范鴻儒，楊繼紅，王萌，杜俊杰,方芳

(北京大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院 北京醫(yī)院 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心,a 腎內(nèi)科，b檢驗(yàn)科，c 病理科，北京 100730)

·基礎(chǔ)研究·

雷公藤甲素延緩糖尿病腎病進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究

范鴻儒a，楊繼紅a，王萌b，杜俊杰a,方芳c

(北京大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院 北京醫(yī)院 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心,a 腎內(nèi)科，b檢驗(yàn)科，c 病理科，北京 100730)

[摘要]目的初步探討雷公藤甲素對(duì)C57BL/6-Ins2Akita小鼠的安全劑量和延緩糖尿病腎病的作用效果。方法選擇8周齡雄性C57BL/6-Ins2Akita小鼠和C57BL/6J野生鼠，每4周檢測(cè)體血糖和體質(zhì)量，每8周收集24 h尿液和血液，檢測(cè)和對(duì)比糖尿病腎病相關(guān)指標(biāo)，確定C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病的評(píng)估和形成時(shí)機(jī)。另取8周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠以100、200、400、800 μg·kg-1·d-1分成4個(gè)劑量組灌胃14 d，觀察急性毒性反應(yīng)，通過(guò)改良寇氏法計(jì)算LD50。以25、50、100 μg·kg-1·d-1這3個(gè)劑量干預(yù)24周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠，并設(shè)置空白對(duì)照組和野生型對(duì)照組，干預(yù)8周，期間收集尿液檢測(cè)24 h尿蛋白排泄率，處死后收集血液檢測(cè)肌酐、尿素氮、血清清蛋白等指標(biāo)，組織取材進(jìn)行病理檢查。結(jié)果C57BL/6-Ins2Akita小鼠的24 h尿蛋白排泄率、血糖、三酰甘油在8周齡開(kāi)始即高于C57BL/6J野生型小鼠(P<0.05)，血清蛋白低于C57BL/6J野生型小鼠(P<0.05)，且隨周齡增加差距逐漸明顯，但肌酐未出現(xiàn)升高趨勢(shì)。急性毒性實(shí)驗(yàn)中改良寇氏法計(jì)算LD50值為356.45 μg·kg-1·d-1。雷公藤甲素干預(yù)高、中、低劑量組的24 h尿清蛋白排泄率均較對(duì)照降低，其中高劑量組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨蛋白尿的減少，血清清蛋白水平得到提高，HDG組較CON組血清清蛋白水平提高約2.5 g/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)于體質(zhì)量、24 h尿量、腎臟重量、血糖、血肌酐、尿素氮、三酰甘油、膽固醇等指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此同時(shí)，病理檢查發(fā)現(xiàn)高劑量組的系膜面積/毛細(xì)血管襻面積和腎小球系膜擴(kuò)張比例均明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，中、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論100 μg·kg-1·d-1的雷公藤甲素可減少C57BL/6-Ins2Akita小鼠的蛋白尿，提高血清蛋白水平，減少系膜區(qū)系膜基質(zhì)的聚積，增大劑量可能引起毒性反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]糖尿病腎??；雷公藤屬；疾病惡化；治療結(jié)果；疾病模型,動(dòng)物

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。預(yù)測(cè)2030年全球糖尿病的發(fā)病率將上升到7.7%[1-2]，糖尿病患者將達(dá)43 900萬(wàn)，其中大約1/3會(huì)發(fā)展為DN。及早預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)生，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展從而減少終末期腎病患者，是重大公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題。

DN 的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，高血糖及糖基化終末產(chǎn)物、高血流動(dòng)力學(xué)改變及脂肪代謝紊亂是DN病變的重要啟動(dòng)因子[3]；但是，多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)、趨化因子和生長(zhǎng)因子等也可能單獨(dú)或作為上述機(jī)制的下游環(huán)節(jié)在糖尿病腎病的發(fā)展中發(fā)揮作用[4-5]。盡管經(jīng)過(guò)使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素受體阻滯劑(ARB)、調(diào)脂藥物、抗血小板聚集等藥物，糖尿病腎病的治療效果有一定提高，但糖尿病腎病的治療沒(méi)有根本性的突破。

