楊晨璐，馬林，周蕊，饒晴，邱朝坤，凌潔玉

（1.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院，食品與生物科技學(xué)院，武漢430205；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢430065；3.蒙牛乳制品武漢有限責(zé)任公司，武漢430040）

0 引言

乳酸菌胞外多糖（Exopo lysaccharides,EPS）是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝中分泌到細(xì)胞壁外的黏液多糖和莢膜多糖的總稱(chēng)[1]。乳酸菌是公認(rèn)的益生菌，與其他菌相比安全性更高。乳酸菌的EPS已作為增稠劑、穩(wěn)定劑等應(yīng)用到一些食品中[2]，可以顯著改善或增強(qiáng)乳制品的口感和流變學(xué)特性[3]，且大量研究證明其具有抗氧化、抑制腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力等多種生理功能[3]，被公認(rèn)為安全而有效的食品添加劑。本研究前期從湖北特色發(fā)酵食品鲊?yán)苯分蟹蛛x出一株植物乳桿菌，并證實(shí)其能夠有效發(fā)酵乳制品與泡菜。本研究對(duì)其胞外多糖進(jìn)行提取純化，并研究各胞外多糖組分的抗氧化活性，為將該菌開(kāi)發(fā)為乳制品及其他發(fā)酵食品的益生菌種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），由本研究室前期從湖北宜昌某農(nóng)家自制鲊?yán)苯分蟹蛛x。

DEAE Cellulose DE-52，分析純，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；胃蛋白酶、胰蛋白酶，分析純，Biosharp；SephadexG-200，分析純，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；葡聚糖2 000、葡聚糖T 10、T 20、T 40、T 70、DPPH，分析純，上海金穗生物科技有限公司；鐵氰化鉀、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、鄰二氮菲，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，天津市普瑞斯儀器有限公司；754PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌胞外多糖的提取

采用前期優(yōu)化的提取方法。取植物乳桿菌菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h，活化3代。取發(fā)酵液離心，將上清液50℃減壓濃縮至10～20 m L，調(diào)節(jié)pH值為6.0，加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿：正丁醇=4∶1），震蕩30 m in后，4 000 r/m in離心15 m in，收集上層水相溶液，重復(fù)以上操作至兩相之間無(wú)蛋白質(zhì)層為止。隨后按體積比1∶3加入90%的乙醇，4℃沉淀14 h，5 000 r/m in離心30 m in，沉淀用丙酮洗滌脫水兩次，冷凍干燥得白色粉末即為胞外粗多糖。

1.3.2 胞外多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A490）為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程為y=0.007x-0.0156，R2=0.9994。吸取定容后的樣品液0.1 m L，同標(biāo)曲的操作，將測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的多糖含量。

1.3.3 胞外多糖的純化

將胞外粗多糖先采用DEAE Cellu lose DE-52分離純化，分離條件為：上樣濃度2 m g/m L，上樣體積10m L，先用雙蒸餾水洗脫，再用0.5 m ol/L N aC l溶液洗脫，流速為1 m L/m in，每4 m in收集一管，各收集16管。在波長(zhǎng)490 nm處以苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測(cè)，以號(hào)管為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做洗脫曲線。分別收集雙蒸餾水與N aC l洗脫液下的洗脫峰組分，采用SephadexG-200進(jìn)一步純化。用0.1 m ol/LN aC l溶液洗脫，流速為1 m L/m in，每4 m in收集一管，各收集20管。在波長(zhǎng)490 nm處以苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測(cè)，分別收集洗脫峰組分，PBS透析過(guò)夜，冷凍干燥得白色粉末即為純化后的胞外多糖。

取純化的中性多糖和酸性多糖分別配成1 m g/m L的溶液，將紫外分光光度計(jì)的波長(zhǎng)設(shè)定在200～400 nm處進(jìn)行掃描，觀察吸收峰的位置。

1.3.4 胞外多糖分子量測(cè)定

釆用葡聚糖凝膠過(guò)濾法，將藍(lán)色葡聚糖2 000配制的3 m g/m L溶液，上樣SephadexG-200凝膠柱，0.1 m oL/L N aC l洗脫，控制流速為1 m L/m in，每5 m in收集一管，共收集20管，在波長(zhǎng)490 nm處以苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測(cè)，準(zhǔn)確測(cè)定洗脫體積V0；將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T 10、T 20、T 40、T 70配制成3 m g/m L濃度的溶液，分別上樣，準(zhǔn)確測(cè)定其洗脫體積V e。并以V e/V0和相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)lgMW作圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知分子量的多糖樣品在相同條件下層析，根據(jù)洗脫體積在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.5 胞外多糖體外抗氧化性研究

