劉繼超，陳歷俊，劉碩，喬為倉，史潤(rùn)鴿，姜鐵民

（北京市乳品工程技術(shù)研究中心母嬰乳品生物技術(shù)北京市工程實(shí)驗(yàn)室北京三元食品股份有限公司，北京100163）

0 引言

生物胺（biogenic am ine，BA）是一類堿性含氮化合物，可以看作是氨的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氫原子被烷基或芳基取代形成的。食品中主要存在的生物胺包括組胺、腐胺、尸胺、酪胺、色胺、β-苯乙胺、精胺和亞精胺[1]。生物胺廣泛存在于各類食品中，在富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品中相對(duì)更多，如乳酪及奶制品，魚、肉及其制品，巧克力，酒及各類發(fā)酵制品和水果、蔬菜等，特別是魚類及其制品，乳酪、肉制品和發(fā)酵類食品[2]。如乳制品中富含酪氨酸，容易污染酪胺，據(jù)報(bào)道[3]，干酪中酪胺可達(dá)400 m g/kg。生物胺產(chǎn)生的條件有3個(gè)：一是有可形成生物胺的游離氨基酸，二是存在可代謝產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物，三是適合該微生物生長(zhǎng)的環(huán)境[4]。

適量的生物胺有利于人體的健康，但是過量的生物胺會(huì)使人體中毒，導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，會(huì)引起頭疼、血壓變化、呼吸紊亂、心悸、嘔吐等嚴(yán)重反應(yīng)[5]。對(duì)食品中生物胺的檢測(cè)方法很多[6]，如：薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法。由于食品的基質(zhì)復(fù)雜，有必要研究各類食品中生物胺的檢測(cè)方法。該研究建立了乳制品中生物胺的快速檢測(cè)方法，并對(duì)乳制品中生物胺的含量進(jìn)行研究與分析，為乳制品中生物胺的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與儀器

1.1 材料

標(biāo)準(zhǔn)品：色胺(簡(jiǎn)稱Try)，β-苯乙胺（簡(jiǎn)稱Phe），腐胺(簡(jiǎn)稱Put)，尸胺(簡(jiǎn)稱Cad)，組胺(簡(jiǎn)稱 H is)，酪胺(簡(jiǎn)稱 Tyr)，亞精胺(簡(jiǎn)稱 Spd)，精胺(簡(jiǎn)稱 Spm)，丹磺酰氯(Dansyl chloride)。

常規(guī)試劑：鹽酸，丙酮，飽和碳酸氫鈉，乙腈，乙醚，氯化鈉，氫氧化鈉，正丁醇，超純水，三氯乙酸。

檢測(cè)樣品：市售乳制品。

1.2 儀器

儀器：w aters 2695高效液相色譜儀，UV檢測(cè)器2489，電熱恒溫箱，振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器ZQZY-B），電子秤（Precisa XT 120A），氮吹儀（M TN-2800D），渦旋振蕩器（CSILOGEX），離心機(jī)（sigm a 3K15）。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液對(duì)的配制：用0.1 m ol/L的HC l溶液分別配制質(zhì)量濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4℃避光保存。

生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液配制：分別吸取1.00 m L各生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于同一個(gè)10 m L容量瓶中，用0.1m L/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，配制成生物胺標(biāo)準(zhǔn)使用液（100μg/m L）。

生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制：吸取0.05 m L、0.10 m L、0.25 m L、1.00 m L、1.50 m L、2.50 m L、5.00 m L生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液（100μg/m L），分別置于10 m L容量瓶中，用0.1 m ol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，是濃度分別為0.50μg/m L、1.0μg/m L、2.50μg/m L、10.0μg/m L、15.0μg/m L。

丹磺酰氯衍生劑溶液配制：準(zhǔn)確稱取丹磺酰氯0.1000 g，以丙酮為溶劑配制成濃度為10m g/m L的衍生劑標(biāo)準(zhǔn)使用液，置于4℃儲(chǔ)存。