雷公藤是我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲(chóng)止血等功效。雷公藤多苷具有明顯的抗炎作用、阻斷5-羥色胺及前列腺素E2的產(chǎn)生，對(duì)急性滲出性和慢性增生性炎癥均有抑制作用[6-7]。能減少抗原抗體復(fù)合物沉積，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，抑制多種細(xì)胞因子產(chǎn)生和表達(dá)，從而抑制腎小球系膜細(xì)胞增生，減少尿蛋白的排出，緩解腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[8-9]。由于雷公藤多苷對(duì)血糖影響較小，免疫抑制作用相對(duì)溫和，國(guó)內(nèi)有不少學(xué)者應(yīng)用雷公藤多苷治療糖尿病腎病[10]，但研究都不夠深入。臨床上，雷公藤多苷引起肝功能損傷、腎功能下降，副作用不可小覷，糖尿病腎病患者處于哪個(gè)階段、多大劑量能夠獲益，減少蛋白尿和降低肌酐的效果是不是可以同時(shí)獲得等都是臨床上面臨的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。雷公藤多苷對(duì)于糖尿病腎病的干預(yù)時(shí)機(jī)和機(jī)制都值得進(jìn)一步深入研究。目前用研究的雷公藤制劑主要包括雷公藤多苷、雷公藤甲素(TP)和雷公藤紅素，雷公藤甲素是雷公藤多苷的主要作用成分，其純化物效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多種組分的雷公藤多苷，本研究選用雷公藤多苷為研究藥物，觀察和研究其在C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病模型中的干預(yù)時(shí)機(jī)、安全性和治療作用。

1 動(dòng)物與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) 2016年6月從美國(guó) Jackson Laboratory (Bar Harbor,ME)購(gòu)入10只C57BL/6-Ins2Akita基因突變雄性小鼠和40只C57BL/6野生型雌性小鼠，動(dòng)物許可證號(hào):AA1116000103。在中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所無(wú)特定病原(SPF)級(jí)動(dòng)物房檢疫1月合格后飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行配對(duì)繁殖和實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室溫度(22±1)°C，相對(duì)濕度65%～70%，12 h交替照明，飼養(yǎng)密度為2～3 只/籠(籠尺寸：30 cm×18 cm×16 cm)。自由飲食攝水，顆粒飼料喂養(yǎng)，飼料含粗蛋白24%,脂肪8%,葡萄糖20%,淀粉57%,能量16 000 kJ/kg。由于C57BL/6-Ins2Akita雌性小鼠的糖尿病腎病進(jìn)展緩慢和發(fā)展不均一，選擇雄性小鼠作為研究對(duì)象[11]。C57BL/6-Ins2Akita基因突變雄鼠和C57BL/6野生型雌鼠按照1∶2配對(duì)合籠，子鼠經(jīng)基因檢驗(yàn)確定是否為突變型，實(shí)驗(yàn)用鼠均為子一代。

1.2 主要儀器與試劑 雷公藤甲素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號(hào)：140726，經(jīng)HPLC檢驗(yàn)純度>99%，每10毫克藥品使用1 mL二甲基亞砜(DMSO)充分溶解后，用0.9%氯化鈉注射溶液配成相應(yīng)濃度。血糖儀(德國(guó)Bayer公司);小鼠無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)儀(美國(guó)Hatteras公司);生化檢測(cè)儀(日本Toshiba公司);小鼠尿清蛋白試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司);二甲基亞砜(美國(guó)Amresco公司)。

1.3 方法

1.3.1 C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病的評(píng)估 8周齡雄性C57BL/6-Ins2Akita小鼠和雄性C57BL/6J小鼠各8只,每4周代謝籠收集24 h尿液檢測(cè)尿微量清蛋白，眶后靜脈叢采血測(cè)定血糖、血清清蛋白、三酰甘油、膽固醇、肌酐、尿素氮。24周齡時(shí)處死小鼠，留取血液檢測(cè)上述指標(biāo)，取腎臟行病理檢查。通過(guò)上述指標(biāo)的對(duì)比，對(duì)C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病模型進(jìn)行評(píng)估以及確定雷公藤甲素干預(yù)的時(shí)機(jī)。

