戴盈，崔巍，徐利，施秉銀，趙廷啟

在肥胖個體和2型糖尿?。═2DM）患者中常有體內游離脂肪酸（FFA）的升高，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA的升高可能與胰島 細胞功能障礙和T2DM的發(fā)病密切相關。FFA包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，后者又分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。目前關于不同F(xiàn)FA對胰島 細胞的生存與死亡的影響存在爭論，有待進一步研究。本實驗以大鼠INS-1胰島 細胞瘤株（以下簡稱INS-1細胞）為實驗對象，觀察不同濃度飽和脂肪酸（棕櫚酸，PA）、單不飽和脂肪酸（油酸，OA）和FFA加用廣譜Caspase抑制劑和PI3K抑制劑對體外培養(yǎng)下的INS-1細胞的增殖和凋亡的影響?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1材料 INS-1細胞由中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所病理生理研究室婁晉寧教授和瑞士日內瓦大學王海燕博士所贈。PA、OA、四甲基偶氮唑鹽（MTT）及無FFA的牛血清白蛋白（BSA）均購自Sigma公司。RPM I1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen（GIBICO）公司。Annexin-Ⅴ/FITC試劑盒購自深圳晶美公司。Z-VAD-fmk購自 Alexis公司，LY294002購自CST公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) INS-1細胞用含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基（11.1 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L的丙酮酸鈉，10 mmol/L的HEPES，2 mmol/L的L-谷氨酰胺，及55mol/L的 巰基乙醇）在37℃/5%CO2的細胞孵箱中培養(yǎng)，待到細胞85%左右貼壁，棄去原有培養(yǎng)基，用無血清的含0.1%BSA和0.5mmol/L葡萄糖的RPM I1640培養(yǎng)基對細胞進行24h同步化培養(yǎng)。然后用不同濃度的PA和OA進行干預。

1.2.2FFA的配制[1]用0.1mol/LNaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的OA和PA，振蕩混勻10 m in，然后過濾，配成100 mmol/L的OA/PA儲存液。在55℃水浴中用去離子水配5%BSA溶液，過濾。然后將上述的FFA溶液和BSA溶液按1∶19的體積比混合配成5mmol/LFFA/5%BSA復合液。復合液在水浴中振蕩10 s后繼續(xù)水浴10 m in，取出后冷卻至室溫，過濾。然后將上述復合液分別用無血清含葡萄糖16.7mmol/L的RPM I1640培養(yǎng)基以1∶5和1∶10的比例稀釋成1.0mmol/LFFA/1%BSA和0.5 mmol/L FFA/0.5%BSA的實驗所需濃度；用無血清含葡萄糖5.5mmol/L的RPMI1640培養(yǎng)基以1∶10和1∶20的比例稀釋成0.5mmol/LFFA/0.5%BSA和0.25mmol/L FFA/0.25%BSA的實驗所需濃度。

1.2.3MMT法測定細胞增殖情況 將INS-1細胞按每孔104種于96孔培養(yǎng)板，待細胞85%貼壁，細胞同步化24h，棄去原有培養(yǎng)基，加入含不同濃度FFA的培養(yǎng)基干預。實驗組分別是終濃度為0.25、0.5mmol/L OA；0.25、0.5mmol/LPA；0.5mmol/LOA/PA+100mol/L Z-VAD-fmk；以及 0.5 mmol/L OA/PA+20mol/L LY294002。同時設含0.25%BSA和0.5%BSA的兩組對照組。每組5個復孔，每孔總反應體系為200l。按照設定的時間，在倒置顯微鏡下觀察細胞并拍攝記錄細胞形態(tài)；然后每孔加入MTT 20l，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜200l，振蕩10min，酶標儀（德國BGM公司，型號：POLARstarOPTIMA）測定590nm下各個組實驗對象的吸光度（A）。

1.2.4用Annexin-Ⅴ/FITC試劑盒檢測細胞凋亡將INS-1細胞按每孔106種于6孔培養(yǎng)板，待細胞85%貼壁，同步化培養(yǎng)24 h。實驗組分別用含0.5 mmol/L的OA/PA和1.0mmol/L的OA/PA的無血清高糖（含葡萄糖16.7mmol/L）RPM I1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組用含0.5%或1%BSA的無血清高糖RPM I1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設三個復孔。在6、16、24 h 3個時間點，用倒置顯微鏡觀察細胞并拍攝記錄細胞形態(tài)，然后分別消化細胞，離心收集細胞，用4℃預冷的PBS緩沖液洗細胞兩次，然后用結合緩沖液重懸細胞，調節(jié)細胞的濃度為106/m l。每個樣本取100l的細胞懸液，加入5l的Annexin-Ⅴ/FITC和10l的碘化丙啶（PI，20g/ml）溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，在每個樣本中加入400l結合緩沖液，流式細胞儀（美國BD公司，型號：FACSCalibur）測量并分析。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1不同濃度的OA和PA對INS-1細胞生長的影響 與對照組相比，在各時間點，兩種濃度OA對細胞生長均具有促進作用（均＜ 0.05），以 0.25mmol/L OA促進細胞生長作用更為明顯，細胞增殖程度分別是對照組的1.3倍、1.5倍和1.9倍；而0.25 mmol/L PA和0.50 mmol/L PA均能抑制細胞生長（均＜0.05），以0.50mmol/LPA的抑制作用更為明顯，其作用下的細胞增殖程度僅為對照組的42%、45%和32%。各實驗組的細胞在48h生長程度達到最大。見表1。