2.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化

分別取0.5 m L生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別置于10 m L具塞試管中，加入1.5 m L飽和碳酸氫鈉溶液，1.0 m L丹磺酰氯衍生劑溶液，振蕩使混勻。置于60℃干燥箱中反應(yīng)30m in，中間振蕩兩次，取出，分別加入100μL飽和碳酸氫鈉溶液，振蕩混勻，60℃保溫15 m in。取出，每個(gè)具塞試管中加入1 m L超純水，在40℃用氮?dú)獬ケ?。加? m L乙醚，振蕩2 m in，靜置分層后，吸取出上層有機(jī)相，重復(fù)萃取兩次，合并乙醚萃取液，氮?dú)獯蹈?。加?.0 m L乙腈使殘留物溶解，振蕩混勻，0.22μm濾膜過濾，濾液待測(cè)。

2.3 樣品的制備及衍生化

2.3.1 樣品提取

取樣品10.00 g，置于100 m L具塞錐形瓶中，加入20 m L 5%三氯乙酸溶液，振蕩提取60 m in后轉(zhuǎn)移至50 m L離心管中，離心取上清液，置于50 m L容量瓶中，連續(xù)提取兩次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀釋至刻度，濾紙過濾。

2.3.2 樣品萃取

取2.3.1方法制得的樣品濾過液50 m L，加入適量的氯化鈉使溶液飽和。準(zhǔn)確移取上述飽和后的試樣提取液5.00 m L，置于30 m L離心管中，用1.0 m ol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至11.5。加入5.0 m L的正丁醇，渦旋振蕩5m in，離心后吸取上層有機(jī)相，再重復(fù)萃取兩次，最后一步萃取液使用分液漏斗分離，合并萃取液，混勻，取3.0 m L萃取液并加入0.2 m L 1 m o l/L鹽酸，混合后40℃下氮?dú)獯蹈?，加?.0 m L 0.1 m ol/L鹽酸溶解殘留物，待衍生。

2.3.3 樣品的衍生

取2.3.2中待衍生的樣品溶液0.5m L，其余步驟與生物胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的衍生步驟一致。

2.3.4 色譜條件

梯度洗脫：W AT054275C18(L)色譜柱(4.6×250mm，5μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30℃，流動(dòng)相：A為超純水，B為乙腈，流速為1.0 m L/m in，進(jìn)樣量為20 μL，梯度洗脫。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際樣品圖譜

8種生物胺（15μg/m L）在44 m in內(nèi)色譜峰完全分離（見圖1所示），分離效果良好。用色譜檢測(cè)出峰的順序?yàn)樯?、?苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺。

取5個(gè)不同濃度（0.50、1.0、2.50、10.0、15.0μg/m L）的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行衍生色譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為自變量（x），色譜峰面積為因變量（y）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，8個(gè)線性回歸方程得R2值均在0.9988以上，具有良好的線性關(guān)系。8種生物胺在0.50、1.0、2.50μg/m L加標(biāo)水平上平均回收率在85.25%～102.05%范圍，其重現(xiàn)性RSD均小于10%，因此，該方法符合加標(biāo)回收率和乳制品中生物胺含量分析的需要。

圖1 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)色譜圖

3.2 乳制品中生物胺含量的測(cè)定

乳制品中生物胺的積累，主要是由于牛奶在高溫條件下發(fā)生蛋白水解產(chǎn)生大量氨基酸，以及制作過程中低pH值、低鹽濃度等環(huán)境因素為微生物生產(chǎn)生物胺創(chuàng)造了有利條件[7]。通過對(duì)原干酪樣品、再制干酪樣品、攪拌型酸奶樣品和凝固型酸奶樣品進(jìn)行生物胺含量的測(cè)定（見表1），顯示不同乳制品中均含有不同含量的生物胺。所有乳制品樣品中均檢測(cè)到酪胺，這與2010年英格蘭科學(xué)家O zdestan等[8]采用HPLC方法測(cè)定主要以微生物作發(fā)酵劑的土耳其乳制品中生物胺含量，結(jié)果基本一致。