1.3.2 雷公藤甲素給藥14 d急性毒性實(shí)驗(yàn) 8周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠雌雄各12只，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為4組，每組6只，雌雄各半，四組分別按照100、200、400、800 μg·kg-1·d-1劑量給予雷公藤甲素溶液灌胃，連續(xù)灌胃14 d，給藥容量為10 mL·kg-1·d-1。實(shí)驗(yàn)期間每天嚴(yán)密觀察出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，記錄動(dòng)物外觀、活動(dòng)、精神狀況、進(jìn)食量、排泄物、異常分泌物、體質(zhì)量變化以及死亡等情況，若動(dòng)物出現(xiàn)死亡情況立即尸檢，發(fā)現(xiàn)病變器官后進(jìn)一步檢查。最后根據(jù)改良寇氏法計(jì)算雷公藤甲素在8周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠中的LD50。急性毒性實(shí)驗(yàn)用于探討雷公藤甲素在C57BL/6-Ins2Akita小鼠中的安全劑量，作為雷公藤甲素在C57BL/6-Ins2Akita小鼠中有效性實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)定的重要參考。

1.3.3 雷公藤甲素干預(yù)試驗(yàn) 取24周齡雄性C57BL/6野生型小鼠8只，作為野生型對(duì)照組(WT-CON組,n=8)，24周齡雄性C57BL/6-Ins2Akita小鼠32只，依據(jù)所測(cè)得的基線24 h尿蛋白含量分層隨機(jī)分組法分為：空白對(duì)照組(CON組，n=8)，低劑量用藥組(LDG組，n=8)，中劑量用藥組(MDG組，n=8)，高劑量用藥組(HDG組，n=8)。WT-CON組和CON組以0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，LDG、MDG、HDG組分別以25、50、100 μg·kg-1·d-1雷公藤甲素溶液灌胃，給藥容量為10 mL·kg-1·d-1。每日于下午4：00—5：00灌胃1次，連續(xù)進(jìn)行2個(gè)月。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察及記錄動(dòng)物的外觀、活動(dòng)、精神狀況、進(jìn)食量、排泄物等一般狀況，每周測(cè)量血糖和體質(zhì)量，每4周代謝籠收集24 h尿液檢測(cè)尿微量清蛋白，灌胃2月后處死小鼠，處死前稱(chēng)體質(zhì)量，收集24 h尿液，留取血液檢測(cè)血糖、血清清蛋白、三酰甘油、膽固醇、肌酐、尿素氮，取腎臟行病理檢查。

1.3.4 血壓監(jiān)測(cè) 使用Hatteras無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定小鼠尾部血壓。于每天下午5：00固定時(shí)間開(kāi)始測(cè)量，每只小鼠每天測(cè)量1次，系統(tǒng)每次自動(dòng)測(cè)定10個(gè)循環(huán)。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前連續(xù)10 d對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)測(cè)量，使小鼠熟悉測(cè)量環(huán)境。測(cè)量臺(tái)溫度保持在38 ℃，每只小鼠每次測(cè)量時(shí)間不超過(guò)25 min。

1.3.5 尿液的收集及測(cè)定 使用小鼠代謝籠收集24 h尿液，收集時(shí)間為前1日下午5：00至第2日下午5：00。收集期間正常進(jìn)食飲水，量取尿液體積，3 500 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱。使用小鼠尿清蛋白試劑盒通過(guò)ELISA法測(cè)定尿液中清蛋白濃度，乘以體積，計(jì)算出24 h尿清蛋白排泄率(UAER)。

1.3.6 標(biāo)本收集及保存 小鼠以4%水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，心尖采血0.8～1.2 mL，血液于37 ℃環(huán)境下靜置30 min后，分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２裳蠹糸_(kāi)右心耳，從心尖處(左心室)灌注預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射溶液，直至雙腎發(fā)白。分離腎臟包膜，取左腎上極約1/4的腎臟，放入4%多聚甲醛固定保存，留作腎臟病理檢查。

1.3.7 病理學(xué)檢查 腎臟組織石蠟包埋和切片后，行HE染色和PAS染色，分析腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張指數(shù)和系膜面積/毛細(xì)血管襻比值。HE染色切片高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇5個(gè)包含完整結(jié)構(gòu)的腎小球，分析腎小球面積，系膜面積及毛細(xì)血管襻面積，進(jìn)而得出系膜面積/毛細(xì)血管襻的比值。PAS染色切片高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇10個(gè)不重疊腎小球，測(cè)定系膜區(qū)擴(kuò)張的程度，即腎小球損傷面積占同一腎小球總面積的百分比。計(jì)分如下：0分為正常；1分為<25%；2分為25%～50%；3分為>50%。分析軟件使用Image Pro Plus 6.0。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病的評(píng)估

