo)表達(dá)；4—5為對(duì)照。圖5　聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)

2.5　芽孢桿菌S6內(nèi)切葡聚糖酶基因功能的鑒定

將轉(zhuǎn)入pET-21b-glu質(zhì)粒的BL-21菌株經(jīng)誘導(dǎo)后點(diǎn)接在羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 h，經(jīng)剛果紅染色，觀察到該菌株產(chǎn)生明顯的內(nèi)切葡聚糖酶水解圈，見(jiàn)圖6。

圖6　β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶活檢測(cè)

3　結(jié)果與討論

芽孢桿菌S6是本實(shí)驗(yàn)室從采集自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所黃萎病、 枯萎病發(fā)病較輕的試驗(yàn)棉田的根圍土中分離出的， 是一種對(duì)棉花黃萎病、 枯萎病病菌具有明顯拮抗作用的芽孢桿菌。 用同源克隆的方法獲得了芽孢桿菌S6的β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因。 基因序列分析該基因讀碼框?yàn)? 500 bp， 編碼499個(gè)氨基酸。陳惠等[14]將外源的內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌WH320中，獲得有效表達(dá)。本文中首次從本實(shí)驗(yàn)室具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效拮抗菌芽孢桿菌S6中獲得β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因。

真菌細(xì)胞壁主要由葡聚糖和幾丁質(zhì)構(gòu)成，根據(jù)葡聚糖酶作用于葡聚糖的位點(diǎn)不同，可以將葡聚糖酶分為β-1, 3-葡聚糖酶、β-1, 4-葡聚糖酶等。葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶共同作用，可以破壞真菌菌絲體頂端細(xì)胞壁，使菌絲體頂端膨脹、破碎，最終使病原菌生長(zhǎng)受阻或細(xì)胞死亡,阻止病害的發(fā)生和發(fā)展。Hong等[15]報(bào)道，一株類芽孢桿菌產(chǎn)生的β-1, 3-葡聚糖酶能破壞植物病原真菌瓜果腐霉菌和立枯絲核菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。 本文中從芽孢桿菌S6中克隆得到的內(nèi)切葡聚糖酶基因?yàn)榕c枯草芽孢桿菌C-36的β-1, 4-葡聚糖酶的基因具有99%的相似性。 通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體， 將其轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL-21中進(jìn)行g(shù)lu原核表達(dá)檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌S6的β-1, 4-葡聚糖酶基因表達(dá)產(chǎn)物為分子量約50 ku的蛋白。 通過(guò)對(duì)β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌S6的β-1, 4-葡聚糖酶基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)并且具有顯著的酶活性。目前，正在進(jìn)行幾丁質(zhì)酶基因的克隆，將幾丁質(zhì)酶基因和β-1, 4-葡聚糖酶基因共同構(gòu)建植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染作物，以期獲得多功能的抗性植株。