陳蕭蕭，黃敏玲，汪薇，任文彬，白衛(wèi)東，劉功良

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣州510225)

0 引言

奶味香精是香精香料領域中投資最大、開發(fā)研究最為活躍的香精之一，可以給食品原料賦香，矯正不良氣味，彌補食品中原香氣的不足，輔助和穩(wěn)定食品中固有香氣[1-2]。而以酶解乳脂為基料的復合型奶香香精能克服了調配型奶味香精口感單薄的缺陷，是當前研究的熱點[3-4]。但由于酶的造價比較高，而且使用游離酶進行酶解反應時，酶只能使用一次而不能回收，導致產(chǎn)物的生產(chǎn)成本較高且后續(xù)分離步驟復雜，影響了利用酶應用的商業(yè)化。與游離酶相比，共固定化酶能同時固定化多種酶，還能保持其高效、專一及溫和酶催化反應特性的同時，還具有貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點[5-7]。本文將蛋白酶和脂肪酶進行共固定化，探討了其對制備奶香基料的影響。

1 實驗

1.1 材料與試劑

多美鮮無鹽黃油，乳清粉，脂肪酶A 12 K，脂肪酶M ER和蛋白酶M SD由阿瑪諾天野酶制劑，海藻酸鈉，CaC l2，乙醇，乙醚，氫氧化鉀，酚酞指示劑等均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 共固定化酶的制備

準確稱取1 g海藻酸鈉固體，加入去離子水，加熱溶解，配成1%的海藻酸鈉溶液。待冷卻到45℃后，加入10 m g游離酶，充分攪拌均勻后，用5號注射器滴入到100 m L質量分數(shù)為3%的CaC l2溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化1 h。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后在4℃下保存。

1.2.2 酶解工藝流程

稱取適量黃油→添加水和輔助底物→75℃，預殺菌20m in→降溫至室溫→添加適量脂肪酶→于設定溫下進行水解一定時間→90℃滅酶10m in→添加適量蛋白酶→于設定溫度下進行水解一定時間→90℃滅酶10m in

1.2.3 共固定化酶添加量對奶香基料品質的影響

分別往6個錐形瓶中加入10 g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為黃油質量的12.5%，加水量為黃油質量的60%，置于恒溫水浴鍋中（75℃，20 m in）滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶，添加量為黃油質量的0%，25%，50%，75%，100%，125%；置于恒溫搖床中（35℃，150 r/m in）反應2 h。濾出固定化酶后3 000 r/m in離心15 m in，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，并對產(chǎn)生的香氣進行感官評價。

1.2.4 共固定化酶的酶解時間對奶香基料品質的影響

分別往6個錐形瓶中加入10 g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為黃油質量的12.5%，加水量為黃油質量的60%，置于恒溫水浴鍋中（75℃，20 m in）滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶為黃油質量的100%，置于恒溫搖床中（35℃，150 r/m in）反應2 h。濾出固定化酶后3 000r/m in離心15 m in，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，并對產(chǎn)生的香氣進行感官評價。

1.2.5 共固定化酶的酶解溫度對奶香基料品質的影響

分別往6個錐形瓶中加入10 g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為黃油質量的12.5%，加水量為黃油質量的60%，置于恒溫水浴鍋中（75℃，20 m in）滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶為黃油質量的100%，分別置于30，35，40，45，50，55℃的恒溫搖床中150 r/m in反應2 h。濾出固定化酶后3 000 r/m in離心15 m in，取上層油相，測定酶解后黃油的酸價，并對產(chǎn)生的香氣進行感官評價。

1.2.6 酸價測定

測定方法參考《動植物油脂酸值和酸度測定》（GB/T 5530－2005）。

1.2.7 酥性餅干的制作

選用優(yōu)質原輔料，面粉∶糖∶油∶水∶膨松劑的比例為50∶15∶10∶6∶0.8。把稱好的糖用按比例稱量的水溶解，在盤中把油用電動攪拌器高速攪拌30 s，加入稱量好的面粉和膨松劑，把溶解好的糖水倒入，用手揉勻，加入面粉重量0.25%的奶香基料，用手揉勻，輥壓到大概5 mm的厚度，用模子印出餅干形狀，放入烤箱150℃烤制30 m in即可，同時制作不添加奶香基料的餅干作為空白對照。