1.3.5.1 羥自由基（·OH）清除能力測(cè)定

取0.75 mm ol/L鄰二氮菲1 m L于試管中，加入2 m L pH 7.4的PBS，1 m L蒸餾水，充分混勻，加入0.75 mm ol/L的 FeSO41 m L，再加 20 mm o l/LH2O21 m L，37℃水浴90 m in，536 nm處測(cè)其吸光度，記為Ap；用1 m L蒸餾水代替1 m LH2O2進(jìn)行上述反應(yīng)和測(cè)定，記為Ab；用樣品代替1m L蒸餾水，為As。羥自由基的清除率按式（1）計(jì)算：

1.3.5.2 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測(cè)定

試管中加入4.5 m LT ris-HC l緩沖溶液（50 mm ol/L）與4.5 m L蒸餾水，混勻后在37℃水浴中保溫20 m in，隨后立即加入37℃預(yù)熱過(guò)的鄰苯三酚（3 mm ol/L）0.5 m L，迅速混勻后導(dǎo)入比色皿中，在波長(zhǎng)325 nm處每隔30 s測(cè)定一次吸光度，以10 mm o l/LHC l溶液配制空白對(duì)照組。計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加。樣品管在加入鄰苯三酚前，先加入0.5 m L樣品液，蒸餾水相應(yīng)減少0.5 m L，其余同前。超氧陰離子自由基清除率按式（2）計(jì)算。

超氧陰離子自由基清除率/%

其中，ΔA 1/ΔA t為鄰苯三酚自氧化時(shí)的反應(yīng)速率；ΔA 2/ΔA t為加入樣品后鄰苯三酚自氧化時(shí)的反應(yīng)速率。

1.3.5.3 DPPH自由基（DPPH·）清除能力測(cè)定

取2 m L樣品溶液與2 m L 0.2 mm o l/L的DPPH甲醇溶液混合，室溫下避光反應(yīng)30 m in，517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i；空白組以等體積甲醇代替DPPH溶液，為A j；對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液；為A0。DPPH自由基的清除率按式（3）計(jì)算。

1.3.5.4 還原能力測(cè)定

采用鐵氰化鉀法。取1 m L樣品于試管中，加入0.2 m o l/L pH 6.6的PBS及1%的鐵氰化鉀溶液各1 m L，混勻。50℃水浴反應(yīng)20 m in，驟冷。再加入1 m L5%三氯乙酸，4 000 r/m in離心5 m in，取上清液2.5 m L，加入蒸餾水2.5 m L，0.1%三氯化鐵0.5 m L，搖勻，靜置反應(yīng)10m in后，于700 nm處測(cè)吸光值。A700nm值越大，代表還原能力越強(qiáng)。

1.3.6 模擬胃腸道環(huán)境對(duì)胞外多糖抗氧化活性的影響

5.0 g/L的N aC l溶液1 000 m L，加入10 g胃蛋白酶，采用濃HC l調(diào)節(jié)pH至1.3，即為人工模擬胃液[4]。5.0 g/L的N aC l溶液1 000 m L，加入10 g胰蛋白酶、1.5 g膽鹽及1.5 gα-淀粉酶，用0.1 m o l/L的N aOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，即為人工模擬腸液[4]。

取1.3.5中抗氧化性最好的胞外多糖組分，配制成0.04mg/m L的溶液，分別與上述模擬胃腸液在37℃作用一定時(shí)間，每隔1 h取樣一次，測(cè)定其抗氧化性指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖的提取純化

采用上述優(yōu)化方法提取植物乳桿菌的胞外多糖，多糖得率為0.279 m g/m L。對(duì)提取的粗多糖采用DEAE Cellulose DE-52和Sephadex G-200色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)圖1-圖4。

圖1 DEAECellulose DE-52柱純化雙蒸水洗脫曲線

圖2 DEAECellulose DE-52柱純化NaCl洗脫曲線

圖3 中性多糖Sephadex G-200色譜柱洗脫曲線

圖4 酸性多糖ephadex G-200色譜柱洗脫曲線

由圖1可知，在DEAE-52分離柱中，利用雙蒸水洗脫得到一種中性多糖組分，出現(xiàn)在第1-6管，得率為14.62%。將此中性多糖采用SephadexG-200繼續(xù)分離，如圖3所示，依然得到一個(gè)組分，但峰型對(duì)稱(chēng)性并不好，有拖尾現(xiàn)象，提示可能并非是單一組分的糖。收集G-200分離后7-10管洗脫液，透析過(guò)夜，冷凍干燥即為純化的中性多糖，命名為EPS-1。

