沈加兵，季宇騰，周婷婷，曹茂盛，陳穎，曹茂紅，柯開富

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

·基礎(chǔ)研究·

程序性細(xì)胞死亡蛋白4在大鼠腦出血后血腫周圍域的表達(dá)及作用

沈加兵1，季宇騰2，周婷婷2，曹茂盛2，陳穎2，曹茂紅2，柯開富2

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

[摘要]目的探索程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)在腦出血(ICH)后血腫周圍域的表達(dá)、作用及機(jī)制，為ICH疾病的后期康復(fù)治療提供分子靶點(diǎn)。方法Western blot、免疫組織化學(xué)檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)變化；免疫熒光技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的空間定位情況；siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的干預(yù)。結(jié)果PDCD4在大鼠ICH后血腫周圍組織中表達(dá)上調(diào)，最高點(diǎn)位于ICH后第2天；上調(diào)的PDCD4主要與神經(jīng)元NeuN存在共定位，并且與上調(diào)的凋亡蛋白活化Caspase-3之間也存在共定位；體外ICH模型中(即hemin誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型)，通過siRNA靶向干預(yù)PDCD4的表達(dá)，則活化caspase-3明顯降低，而存活因子p-Akt上調(diào)。結(jié)論ICH后血腫周圍域PDCD4的表達(dá)上調(diào)與神經(jīng)元的凋亡相關(guān)，并且是通過p-Akt通路發(fā)揮作用的。

[關(guān)鍵詞]腦出血；血腫；程序性細(xì)胞死亡蛋白4；疾病模型，動(dòng)物

腦出血(ICH)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急、重癥，具有極高的致死率和致殘率，給社會(huì)、家庭帶來了沉重的痛苦和負(fù)擔(dān)[1]。ICH的病理損傷主要表現(xiàn)為血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元的損傷，以及膠質(zhì)細(xì)胞的增生、活化[2]。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的死亡不可再生，因此探索ICH后血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制，對ICH疾病的治療具有極大的意義。

程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)，顧名思義為凋亡過程中上調(diào)的基因，廣泛分布于各類組織器官中。文獻(xiàn)報(bào)道PDCD4主要影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[3]。研究證明PDCD4在癌組織中表達(dá)缺如或低表達(dá)，對癌細(xì)胞的侵襲、擴(kuò)散具有促進(jìn)作用，因此它又稱之為抑癌基因。目前已發(fā)現(xiàn)PDCD4在多種類型原發(fā)性腫瘤中低表達(dá)，如肺癌、肝癌、乳腺癌以及腦腫瘤等[4]。2016年，Zhen報(bào)道PDCD4 mRNA水平在非小細(xì)胞肺癌中下調(diào)，通過體外誘導(dǎo)PDCD4的表達(dá)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，原理上是通過滅活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[5]。近年來，越來越多的研究揭示PDCD4不僅對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起調(diào)節(jié)作用，它與細(xì)胞轉(zhuǎn)型、炎癥、凋亡、增殖以及自噬等方面關(guān)系也很密切。例如，在小鼠模型中，PDCD4的缺失能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的致死性炎性反應(yīng)[6]；抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)性損害[7]。此外，在糖尿病模型中，PDCD4的高表達(dá)能夠誘導(dǎo)胰島B細(xì)胞的凋亡[8]。也有學(xué)者們認(rèn)為PDCD4的功能表達(dá)主要是維持增殖、分化和凋亡三者之間的動(dòng)態(tài)平衡[9]。然而，PDCD4在ICH疾病中具有怎樣的作用，目前還不得而知。因此，本研究將主要探索PDCD4在大鼠ICH模型中的表達(dá)、作用以及潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證書編號(hào)：201701835)，240～260 g，SPF級(jí)，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理及外科手術(shù)均遵照1996年頒布的國家研究委員會(huì)的倫理要求操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 主要分成2組。假手術(shù)組：只插針未注射；ICH組：顱內(nèi)注射自體血50 μL。