1.2.8 感官評價

選定若干個人組成感官評價鑒定小組，按表1分別對酶解產(chǎn)物的香氣強度、香氣純度和留香情況進行評分，評分結果為3者之和，總分為10。評分標準如表1所示。

2 結果與分析

2.1 共固定化酶添加量對奶香基料品質的影響

酶催化生成奶香香基時，酶的添加量對香基的風味影響較大。酶的添加量較少時，生成的風味物質的量少，奶香味較淡；酶添加量過多時，雖可產(chǎn)生大量的風味物質，卻會產(chǎn)生某些不良氣味，同時也會增加生產(chǎn)成本[8]。因此，應選擇合適的共固定化酶添加量。

由圖1和表2可知，當共固定化酶添加量小于黃油質量的100%時，隨著共固定化酶的增加，產(chǎn)香效果越好，香氣越濃郁。共固定化酶等于黃油質量的100%時，所得到的奶香香基為甜香型奶味，香氣濃郁、圓潤且回味悠長，此時測得酸價為1.86 m g/g。當共固定化酶添加量大于黃油質量的100%時，開始產(chǎn)生酸臊味，且隨著加酶量的增加，奶香香基的酸價增加較快，酸臊味越來越嚴重。綜合考慮，最適宜的共固定化酶的添加量為黃油質量的100%。

表1 香氣評分標準

圖1 共固定化酶添加量對奶香基料品質的影響

表2 共固定化酶添加量對奶香基料的感官影響

2.2 共固定化酶的酶解時間對奶香基料品質的影響

為了得到最好的效果和提高生產(chǎn)效率，選擇合適的酶解時間也是很重要的。就理論而言，酶解時間越長，酶解反應越徹底。事實上，過長的酶解時間會生成較多的不良風味物質，影響香基的整體風味。但是當酶解時間過短時，酶解反應不完全，風味物質生成過少，風味沒有充分形成。要香基達到理想的風味，酶解反應時間應控制好[8]。

圖2 共固定化酶的酶解時間對對奶香基料品質的影響

表3 酶解時間對奶香基料的感官影響

從圖2和表3可以看出，酶解產(chǎn)物的酸價隨著酶解時間的增加而增大。當酶解時間是2 h時，產(chǎn)香效果最好，所得奶香香基香氣濃郁、圓潤，并與奶甜味協(xié)調，留香時間長，此時酸價為1.70 m g/g。當酶解時間超過2 h后，酸價繼續(xù)上升，開始出現(xiàn)酸敗味，感官評分下降，可能是黃油的酶解程度過高導致酶解產(chǎn)物中不良風味物質生成。綜合考慮，選擇酶解最適宜的時間為2 h。

2.3 共固定化酶的酶解溫度對奶香基料品質的影響

酶對溫度較為敏感,溫度的不同會影響到酶活性中心的分子構象分布及底物黃油的乳化狀態(tài)，從而影響到整個酶解反應的進程。當酶解溫度低于最適溫度時，溫度會抑制酶的活性，使酶活力較低，同時也會影響底物的黏度，進而影響傳質速度，酶解反應的速度變慢。當酶解溫度高于最適溫度時，由于高溫會導致酶變性而減弱甚至失去催化活性[9]，而且在較高溫度下共固定化酶外層的海藻酸鈣會軟化，使包埋在其中的酶泄漏出來，酶活力下降。