2.1.1 一般情況對(duì)比 實(shí)驗(yàn)中野生型C57BL/6J小鼠皮毛有光澤、攝食飲水情況正常、反應(yīng)靈敏，活動(dòng)自如。C57BL/6-Ins2Akita小鼠飲水量、進(jìn)食量和尿量均明顯多于野生型小鼠(P<0.01)，并隨時(shí)間進(jìn)展出現(xiàn)體型消瘦、毛發(fā)雜亂無(wú)光澤、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)。兩組小鼠體質(zhì)量均隨周齡增長(zhǎng)而增多，但突變型小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯緩慢，各周齡體質(zhì)量均低于野生型小鼠(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。

圖1 C57BL/6-Ins2Akita小鼠與C57BL/6J野生型小鼠

2.1.2 C57BL/6-Ins2Akita小鼠與C57BL/6J野生型小鼠生化指標(biāo)比較 C57BL/6-Ins2Akita小鼠自8周開(kāi)始測(cè)量起血糖即明顯高于C57BL/6J野生型小鼠(P<0.01)，且隨周齡增長(zhǎng)血糖升高較為迅速。血糖變化曲線見(jiàn)圖2。24 h尿清蛋白排泄率在第8周起高于野生型小鼠，但在16周測(cè)量時(shí)出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高(P<0.01)。同時(shí)，C57BL/6-Ins2Akita小鼠的血清清蛋白始終低于野生型小鼠(P<0.01)。兩種小鼠的多數(shù)測(cè)量指標(biāo)在不同時(shí)間出現(xiàn)不同程度差異，見(jiàn)表1。

2.2 雷公藤甲素14 d急性毒性實(shí)驗(yàn) 開(kāi)始給藥后100 μg·kg-1·d-1和200 μg·kg-1·d-1組動(dòng)物一般狀況較給藥前無(wú)明顯變化。400 μg·kg-1·d-1和800 μg·kg-1·d-1組的部分動(dòng)物在給藥后出現(xiàn)飲食減少，活動(dòng)減少，肢體發(fā)冷，體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。灌胃2周后死亡數(shù)目，100 μg·kg-1·d-1和200 μg·kg-1·d-1組沒(méi)有動(dòng)物死亡，400 μg·kg-1·d-1組死亡1只，800 μg·kg-1·d-1組3只全部死亡。小鼠死亡時(shí)多呈蜷縮姿勢(shì)，尸檢未見(jiàn)明顯異常。改良寇氏法計(jì)算LD50=356.45 μg·kg-1·d-1。

圖2 C57BL/6-Ins2Akita小鼠與C57BL/6J野生型

2.3 雷公藤甲素干預(yù)結(jié)果

2.3.1 一般狀況 不同劑量雷公藤甲素干預(yù)的各組小鼠之間一般情況未見(jiàn)明顯差別。實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物未出現(xiàn)死亡。

2.3.2 雷公藤甲素對(duì)C57BL/6-Ins2Akita小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響 雷公藤甲素干預(yù)治療后，WT-CON、CON、LDG、MDG、HDG組之間24 h尿清蛋白排泄率對(duì)比(圖3)治療后LDG、MDG、HDG組的24 h尿清蛋白排泄率均較CON組降低，其中HDG組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨蛋白尿的減少，血漿清蛋白水平得到提高，HDG組較CON組血清清蛋白水平提高約2.5 g/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。以上說(shuō)明100 μg·kg-1·d-1的雷公藤甲素對(duì)C57BL/6-Ins2Akita小鼠蛋白尿的升高和血清清蛋白水平的下降有明顯的治療效果。對(duì)于體質(zhì)量、24 h尿量、腎臟重量、血糖、血肌酐、尿素氮、三酰甘油、膽固醇等指標(biāo)，LDG、MDG、HDG組與CON組之間的組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 各周齡C57BL/6-Ins2Akita突變型小鼠與C57BL/6J野生型小鼠生化指標(biāo)的比較