對(duì)DEAE Cellulose DE-52色譜柱利用0.1m oL/L的N aC l溶液洗脫，如圖2所示，得到兩種酸性多糖組分，分別出現(xiàn)在1-4管及8-10管。收集含量較高的酸性多糖組分（1-4管），得率為4.18%，采用SephadexG-200繼續(xù)分離，如圖4所示，得到一個(gè)峰值，且峰型對(duì)稱(chēng)性良好，說(shuō)明得到的酸性多糖純度較高。收集G-200分離后9-11管洗脫液，透析過(guò)夜，冷凍干燥即為純化的酸性多糖，命名為EPS-2。

將純化所得EPS-1與EPS-2在200～400 nm處進(jìn)行紫外掃描，如圖5、圖6所示。在260 nm、280 nm、320 nm波長(zhǎng)處均未見(jiàn)吸收峰，表明純化后的胞外多糖中不含蛋白質(zhì)、核酸和色素等雜質(zhì)。

圖5 中性多糖紫外掃描

圖6 酸性多糖紫外掃描

2.2 胞外多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

以Ve/V0對(duì)相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)lgMW作圖，可獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖7。根據(jù)曲線計(jì)算回歸方程為：y=-0.54x+5.64，R2=0.9918。將中性多糖EPS-1與酸性多糖EPS-2以同樣條件上樣和洗脫，測(cè)得EPS-1洗脫體積為30 m L，EPS-2洗脫體積為25m L，根據(jù)上式計(jì)算可得EPS-1相對(duì)分子質(zhì)量為1.26×105，EPS-2相對(duì)分子質(zhì)量為6.76×104。

2.3 各組分胞外多糖體外抗氧化性研究

對(duì)純化的中性多糖EPS-1、酸性多糖EPS-2及未純化的胞外粗多糖進(jìn)行自由基清除能力及還原能力測(cè)定，結(jié)果如圖8～圖11所示。分析可知，第一，隨著濃度增高，三種多糖對(duì)各自由基的清除能力及還原能力均呈上升趨勢(shì)，在0.02～0.1 m g/m L范圍內(nèi)，濃度與抗氧化性正相關(guān)，其中濃度對(duì)·OH的清除能力影響最明顯。研究表明，胞外多糖清除·OH是通過(guò)多糖提供氫原子，與·OH結(jié)合生成水而實(shí)現(xiàn)[4]，故清除能力強(qiáng)弱與多糖濃度相關(guān)性大。

圖7 多糖相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 多糖組分對(duì)羥自由基清除能力測(cè)定

圖9 多糖組分對(duì)超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

圖10 多糖組分對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

圖11 多糖組分還原能力測(cè)定

第二，對(duì)于三種自由基的清除能力以及還原能力，酸性多糖EPS-2均表現(xiàn)出最強(qiáng)，而粗多糖均表現(xiàn)出最弱。已有多項(xiàng)研究表明，乳酸菌的胞外多糖，其酸性多糖較中性多糖具有更高抗氧化活性[5]，本研究得到結(jié)果與之一致。分析其原因可能與多糖所含糖醛酸數(shù)量相關(guān)，酸性多糖含有更多的糖醛酸組分，使得分子帶有更多的負(fù)電荷，使分子形態(tài)伸展，降低了自由基攻擊分子時(shí)的空間位阻，進(jìn)而加快自由基的猝滅[4]，后續(xù)需進(jìn)一步對(duì)該酸性多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定以確證。粗多糖因?yàn)槲唇?jīng)純化，含有較多雜質(zhì)，阻礙了其抗氧化活性的發(fā)揮。故選擇酸性多糖EPS-2進(jìn)行后續(xù)模擬胃腸道的研究。

第三，對(duì)于體外抗氧化指標(biāo)的選擇性，三種多糖表現(xiàn)出一致性，即對(duì)O2-·及DPPH·清除能力最強(qiáng)，最低值即達(dá)到94%以上，最高可達(dá)98.94%；對(duì)·OH的清除能力屬于中等，與多糖濃度關(guān)系較大；而還原能力表現(xiàn)最弱。已有研究表明，DPPH·是一類(lèi)較為穩(wěn)定的自由基，若能將其清除，則表明受試物質(zhì)具有較強(qiáng)的自由基清除能力，可清除其它自由基如過(guò)氧化氫、烷自由基等[4]。本研究中，三種多糖對(duì)DPPH·的清除率都可達(dá)到90%以上，較目前報(bào)道的一些乳酸菌菌株的胞外多糖[6-7]，自由基清除能力更強(qiáng)。還原能力是評(píng)價(jià)抗氧化性的另一個(gè)重要指標(biāo)，本研究表明，該植物乳桿菌的胞外多糖抗氧化活性主要通過(guò)清除自由基而實(shí)現(xiàn)。故在后續(xù)模擬胃腸道研究中，只測(cè)定自由基清除的三項(xiàng)指標(biāo)。