圖3 共固定化酶的酶解溫度對酸價和感官評分的影響

表4 酶解溫度對奶香基料的感官影響

由圖3和表4可以看見，當酶解溫度低于40℃時，隨著溫度的升高，奶香香基的香氣越來越強烈，香氣純度越來越協(xié)調、豐富，原因可能是溫度的升高促進了酶解反應的進行，風味產(chǎn)物也隨之增加。當溫度達到40℃時，所得到的奶香香基的感官評分最高，此時的香基奶香是偏奶酪的奶香，奶香較強，香氣較純正圓潤，留香時間長，所測得酸價是1.58 m g/g。當酶解溫度達到45℃時，酶解產(chǎn)物的酸價最高，酸價是3.58 m g/g，感官評分降低，可能是因為酶解過度產(chǎn)生不良風味物質。酶解溫度超過45℃時，可能是由于酶解溫度高于最適溫度導致酶變性而減弱甚至失去催化活性，或者是因為共固定化酶外層的海藻酸鈣因為溫度的升高而軟化，使包埋在其中的酶泄漏出來，使酶活力開始下降導致酸價和感官評分降低。綜上所述，適宜酶解溫度是40℃。

2.4 奶香基料的應用試驗

為了檢測所制備的奶香基料的耐熱性、和持香性，將奶香基料應用于餅干。

表5 餅干應用試驗

如表5所示，不添加奶香基料的餅干，味道較單調，吃起來只有面粉味；而添加了奶香基料的餅干，能品嘗到較明顯的類似奶酪的奶香味，奶香濃郁，更能引起人的食欲，且餅干放置一周后仍帶有奶香味。

可見，所制備的奶香基料不僅奶香濃郁，還具有良好的耐熱性和持香性。

2.5 游離酶與共固定化酶制備奶香基料的比較

雖然固定化酶技術解決了游離酶的生產(chǎn)成本高等問題，但由于酶分子從游離態(tài)變成牢固態(tài)結合于載體時，酶分子的微觀環(huán)境發(fā)生了變化[10]。因此游離酶和共固定化酶制備的奶香基料在工藝條件和感官評分方面還是存在一些差別。

表6 游離酶與共固定化酶制備奶香基料的條件比較

由表6可知，采用游離酶和共固定化酶所制備的奶香基料的香型都是奶酪香，香氣醇正圓潤，留香時間長，利用共固定化酶所得的奶香基料的香氣濃度稍遜一籌，可能是海藻酸鈉凝膠顆粒在一定程度上妨礙了酶和底物的接觸，使某些呈味物質生成較少或無法生成，造成香氣強度稍弱。但是共固定化酶的酶解時間更短，而且還可重復使用，大大節(jié)約了時間成本和原材料成本。

3 結論

本研究將蛋白酶M SD、脂肪酶A12K和脂肪酶M ER進行共固定化得到共固定化酶，并利用其水解黃油制備奶香基料，結果表明，共固定化酶的添加量與底物黃油的質量比為1∶1，酶解時間是2 h，酶解溫度是40℃，所得奶香基料奶味濃郁，具有良好的耐熱性和持香性。

[1]宋煥祿.食品風味化學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2008：126-130.

[2]張艷艷,張樹明,董詠梅.乳香香精的研制及應用[J].山東食品發(fā)酵,2005,2(137):50-51.

[3]汪薇，白衛(wèi)東，趙文紅.生物法制備奶味香精的研究進展[J].中國調味品,2009（4）:27-30.

[4]汪建明,李秉業(yè),馬鳳艷.奶酪風味劑的研究與開發(fā)[J].中國食品添加劑,2008(S1):171-177.

[5]顧旭炯.雙酶體系的共固定化及其動力學研究[D].浙江工業(yè)大學,2006.

[6]劉自琴.脂肪酶和胰蛋白酶的固定化及共固定化研究[D].華南理工大學,2012.

[7]高尚欣,周冰如,周錦絲,等.海藻酸鈉-殼聚糖共固定化菠蘿莖蛋白酶的研究[J].食品工業(yè)科技,2011（5）:209-211.

[8]張惠丹,汪薇,白衛(wèi)東,等.復合酶水解奶油制備天然奶味香基的工藝研究[J].中國釀造,2015（4）:141-145.

[9]何愛華.生物酶解天然奶油制備奶香精基料的研究[D].江南大學,2008.

[10]張茜,劉濤,侯紅萍.提高固定化酶活力方法的研究進展[J].釀酒,2008（2）:15-18.