注：與同周齡野生型比較,aP<0.01,bP<0.05

注：A為WT-CON組；B為CON組；C為L(zhǎng)DG組；D為MDG組；EHDG組；與WT-CON組比較，aP<0.01；與CON組比較，bP<0.05

圖3各組24 h尿清蛋白排泄率對(duì)比

注：A為WT-CON組；B為CON組；C為L(zhǎng)DG組；D為MDG組；E為HDG組；與WT-CON組比較，aP<0.01；與CON組比較，bP<0.05；與MDG組比較，cP<0.05

圖4各組血清清蛋白濃度對(duì)比

2.3.3 腎組織病理學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示，與WT-CON組對(duì)比，CON組的系膜面積/毛細(xì)血管襻面積明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)雷公藤甲素干預(yù)2月后，LDG、MDG、HDG組的較CON組系膜面積/毛細(xì)血管襻面積有所下降，但只有HDG組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，治療后LDG、MDG、HDG組的結(jié)果仍高于WT-CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。PAS染色結(jié)果顯示，與WT-CON組對(duì)比，CON組的腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張比例為27.25%±10.51%，100 μg·kg-1·d-1雷公藤甲素灌胃治療2月后，腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張比例較CON組降低，為13.25%±6.58%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

3 討論

近年來(lái)，糖尿病腎病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且治療沒(méi)有根本性的突破，使得糖尿病腎病在ESRD人群中的比例越來(lái)越高，糖尿病腎病已經(jīng)成為一個(gè)醫(yī)療花費(fèi)巨大的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。

由于人類(lèi)樣本獲取困難，且個(gè)體差異大，DN的動(dòng)物模型研究是DN研究中的重要環(huán)節(jié)，但目前還沒(méi)有找到可模擬人類(lèi)DN的理想模型。國(guó)內(nèi)DN研究多采用STZ誘導(dǎo)，但該方法造模成功率低、個(gè)體間差異大。本研究在美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了C57BL/6-Ins2Akita小鼠。該品種小鼠遺傳背景為C57BL/6J,為位于7號(hào)染色體的Ins2Akita等位基因突變形成自發(fā)性的雜合子糖尿病小鼠[12]，該小鼠β細(xì)胞少甚至耗盡,使胰島素分泌減少，該種小鼠是因高糖引發(fā)的DN，在致病原因上優(yōu)于STZ誘發(fā)的糖尿病腎病模型。成模成功率較高，多數(shù)鼠可發(fā)展為DN，且期間一般不會(huì)出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象。觀察和檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，C57BL/6-Ins2Akita小鼠血糖、蛋白尿和病理表現(xiàn)等觀察指標(biāo)變化較同步，異質(zhì)性小。實(shí)驗(yàn)中C57BL/6-Ins2Akita小鼠的尿蛋白水平明顯高于野生型對(duì)照組，且隨時(shí)間增長(zhǎng)差距逐漸增大。病理檢查結(jié)果也顯示出現(xiàn)了和人類(lèi)DN相似的系膜外基質(zhì)增多等病理改變。C57BL/6-Ins2Akita小鼠用于研究DN存在一些劣勢(shì)，雖然蛋白尿出現(xiàn)較早，但病理改變相對(duì)不顯著，且早期不容易出現(xiàn)腎小球硬化。形成模型需要的時(shí)間較長(zhǎng)，在4～6月齡才會(huì)出現(xiàn)輕度的病理改變，飼養(yǎng)需要耗費(fèi)較多的資源。此外，C57BL/6小鼠的遺傳背景對(duì)糖尿病腎病有一定的免疫性，選用其他遺傳背景(其他品系)的Insulin-2基因缺陷小鼠模型效果可能更好[13]。

表2 各組之間相關(guān)指標(biāo)的對(duì)比

表3 C57BL/6-Ins2Akita小鼠腎組織病理圖像定量分析結(jié)果

注:與WT CON組比較,aP<0.05，bP<0.01;與CON組比較,cP<0.01

C57BL/6-Ins2Akita小鼠是一個(gè)比較穩(wěn)定的I型糖尿病鼠模型，利用這個(gè)模型我們初步探討了雷公藤甲素干預(yù)的時(shí)間和劑量問(wèn)題。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)計(jì)算的LD50值為356.54 μg·kg-1·d-1，根據(jù)LD50和其他研究資料選定的25、50、100 μg·kg-1·d-1三個(gè)治療劑量，最終只在100 μg·kg-1·d-1組顯示治療有效，結(jié)果顯示雷公藤甲素的治療劑量和中毒劑量比較接近，治療窗相對(duì)較窄。這點(diǎn)與雷公藤制劑在臨床應(yīng)用中一致，劑量的選擇是雷公藤制劑治療中的重要問(wèn)題。