生物胺的積累往往會(huì)導(dǎo)致生物體產(chǎn)生不良反應(yīng)，因此，應(yīng)嚴(yán)格控制食品中生物胺的含量。目前，雖然制定食品中的生物胺標(biāo)準(zhǔn)十分困難，但部分國(guó)家已經(jīng)嘗試根據(jù)不同食品的特性給出生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB10136-2015動(dòng)物性水產(chǎn)制品[9]，規(guī)定鹽漬魚（高組胺魚類）≤40m g/100g，鹽漬魚（不含高組胺魚類）≤20 m g/100g，而對(duì)其它食品并沒有相關(guān)限量規(guī)定。歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 m g/kg，酪胺含量不得超過 100～800 m g/kg[10]。FDA規(guī)定組胺、酪胺在水產(chǎn)品的限量分別為50m g/kg、100 m g/kg[11]。從表1可知，該研究從市場(chǎng)采集的乳制品樣品中組胺、酪胺含量均低于國(guó)際相關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同乳制品中生物胺含量

3.3 不同生產(chǎn)條件對(duì)乳制品中生物胺含量的影響

從生產(chǎn)工藝的角度分析，原干酪、再制干酪、攪拌型酸奶以及凝固型酸奶的加工工藝是不同的，從表1結(jié)果可知，不同工藝生產(chǎn)的不同乳制品中生物胺含量有差異，而且在同一種生物胺在不同產(chǎn)品中濃度也不同，而再制干酪樣品中酪胺含量明顯高于原干酪樣品和酸奶樣品中酪胺的含量。

不同保存天數(shù)的角度分析，保存60 d再制干酪樣品的生物胺含量高于保存30 d的再制干酪樣品的生物胺含量，可見不同保存天數(shù)對(duì)乳制品中生物胺含量也有一定的影響。

從發(fā)酵菌種的角度分析，不同發(fā)酵菌種生產(chǎn)的不同乳制品中生物胺含量也有差異，而且在同一種生物胺在不同產(chǎn)品中濃度也不同。該方法檢測(cè)的乳制品樣品中攪拌型酸奶樣品1的發(fā)酵菌種為嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌，攪拌型酸奶樣品2的發(fā)酵菌種為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，由表1可知，2種酸奶樣品的生物胺總量也存在差異，說明不同的發(fā)酵菌種對(duì)乳制品中生物胺含量也存在一定的影響。因?yàn)槿橹破分械漠a(chǎn)胺菌主要是革蘭氏陽性菌，乳酸菌作為乳制品中的優(yōu)勢(shì)菌株，同時(shí)也是主要產(chǎn)胺菌。

采用GB4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》方法對(duì)乳制品中的乳酸菌總數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示攪拌型酸奶樣品2乳酸菌總數(shù)為5.7×108CFU/m L，攪拌型酸奶樣品3乳酸菌總數(shù)為2.3×109CFU/m L，對(duì)應(yīng)的生物胺含量攪拌型酸奶樣品2低于攪拌型酸奶樣品3，可見不同發(fā)酵菌種添加量對(duì)乳制品中生物胺含量也存在一定影響。

4 結(jié)論

目前，HPLC是定量分析生物胺的主要方法，其具有速度快、靈敏度高、分析準(zhǔn)確等特點(diǎn)。該研究建立了超高效液相色譜結(jié)合柱前衍生法快速檢測(cè)乳制品中生物胺的快檢方法，結(jié)果顯示各生物胺衍生物分離效果較好，各生物胺衍生物線性關(guān)系良好（R2＞0.998），各生物胺回收率在85.25%～102.05%范圍內(nèi)，其重現(xiàn)性RSD均小于10%，方法可靠。

從檢測(cè)結(jié)果可知，不同乳制品中色胺（TR）、β-苯乙胺（PHE）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、組胺（H IS）、酪胺（TYR）、亞精胺（SPD）和精胺（SP）8種生物胺的種類及含量存在一定的差異，顯示不同乳制品中均含有不同含量的生物胺，并且所有乳制品樣品中均檢測(cè)到酪胺。不同工藝、不同發(fā)酵菌種及不同菌種添加量所生產(chǎn)的乳制品中生物胺種類及生物胺總量也存在一定的差別，為乳制品中生物胺的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。該研究檢測(cè)的乳制品樣品中生物胺總量范圍為10.30～34.00 m g/kg，不存在安全問題。但不同的發(fā)酵工藝、儲(chǔ)存條件和儲(chǔ)存時(shí)間等因素對(duì)不同乳制品中生物胺合成的具體影響還需要進(jìn)一步研究，為確保乳制品的食用安全性提供理論依據(jù)。

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