陽小胡，孫 鏖，賈杏林，朱立軍，蔣桂韜，燕海峰，3*

(1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院, 湖南 長沙 410125；3.湖南佳牛牧業(yè)科技有限公司，湖南 長沙410131)

甘油細管冷凍是兩類主要的精液冷凍技術(shù)之一[1-4]，甘油作為冷凍保護劑的濃度研究較多，一般都超過了8%(v/v)，最常用為11%[5-7]。 研究表明，低濃度的甘油作為雞精液冷凍保護劑，解凍后精子活力與活率隨著濃度的降低而降低，但受精率卻在一定濃度范圍內(nèi)有所升高[4-5,8]；甘油濃度分別為4%、6%、7%、8%時的受精率相差不大，在23%～30%之間[5]；使用13%甘油凍精解凍后活力和復蘇率均顯著高于10%和15%，且極顯著高于4%和7%[9]，說明不同研究得出的合適甘油濃度不一定相同。

冷凍速率也是精液冷凍技術(shù)的關(guān)鍵步驟，主要包括程序冷凍儀(控制樣品室中噴入的液氮量)[4-5]與液氮熏蒸(控制樣品離液氮面的高度)來實現(xiàn)，后者因裝置簡單廉價而被廣泛采用。冷凍速率主要是一步[10-12]與兩步冷凍法(5～-35 ℃慢速冷凍與-35～-150 ℃快速冷凍)[4-5,13]。

液氮熏蒸技術(shù)方面，大部分采用一步冷凍法，用聚苯乙烯泡沫箱將0.5 mL甘油(濃度為11%)細管精液放入液氮面6.4 cm處熏蒸10 min(-10 ℃/min)后浸入液氮，通過輸卵管手術(shù)輸精后收集2～8 d種蛋獲得了69%～77%受精率。

Rakha等[10]、Han等[11]和Blanco等[12]分別對二甲基亞砜、20%甘油和肉毒堿對雞精液冷凍效果進行了研究。但是以上研究主要采用單因素分析法，無論是甘油濃度、冷凍速率還是其它因素，優(yōu)化出的結(jié)論差異較大。不同品種或個體在特定的冷凍方法與條件下，適合特定的甘油濃度、冷凍和解凍方法[5,8,10,14-15]，甘油濃度、冷凍速率、雞品種等多個關(guān)鍵步驟之間還很有可能存在互作關(guān)系，這也許就是精液冷凍技術(shù)不穩(wěn)定的原因。本試驗用不同甘油濃度、冷凍速率與母雞品種，液氮熏蒸技術(shù)(發(fā)明專利ZL201210105884.8)對雞細管精液冷凍技術(shù)進行研究，為其推廣應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

公雞為黑絲羽烏骨雞，母雞為白萊航與伊薩雞，由湖南省畜牧獸醫(yī)研究所飼養(yǎng)。其它試驗材料等同文獻[11]。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 濃度與冷凍速率及其互作對甘油細管凍精活力影響 試驗采用5×9 (甘油濃度×冷凍速率)的隨機化試驗設(shè)計，2%、4%、6%、8%、11% 等5組甘油濃度水平，冷凍速率分為1～9組9個冷凍速率水平(水平鋪放1～9高度處細管，間隔1 cm)，以解凍后精子活力為判斷指標進行分析，試驗重復3次，設(shè)3個平行樣。

1.2.2 不同甘油濃度凍精以及母雞品種對孵化效果影響 將同濃度2～8高度處細管凍精解凍后混合，記錄解凍后活力、離心去甘油后活力，以及輸精后的孵化效果進行比較。4%、6%、8%、11%甘油濃度組采用80只(每組20只)30周齡白萊航母雞，連續(xù)重復冷凍試驗并輸精7次。

在以上試驗結(jié)束后，2%甘油濃度組采用90只母雞(60只30周齡白萊航母雞和30只20周齡伊莎母雞)，連續(xù)重復冷凍試驗并輸精2次。其中，白萊航雞數(shù)據(jù)部分納入4%～11%組進行統(tǒng)計，得出同品種不同濃度甘油對孵化效果影響的數(shù)據(jù)；其中萊航雞與伊薩雞數(shù)據(jù)，用于比較相同公雞與甘油濃度，不同品種母雞對孵化效果影響的結(jié)論。

1.3 試驗方法

1.3.1 稀釋液的配制 3種稀釋液分別為YD1、YD2與YD3(見表1)，分別用于稀釋、離心、冷凍，離心后沉淀重懸用YD1液。稀釋液的pH在7.0～7.4，滲透壓在380～420 mOsm/kg。過濾滅菌，-20 ℃保存，其中YD3液中的甘油在使用前添加。

表1 3 種稀釋液溶質(zhì)成份表Table 1 The solute composition table of three kinds of dilutions