雖然目前越來(lái)越多的研究表明，高糖、糖基化終末產(chǎn)物的蓄積、氧化應(yīng)激等因素導(dǎo)致的機(jī)體免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活和炎性因子過(guò)度釋放是DN發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵原因，但目前臨床上用于糖尿病腎病的抗炎藥物甚少。雷公藤甲素對(duì)蛋白尿的治療作用在本研究中得到了驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)雷公藤甲素干預(yù)的C57BL/6-Ins2Akita小鼠蛋白尿明顯下降(P<0.05)，與此同時(shí)血清清蛋白水平得到恢復(fù)(P<0.05)。病理分析結(jié)果表明，雷公藤甲素對(duì)減少糖尿病腎病的系膜基質(zhì)聚積、減輕系膜擴(kuò)張有作用。

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ExperimentalstudyofTripterygiumglycosidesindelayingtheprogressionofdiabeticnephropathy

FanHongru*,YangJihong,WangMeng,DuJunjie,FangFang

(*DepartmentofNephrology,PekingUniversityFifthSchoolofClinicalMedicine,BeijingHospital,NationalCenterofGerontology,Beijing100730，China)

Corresponding author:YangJihong,Email:yang1119@ymail.com

[Abstract]ObjectiveTo investigate the safe dosage of triptolide for C57BL/6-Ins2Akita mice and its effect on delaying the progression of diabetic nephropathy.MethodsThe male C57BL/6-Ins2Akita mice and C57BL/6J mice were selected in this experient,From 8weeks old they were examed blood glucose,blood pressure every 4-5 weeks,24 hour urine albumin,serum creatinine,urea,lipids and liver function were checked every 8 weeks,in order to determine the time for the occurrence and assessment of diabetic nephropathy.At the same time,we intragastrically administrated 8-week-age C57BL/6-Ins2Akita mice with 100，200，400,800 μg·kg-1·d-1for 14 days.Observing the acute toxic reactions and calculating the LD50by bliss.Based on above experiments and references,we decided to intervene 24-week-age C57BL/6-Ins2Akita mice with 25,50,100 μg·kg-1·d-1for 8 weeks.And set the blank control and wild control groups.Meanwhile,we collect urine to detect the urinary albumin excretion rate for 24 h,and urinary protein/creatinine,following by collecting the blood to detect some indexes such as the creatinine,urea nitrogen and serum albumin after killing the mice.ResultsThe level of urinary albumin excretion rate,blood sugar,triglyceride and Cholesterol in C57BL/6-Ins2Akita mice were higher than those in C57BL/6J mice at all ages(P<0.05),while the level of serum albumin was lower than that of C57BL/6J wild mice.The gap was gradually drawn apart with age increasing.However,the creatinine did not show the ascendant tendency.The value of LD50is 356.45 μg·kg-1·d-1.Compared with the control,the high,medium and low triptolide experiment groups have less urinary albumin excretion rate with a statistically significant difference in high dose group(P<0.05).Serum albumin increased following the reduction of albuminuria.The serum albumin of HDG group increased by 2.5 g/L compared with CON group,which is statistically significant(P<0.05).There was no statistically significant difference in body weight,urine amount for 24h,kidney weight,blood sugar,blood creatinine,urea nitrogen,triglyceride and cholesterol etc between experiment and control group.Meanwhile,mesangial area/capillary loop area as well as the glomerular mesangial membrane expansion rate in high dose group are obviously under the blank control group(P<0.05)while no statistically significant difference was observed in low and medium groups.ConclusionWithin safe dosages,high dose triptolide can reduce the albuminuria,alleviate accumulation of mesangial matrix and increase blood albumin in C57BL/6-Ins2Akita mice,toxic reactions are prone to occur with higher doses.

[Keywords]Diabetic nephropathies；Tripterygium；Disease progression；Treatment outcome；Disease models,animal

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.24

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2018.03.024

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81373803)

作者簡(jiǎn)介：范鴻儒，碩士研究生，Email:1976728022@qq.com

通信作者：楊繼紅，副教授，博士生導(dǎo)師，Email:yang1119@ymail.com

2018-02-23)