表1　不同濃度的油酸和棕櫚酸對INS-1細胞增殖（吸光度A）的影響

2.2不同Caspase抑制劑對INS-1細胞增殖的影響在含0.5 mmol/L OA/PA的高糖培養(yǎng)基中加入Caspase抑制劑Z-VAD-fmk（以下簡稱VAD），并使其終濃度為100mol/L，培養(yǎng)細胞28 h后，OA干預下的兩組細胞增殖程度均高于對照組，其中，VAD組的細胞增殖程度稍低于無VAD組的細胞，無VAD組的細胞增殖程度與對照組差異有統(tǒng)計學意義（＜ 0.05）；PA干預的兩組細胞增殖程度均低于對照組，但VAD組的細胞增殖程度要高于無VAD組的細胞，而無VAD組的細胞與對照組相比增殖明顯受到抑制（＜0.01）。見表2。

表2　廣譜Caspase抑制劑VAD處理后的Ins-1細胞增殖情況

同樣在含0.5 mmol/L OA/PA的高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為20mol/L的PI3K抑制劑LY294002（以下簡稱LY），培養(yǎng)細胞30 h后，MTT法觀察發(fā)現(xiàn)，在OA和PA兩種干預下，加LY組處理的細胞增殖程度均明顯低于相應的不加LY組的細胞（＜0.01）。與對照組相比，OA能顯著促進細胞增殖（＜0.01），OA+LY、PA、PA+LY這3組的細胞增殖均明顯受到抑制（均＜0.01）。OA+LY組細胞增殖程度明顯高于PA+LY組細胞。見表3。

表3　PI3K抑制劑LY處理后對Ins-1細胞增殖的影響

2.3不同濃度OA和PA對INS-1細胞凋亡的影響用不同濃度的OA和PA作用，在各時間段均可見到凋亡細胞。隨著時間的推移，各實驗組的凋亡細胞量增多，尤其在24h后，倒置顯微鏡下可見到大量細胞凋亡：細胞皺縮成圓形或橢圓形，失去原有的突觸，漂浮或懸浮于培養(yǎng)基中，不再貼壁生長（封二彩圖3A、B、C）。而較對照組而言，OA組的細胞凋亡量要少于對照組（封二彩圖3B），而PA組的細胞凋亡量要明顯多于對照組（封二彩圖3C）。

用Annexin-Ⅴ/FITC/PI雙標記流式細胞術可測知各個時間段各組細胞凋亡的比例。在6 h，OA組和PA組作用下細胞和對照組細胞的凋亡率差異均無統(tǒng)計學（均＞0.05），但1 mmol/L OA細胞凋亡比例明顯少于同濃度PA組（＜0.01）。24 h高濃度OA引起細胞凋亡與對照組差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；0.50 mmol/L和1 mmol/L PA組的細胞凋亡率與對照組差異均有統(tǒng)計學意義（均＜ 0.05）。對照組及PA組細胞的凋亡均隨著時間的推移逐漸增加（＜0.05）；而OA組引起的細胞凋亡在各個時間段差異均無統(tǒng)計學意義（均＞0.05）。見表4。

3　討論

本研究顯示，不飽和脂肪酸OA可促進細胞增殖，而飽和脂肪酸PA則抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。OA組細胞在48h增殖程度達到最大，48h后，生長程度逐漸下降，可能是測定細胞增殖是在無血清、低糖（葡萄糖濃度為5.5mmol/L）培養(yǎng)基中進行，而48 h后無血清、低糖條件下氧化應激導致的細胞凋亡超過OA促增殖作用，以致72 h細胞增殖程度低于48 h，盡管如此，72 h的OA和PA相比還是顯示出較少的細胞毒性。

表4　不同濃度OA和PA作用下對INS-1細胞凋亡的影響

研究證明，Caspase家族在細胞凋亡信號傳導過程中起到核心作用，VAD是廣譜的Caspase抑制劑，可抑制由Caspase所引起的細胞凋亡。本實驗在OA組應用了VAD之后，并沒有使細胞生長率顯著提高，可能是OA本身能促進細胞生長，故VAD對OA組細胞生長的影響不大。而PA組應用了VAD之后，細胞生長率有所增加，提示PA引起的INS-1細胞凋亡的信號途徑中有Caspase參與其中。PI3K/Akt信號通路中的下游反應元件cIAP-2和XIAP是Caspase有效的抑制劑，可阻斷細胞的凋亡反應[7]。本研究中，應用了LY的OA組和PA組，細胞生長明顯受抑，提示LY作為PI3K抑制劑，通過抑制PI3K/Akt信號通路使Caspase失去抑制，致細胞凋亡增加。上述結果提示，PI3K/Akt信號通路在INS-1細胞脂性凋亡中對維持應激細胞的生存具有重要意義，而PA引起的細胞凋亡是通過Caspase介導的。

本研究對細胞凋亡的測定是在高糖（16.7mmol/L）及無血清條件下進行的。結果顯示，PA使細胞凋亡顯著增加；而OA作用下細胞凋亡率低于對照組和PA組。本實驗對照組引起細胞大量凋亡的原因可能與高糖、無血清環(huán)境所致高糖毒性及氧化應激有關。由此，筆者推測，OA在促進細胞增殖同時，還能對抗高糖毒性誘發(fā)的 細胞凋亡，對 細胞起到保護作用。

總之，本實驗證實了OA能促進INS-1細胞生長，抑制其凋亡，對 細胞具有保護作用；PA則抑制INS-1細胞的生長，并促進其凋亡，對 細胞具有毒性作用。通過應用廣譜Caspase抑制劑VAD和PI3K抑制劑LY對細胞生長影響的研究，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路在胰島 細胞脂性凋亡中對維持應激細胞的生存具有重要意義；在高濃度PA長期作用下引起的INS-1細胞凋亡是通過Caspase介導的。而上述結論中涉及的具體分子機制，還需進一步實驗證實。

參考文獻：