ICH模型取3、6、12 h，1、2、3、5、7d為時(shí)間點(diǎn)，每組各12只大鼠，共96只；假手術(shù)組12只大鼠，總計(jì)108只大鼠。

1.3 ICH模型 以復(fù)合麻醉劑(3 mL/kg)腹腔注射麻醉；大鼠腦立體定位儀定位尾狀核區(qū)域(以囟門為正中點(diǎn)，向前0.2 mm，向右旁開3.5 mm，進(jìn)針深度5.5 mm)，回針0.5 mm，以10 μL/min的速度注入自體血50 μL，或放置空針作為假手術(shù)組。麻醉過后，ICH組所有的大鼠表現(xiàn)左側(cè)肢體功能的癱瘓(旋轉(zhuǎn)或者向左側(cè)倒去)，證實(shí)ICH模型制作成功。

1.4 神經(jīng)功能缺陷評分 前肢放置試驗(yàn)和輪轉(zhuǎn)試驗(yàn)主要參照之前發(fā)表的方法[10-11]。

1.5 Western blot 取新鮮腦組織冰上裂解，充分勻漿后，蛋白樣品定量。根據(jù)目的蛋白大小進(jìn)行凝膠電泳。將轉(zhuǎn)好的膜放入5%脫脂奶粉封閉。封閉結(jié)束，孵育相應(yīng)的一抗(山羊抗PDCD4抗體購買于Santa Cruz公司，其他抗體均購置于Cell Signaling Technology)，4 ℃過夜。孵育二抗，翻板室溫翻轉(zhuǎn)1 h后，ECL顯影。

1.6 免疫組織化學(xué) ICH后2天的大鼠以4%多聚甲醛灌注、取腦，浸泡12 h后，20%、30%蔗糖梯度脫水。進(jìn)行冰凍切片，厚度12 μm，室溫保存。

免疫組織化學(xué)主要運(yùn)用免疫組織化學(xué)試劑盒(購于Abcam公司)，按照說明書順序進(jìn)行，加入PDCD4孵育12 h；免疫熒光：取切片水化，0.5% Triton x-100通透細(xì)胞膜，0.1% BSA(胎牛血清)封閉后加入PDCD4、NeuN、GFAP及IBA1抗體，4 ℃孵育過夜，加入相應(yīng)的二抗，熒光顯微鏡下拍照(德國萊卡)。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 孕18 d大鼠，乙醚麻醉后提取原代皮層神經(jīng)元，培養(yǎng)在Neurobasal添加B27 supplement培養(yǎng)基中(購于Gibco公司)，每3天換液1次，培養(yǎng)至5 d時(shí)以100 μM hemin刺激細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收細(xì)胞。進(jìn)行轉(zhuǎn)染siRNA時(shí)，PDCD4 siRNA和Control siRNA運(yùn)用脂質(zhì)體法(lipofectamine 2000)(均由Invetrogen提供)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)30 h后，hemin刺激進(jìn)行收細(xì)胞檢測。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4在大鼠ICH后血腫周圍組織中的表達(dá)情況 神經(jīng)功能缺陷評分參照之前的研究[10-11]。圖1A和圖1B顯示PDCD4蛋白水平在ICH后血腫周圍組織中表達(dá)上調(diào)，隨時(shí)間點(diǎn)增高呈現(xiàn)單峰趨勢，最高點(diǎn)位于ICH后第2天。運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了PDCD4的表達(dá)情況。從圖1C～圖1I中，可以觀測到PDCD4主要在ICH后血腫周圍區(qū)域表達(dá)增高，而血腫對側(cè)腦域表達(dá)上調(diào)情況不明顯。

2.2 PDCD4在大鼠ICH后血腫周圍域的定位 ICH后血腫周圍域細(xì)胞環(huán)境非常復(fù)雜，為進(jìn)一步探索PDCD4在其間的作用，本研究選用免疫熒光技術(shù)檢測PDCD4與哪類神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。圖2免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)分別檢測PDCD4與神經(jīng)元(NeuN)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)以及小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1)的共定位情況。結(jié)果顯示上調(diào)的PDCD4主要定位于神經(jīng)元。