2.4 模擬胃腸道對(duì)胞外多糖抗氧化活性的影響

發(fā)酵食品中乳酸菌分泌的胞外多糖，隨食品一起進(jìn)入人體胃腸道，要使其能在人體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，首先其必須對(duì)胃液和腸液有較強(qiáng)耐受性。本研究制備人工胃液及腸液，測(cè)定模擬胃腸道環(huán)境對(duì)酸性多糖EPS-2抗氧化性的影響。

2.4.1 人工胃液對(duì)EPS-2抗氧化性的影響

由圖12可知，酸性多糖EPS-2在人工胃液中作用4 h內(nèi)，其對(duì)DPPH·的清除能力保持穩(wěn)定，對(duì)·OH及O2-·的清除能力隨著時(shí)間延長(zhǎng)而有一定的增加，其中對(duì)O2-清除活性增加更為顯著。這說(shuō)明模擬胃液對(duì)多糖清除自由基能力具有一定的促進(jìn)作用。分析其原因，胃液中不含有水解糖類(lèi)的酶，但是胃液中的酸性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致多糖分子一定程度的水解，水解后的小分子糖空間位阻小，更容易與自由基反應(yīng)而使之猝滅。有研究表明，多糖經(jīng)水解或輻射后得到的小分子多糖，其抗氧化活性明顯提高[8]。

圖12 人工胃液對(duì)EPS-2抗氧化性的影響

2.4.2 人工腸液對(duì)EPS-2抗氧化性的影響

由圖13可知，酸性多糖EPS-2在與人工腸液作用5 h內(nèi)，其DPPH·的清除能力保持穩(wěn)定，而對(duì)·OH及O2-·的清除能力隨作用時(shí)間延長(zhǎng)有一定量增加，其中對(duì)·OH清除活性增加更為顯著。腸道中含有α-淀粉酶，推測(cè)該酶能對(duì)該酸性多糖EPS-2產(chǎn)生部分水解，生成一些小分子的多糖，更容易與自由基發(fā)生反應(yīng)，特別是能提供更多的氫原子，與·OH結(jié)合而實(shí)現(xiàn)對(duì)其的清除。腸道是受氧化損傷較嚴(yán)重的部位，由研究可以推測(cè)，該酸性多糖可以停留于腸道中，并且在腸道中進(jìn)行一定分解，從而較好發(fā)揮其抗氧化作用，保護(hù)腸道黏膜。

圖13 人工腸液對(duì)EPS-2抗氧化性的影響

3 結(jié)論

本研究對(duì)一株分離自鲊?yán)苯返闹参锶闂U菌進(jìn)行胞外多糖的提取純化，得到一種中性多糖EPS-1和一種酸性多糖EPS-2，測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量分別為1.26×105、6.76×104。

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明：無(wú)論對(duì)于·OH、O2-·及DPPH·自由基的清除能力，還是還原能力，酸性多糖EPS-2均表現(xiàn)出最高活性，而粗多糖均表現(xiàn)出最低活性；三種多糖對(duì)O2-·及DPPH·清除能力相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)·OH的清除能力中等，而還原能力均較低；隨著三種胞外多糖濃度的增大，其抗氧化性也隨之增加，濃度對(duì)·OH的清除活性影響最大。

采用酸性多糖EPS-2進(jìn)行人工模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，EPS-2對(duì)DPPH·的清除能力在人工胃液及人工腸液中均保持穩(wěn)定；對(duì)·OH及O2-·的清除能力隨著人工胃液及腸液作用時(shí)間延長(zhǎng)，均有一定增強(qiáng)。

總體而言，相比已經(jīng)報(bào)道的大多數(shù)乳酸菌胞外多糖，該株植物乳桿菌的胞外多糖具有更高的自由基清除能力，且其酸性多糖不被人體消化道所消化，而只在胃腸道有一定降解，形成更多具有較好抗氧化活性的小分子多糖，發(fā)揮其抗氧化作用而保護(hù)胃腸道黏膜，具有良好生物學(xué)活性。本研究為將此株植物乳桿菌開(kāi)發(fā)為乳制品及其他發(fā)酵食品的益生菌種奠定了基礎(chǔ)。

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