1.3.2 精液的采集、稀釋與活力檢測 解凍YD1(20 mL)、YD2(30 mL)與YD3(10 mL)液，根據(jù)甘油終濃度分別為2%、4%、6%、8%、11%，配制好濃度分別為4%、8%、12%、16%、22%的YD3稀釋液，存于5 ℃。

采用背腹部按摩雙人采精法，用5 mL離心管采集4 mL精液后，分裝到2個10 mL離心管中，按原精與YD1液1∶1比例進行等溫稀釋，存于5 ℃保溫箱中盡快帶回實驗室。取12 μL精液在32 ℃恒溫板液晶顯示屏顯微鏡(物鏡20×)下，按9級活力等級標準，活力低于0.7的精液不采用。檢查完活力后于5 ℃冰箱中平衡30 min。

1.3.3 甘油的添加 將2管稀釋后的精液分裝在5個5 mL離心管中，每管2 mL，分別添加2 mL (1∶1)濃度為4%、8%、12%、16%、22%的 YD3液，得到甘油終濃度分別為2%、4%、6%、8%、11%，存于5 ℃平衡10 min。

1.3.4 甘油細管凍精制作 將在5 ℃平衡后的精液搖勻，把細管遠離棉塞的一端插入，輕輕吸精液至9/10體積(4 mL精液可做0.25 mL細管約16支)。再將遠離棉塞的一端輕輕插入封口粉中數(shù)次，直到細管中進入約3 mm高度的粉末。采用專利簡易便攜式冷凍器，將細管置入細管架的1～9高度處(每高度間隔為1 cm)。選用保溫與密封性較好的液氮容器，每次試驗倒入液面離箱底高度為7 cm左右的液氮。

1.3.5 細管精液的冷凍、解凍與活力檢測 兩步法冷凍：第1步為細管架底部距離液氮面17 cm處熏蒸4 min(冷凍速率約為-14～-9 ℃/min)；第2步用15 s 時間將細管架緩慢降落到液氮表面，浮在液氮面熏蒸2 min (冷凍速率約為-60～-25 ℃/min)，再浸入液氮。一段時間后，將細管從液氮里拿出，快速浸入5 ℃的水中，解凍3 min，檢測解凍后精子活力。

1.3.6 去甘油及活力檢測 解凍后的樣品放于5 ℃冷藏箱中，按解凍后精液和YD2液比例為1∶2(v/v)，分6次添加，每次加入稀釋液間隔時間為2 min，如解凍后精液體積為1 mL，則加入稀釋液的體積依次為35 μL(1∶0.035)、90 μL(1∶0.09)、165 μL(1∶0.165)、300 μL(1∶0.3)、620 μL(1∶0.62)和790 μL(1∶0.79)，所添加的YD2液總體積為2 mL。經(jīng)以上步驟處理的精液以600×g在5 ℃的冷凍離心機上離心10 min，棄上清；添加解凍后精液等體積的YD1液重懸沉淀，檢測活力。樣品存放于5 ℃冷藏箱中，30 min內(nèi)進行人工輸精。

1.3.7 解凍精液輸精效果檢測 用左手擠壓母雞泄殖腔露出同心圓后，用1 mL去針頭注射器慢慢旋轉(zhuǎn)進入雞陰道約4 cm后松開左手，每只母雞輸精量約為4.0×108個精子，每72 h輸1次，首次輸精后第3天開始撿蛋，最后1次輸精后第6天停止撿蛋，每3 d入孵1批，孵化至第7天檢測受精率，孵化21 d統(tǒng)計入孵蛋出雛率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件處理后，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與顯著性檢驗。使用一般線性模型(GLM)進行兩因子單變量方差分析，主效應包括甘油濃度、冷凍速率及二者間的交互效應，以P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。用Duncan's 法進行多重比較，試驗結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同甘油濃度凍精解凍后的活力

以甘油濃度為主效應，濃度最低的2%組，各高度均顯著低于其它各濃度組(P<0.05)，而11%濃度組，則在各高度均顯著高于2%～6%濃度組(P<0.05)，8%～11%各組間差異不顯著(P>0.05)，11%組效果最優(yōu)(表2)。

2.2 不同高度凍精解凍后的活力

以冷凍高度(冷凍速率)作為主效應，發(fā)現(xiàn)高度不能太高也不能太低，尤其是在甘油濃度較低時更明顯，如2%濃度組，第1～5高度、第9高度沒有顯著差異，顯著低于6～8高度的(P<0.05)，6～8高度之間差異不顯著(P>0.05)，綜合來看，第6高度效果最佳(表2)。

甘油濃度-冷凍速率對雞細管精液冷凍效果有非常強的交互作用，甘油濃度-冷凍速率交互作用下“濃度”、“速率”、“濃度-速率”對活力有極顯著的影響(P<0.01)。濃度越低對冷凍高度越敏感，濃度最低的2%組，6個高度顯著低于較好的3個高度(6～8)(P<0.05)；濃度越高，對冷凍高度的適應性越寬，濃度最高的11%組，各組高度的活力均很好，沒有顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同甘油濃度凍精解凍后的活力(n=3)Table 2 The motility of thawed semen frozen by different glycerol concentration (n=3)

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: The different lowercase superscripts in the same column mean significant difference (P<0.05), otherwise means no significant difference (P>0.05).