注：PDCD4為程序性細(xì)胞死亡蛋白4；a與Sham相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖1腦出血后血腫周圍域PDCD4的表達(dá)情況A為western blot檢測PDCD4的蛋白水平；B為A的條形統(tǒng)計(jì)圖；C、F為假手術(shù)(Sham)的對應(yīng)區(qū)域PDCD4表達(dá)情況；D、G為ICH后2天血腫對側(cè)區(qū)域PDCD4的表達(dá)情況；E、H為ICH后2天血腫同側(cè)區(qū)域PDCD4的表達(dá)情況；I為C～H的統(tǒng)計(jì)圖

注：PDCD4為程序性細(xì)胞死亡蛋白4

2.3 PDCD4與大鼠ICH后血腫周圍域神經(jīng)元凋亡的關(guān)系 ICH后神經(jīng)功能的損傷主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的死亡，那么上調(diào)的PDCD4是否與神經(jīng)元的凋亡相關(guān)。由此，本組檢測了血腫周圍域凋亡蛋白活化caspase-3的表達(dá)，以及促存活因子Akt的磷酸化情況。圖3A～圖3D結(jié)果顯示活化caspase-3在ICH后第2天表達(dá)最高，而p-Akt在第2天表達(dá)最低。圖3E免疫熒光技術(shù)檢測顯示活化caspase-3主要與神經(jīng)元、PDCD4共定位，由此進(jìn)一步證實(shí)了本組的猜想，上調(diào)的PDCD4可能與ICH后血腫周圍域神經(jīng)元的凋亡相關(guān)。

2.4 PDCD4在體外ICH模型中的表達(dá) 為進(jìn)一步證實(shí)上調(diào)的PDCD4與神經(jīng)元的凋亡存在相關(guān)性，本組構(gòu)建了體外ICH模型，即血紅素Hemin誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型。在此基礎(chǔ)上，本研究檢測了PDCD4的表達(dá)，以及活化caspase-3的表達(dá)。圖4A和圖4B顯示PDCD4、活化caspase-3在hemin誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型中表達(dá)上調(diào)，并隨時(shí)間逐漸增加，12 h后達(dá)最高峰。同樣，圖4C和圖4D檢測了p-Akt的表達(dá)情況，結(jié)果顯示p-Akt隨時(shí)間逐漸下降，于12 h達(dá)最低谷。與體內(nèi)表達(dá)是一致的，由此證明血紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型(體外ICH模型)是成功的。

2.5 PDCD4在體外ICH模型中的作用 為證實(shí)PDCD4與神經(jīng)元凋亡之間的因果聯(lián)系。本組轉(zhuǎn)染了PDCD4的特異性siRNA，圖5A和圖5B顯示在Hemin刺激條件下，PDCD4 siRNA組PDCD4的表達(dá)明顯低于Non-specific siRNA組。在此條件下，Active caspase-3表達(dá)減少，而p-Akt水平則增高。這些結(jié)果說明了PDCD4可以促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，并且可能通過p-Akt途徑發(fā)揮作用的。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)PDCD4在ICH后血腫周圍區(qū)域表達(dá)增高，并且在空間表型上主要與神經(jīng)元存在共定位關(guān)系，與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞無共定位情況。因?yàn)镮CH后神經(jīng)元的凋亡/死亡是ICH疾病的最嚴(yán)重后果，由此本研究進(jìn)一步檢測了PDCD4的上調(diào)與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)ICH條件下，PDCD4與血腫周圍域神經(jīng)元、Active caspase-3之間存在時(shí)間、空間上的相關(guān)性，并且與p-Akt之間也存在一定關(guān)聯(lián)。為明確PDCD4與神經(jīng)元凋亡之間的因果聯(lián)系，本組構(gòu)建體外ICH模型，即Hemin誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型，運(yùn)用PDCD4的特異性siRNA干預(yù)PDCD4的表達(dá)，來明確Active caspase-3、p-Akt的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PDCD4干預(yù)后，Active caspase-3隨之下調(diào)，而p-Akt則上調(diào)。綜上，本研究證實(shí)了在ICH條件下，PDCD4的上調(diào)與血腫周圍域神經(jīng)元的凋亡相關(guān)，并且是通過抑制Akt的磷酸化，抑制其促存活作用來發(fā)揮效應(yīng)的。