2.3 不同甘油濃度凍精解凍后及去甘油后活力

就整體趨勢而言，去甘油前活力與去甘油后活力成正相關(guān)，但6%組去甘油前其與4%、8%、11%組的精子活力無顯著差異(P>0.05)，但去甘油后與4%、8%組有顯著差異(P<0.05)。去甘油后比去甘油前，精子活力下降基本超過50%(表3)。

2.4 不同甘油濃度對凍精受精率及出雛率的影響

從表4可知，6%甘油濃度組的受精率最高，與4%、8%組差異不顯著(P>0.05)；2%組的最低，與其它各組有顯著性差異(P<0.05)；4%、6%、8%組之間無顯著性差異(P>0.05)；11%組顯著低于4%、6%、8%組(P<0.05)，但出雛率與8%組無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同甘油濃度組去甘油前后精子活力(n=7)Table 3 The sperm motility before and after glycerol removal in different glycerin concentration groups (n=7)

注：同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: The different lowercase superscripts in the same row means significant differences (P<0.05), otherwise means no significant difference (P>0.05).

表4 不同甘油濃度對凍精孵化效果的影響Table 4 The hatchability of thawed semen frozen by different glycerol concentration

2.5 不同甘油濃度對凍精最后一次輸精后受精率的影響

由圖1可見，連續(xù)輸精最后一次輸精后的第2～11天撿蛋，各濃度組受精率呈逐漸下降趨勢，但也有例外的時間點。4%、8%、11%濃度組，均為第3天受精率最高(分別為94.12%、93.75%、85%)，到第11天受精率最低(分別為31.58%、23.08%、18.52%)。6%濃度組第5天受精率最高(71.43%)，到第11天受精率最低(為12.50%)。整體而言，6%濃度組的受精率要低于其它組。

2.6 2%甘油濃度對不同品種母雞的受精率與出雛率的影響

用黑絲羽烏骨雞凍精對白萊航雞和伊薩雞母雞進行人工輸精，受精率和出雛率都無顯著性差異(P>0.05)，白萊航雞略高于伊薩雞(表5)。

圖1 不同甘油濃度凍精連續(xù)輸精后最后一次輸精的受精率Fig. 1 The hatchability of thawed semen frozen bydifferent glycerol concentrations and theeggs were collected after the last insemination

3 討 論

3.1 甘油濃度對雞凍精效果的影響

本試驗采用從2%增加到11%甘油濃度做細管精液，解凍精子活力逐漸升高，體現(xiàn)出了這種保護作用，但受精率最高的卻不是濃度最高組，其中4%～6%甘油的受精率都比較高，而濃度在8%以上則都變差，這與國內(nèi)外報道一致[4-5，9]，原因可能是甘油濃度越大，盡管在冷凍損傷方面保護效果好，但由于甘油的添加與去除會在極短時間段內(nèi)導致精子環(huán)境的滲透壓發(fā)生巨大的變化，雖然采用了分步并間隔一定時間添加清洗液來減少這種傷害，減緩精細胞內(nèi)進入水分子的速度，但甘油濃度越大對精細胞膜和各細胞器的物理損傷也越大，所以受精能力可能會變差。

表5 2%甘油濃度凍精對伊薩和白萊航雞的受精率和出雛率的影響Table 5 The hatchability of Issa and White Leghorn hens inseminated with thawed semen frozen with 2% glycerol concentration

本研究中，去甘油中稀釋清洗比例為1∶2，在11%甘油濃度基礎(chǔ)上優(yōu)化出來，而稀釋清洗的最佳比例也可能隨著甘油濃度變化而變化，不同甘油濃度的最佳清洗比例還有待進一步研究。本研究4%甘油濃度組在最后一次輸精后的2～11 d的受精率最高，而在各濃度連續(xù)多次輸精情況下卻是6%濃度組受精率最高，二者不一致，原因還有待進一步研究。由于試驗母雞數(shù)量有限，本研究首先設(shè)計了4%～10%甘油濃度組，后來又單獨進行了2%濃度組的試驗，但從數(shù)字上看2%濃度組受精率最低，一方面可能是濃度低于一個下限，對精子保護作用就會很弱，另一方面2%甘油組是在其它4組試驗結(jié)束后進行，母雞年齡變大，且只進行了連續(xù)2次輸精，如果條件與其它4組一樣，受精率可能會更高。