注：PDCD4為程序性細(xì)胞死亡蛋白4；a與Sham組相比，P<0.05

注：PDCD4為程序性細(xì)胞死亡蛋白4；a與Control組相比，P<0.05

注：PDCD4為程序性細(xì)胞死亡蛋白4；a與Non-specific siRNA組相比，P<0.05

PDCD4，腫瘤抑制基因，能夠結(jié)合到真核生物翻譯起始因子4A1上，從而阻斷RNA的結(jié)合發(fā)揮抑制蛋白質(zhì)的翻譯作用，因此其表達(dá)降低主要與腫瘤的增殖有關(guān)[12]。然而，越來越多的研究開始關(guān)注其在非腫瘤中的作用[13-14]。PDCD4發(fā)揮不同的作用可能與其所處的細(xì)胞環(huán)境相關(guān)。本研究證實(shí)，PDCD4在ICH后血腫周圍域組織中上調(diào)，可能與促神經(jīng)元凋亡相關(guān)。

PI3K/Akt通路是神經(jīng)元存活過程中一條重要信號(hào)途徑。PI3K的激活能夠通過第二信使導(dǎo)致Akt從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜遷移，同時(shí)Akt活化，活化的Akt磷酸化促凋亡因子Bad，從而阻止了Bad與Bcl-2或Bcl-xl的結(jié)合，發(fā)揮促存活作用[15]。另外，激活的Akt還能夠抑制caspase-9的活性，通過阻斷Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用[16]。本研究體外ICH模型中，通過siRNA干預(yù)PDCD4的表達(dá)，p-Akt水平則明顯上調(diào)，由此證明PDCD4能夠通過抑制Akt的磷酸化，從而發(fā)揮促凋亡作用。

PDCD4在ICH后血腫周圍域發(fā)揮促神經(jīng)元凋亡的作用，并且是通過下調(diào)p-Akt通路實(shí)現(xiàn)的。

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ExpressionandroleofPDCD4intheareaadjacenttohematomaafterintracerebralhemorrhage

ShenJiabing*,JiYuteng,ZhouTingting,CaoMaosheng,ChenYing,CaoMaohong,KeKaifu

(*MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Corresponding author:KeKaifu,Email:kekaifu_nt@126.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression,role and potential mechanism of PDCD4 in area adjacent to hematoma after intracerebral hemorrhage (ICH),and provide a molecular target for the treatment and neuronal recovery of ICH in future.MethodsProtein levels were examined by western blot and immunohistochemistry;the spatial location for proteins was detected by immunofluorescence;siRNA transfection was used to intervene in the protein in the cells.ResultsPDCD4 expression was up-regulated in the area adjacent to hematoma after ICH,and the peak of the level for PDCD4 was reached in the second day after ICH;the up-regulated d PDCD4 expression had a co-localization with NeuN,and it also had a co-localization with neuronal apoptotic protein,activated caspase-3;in the ICH model in vitro,neuronal apoptotic model induced by hemin,the expression of activated caspase-3 was decreased,and the expression of the survival factors p-Akt was increased,by intervening in the expression of PDCD4 with siRNA.ConclusionThe up-regulation of PDCD4 expression in the area adjacent to hematoma after ICH is associated with neuronal apoptosis,which might be relevant to p-Akt signaling pathway.

[Keywords]Cerebral hemorrhage；Hematoma；Programmed cell death 4；Disease models，animals

中圖分類號(hào)：R743.34

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2018.03.025

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助(81671135)；江蘇省學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目資助(KYZZ16_0356)；南通大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目資助(YKC16058)

作者簡介：沈加兵，博士在讀，Email：shen_jia_bing@126.com

通信作者：柯開富，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：kekaifu_nt@126.com

2017-12-21)