雞精液冷凍損傷的判定依據(jù)主要是形態(tài)結(jié)構(gòu)、DNA完整性、活力與孵化率等指標。掃描電鏡和透射電鏡觀察精子冷凍前后的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，鮮精的頂體完整、邊緣整齊、輪廓清楚，頂體膜、質(zhì)膜表面平滑，冷凍精子解凍后雖然還有0.8以上的活力，但是有正常形態(tài)、正常超微結(jié)構(gòu)的精子分別只有鮮精的14.3%和12.5%[9]，但該結(jié)論是在沒有去掉甘油的情況下得出的，因此這些損傷可能不僅僅是冷凍所致，也可能是沒有去掉甘油的原因，同時也說明在甘油作為冷凍保護劑時，不能僅憑活力作為篩選條件，要考慮去甘油后活力和受精率。由于精子冷凍步驟優(yōu)化牽涉的檢測工作量非常大，同時活力與孵化指標始終是兩個最實用的評價參數(shù)，本研究將二者相結(jié)合，前者作為實驗室的評價方法，后者作為生產(chǎn)實踐的檢測指標，也是最有說服力的指標，取得了良好效果。

3.2 雞甘油細管精液冷凍速率與甘油濃度的相關(guān)性分析

對于冷凍速率與冷凍保護劑濃度的優(yōu)化，一般采用單因素分析，先固定一個因素，再優(yōu)化另一個。在禽類甘油細管精液冷凍領(lǐng)域，還未檢索到甘油濃度與冷凍速率等多因素試驗設(shè)計分析互作效應的報道。由于本文采用了專利技術(shù)，即利用了離液氮面不同距離熏蒸具有不同冷凍速率的原理，以及細管水平多個高度鋪放架結(jié)構(gòu)，在一批樣品冷凍時，同一冷凍室能夠獲得不同冷凍速率的功能，實現(xiàn)了冷凍速率與其它參數(shù)互作效應的研究分析。

本研究采用了前期篩選出的兩步冷凍法(液氮面17 cm處熏蒸4 min，細管架浮在液氮表面2 min)，得到了很好的效果，并發(fā)現(xiàn)甘油濃度-冷凍速率交互作用下“濃度”、“速率”、“濃度-速率”對活力有極顯著的影響，為今后冷凍速率與其它影響因素的互作關(guān)系，以及針對特異性的品種與冷凍條件篩選冷凍方案提供了新思路。

3.3 不同雞品種對凍精受精率的影響

國內(nèi)外雞凍精受精率報道差異很大，因為很多試驗條件不同，公雞母雞品種不一樣，凍精輸精時可能存在某些母雞在輸卵管保留精子較其它個體強，有些公雞精液的抗凍能力較強，最適甘油濃度等都可能不一樣[10，14]；冷凍時由于不同品種和家系精子的理化性質(zhì)有很大的不同，所以在家禽能夠獲得較好效果的冷凍方法在野生品種上不一定能夠獲得成功，精子在稀釋、冷藏降溫、平衡和冷凍過程中，對低溫的耐受力因品種的不同而有很大的差異[15]；輸精量和間隔時間不一樣，連續(xù)輸精次數(shù)、輸精后撿蛋的天數(shù)以及孵化條件都不一樣[5]，甚至很多報導的是一次輸精的結(jié)果[10]。

本試驗獲得近幾年雞甘油細管精液冷凍報道的最高受精率，一方面可能是在本研究以及前期技術(shù)上的改進[13]，另一方面也可能是黑絲羽烏骨雞公雞的精子有較好的抗凍性，同時該結(jié)果是6%甘油濃度在泡沫架2～8高度所有細管的結(jié)果，如果只采用冷凍速率的最佳值，那么可能受精率會更高。此外，本研究一次輸精與連續(xù)多次輸精結(jié)果的趨勢不一樣，受精率和出雛率的方差還比較大等問題，還需要擴大母雞群體，設(shè)計鮮精對照組等來深入研究冷凍技術(shù)、輸精技術(shù)、雞品種或個體差異等因素究竟是哪些導致了目前雞精液冷凍的不穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

通過黑絲羽烏骨雞0.25 mL細管精液冷凍，兩步液氮熏蒸法，從凍精活力判斷甘油濃度與冷凍速率對雞細管精液冷凍效果存在極顯著互作關(guān)系，其最佳組合為11%濃度甘油+泡沫架第6高度；6%甘油濃度組獲得高于近年來國內(nèi)外文獻報導的最高受精率；公雞用黑絲羽烏骨雞，母雞用白來航雞與伊莎蛋雞，冷凍精液受精率沒有顯著差異。本研究為冷凍速率與其它影響因素的互作關(guān)系研究，以及針對特異性的品種與試驗條件篩選冷凍方案提供了技術(shù)支撐。

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