黃新偉，鄭建華，陳文濱，程金生

(1.惠州市第一人民醫(yī)院藥學部，廣東 惠州 516003； 2.嘉應學院醫(yī)學院客家養(yǎng)生保健研究，廣東 梅州 514031)

中藥半枝蓮(ScutellariabarbataD. Don)為唇形科植物半枝蓮的干燥全草，具有清熱解毒、化瘀利尿的功效[1]。臨床上多用于治療蟲蛇咬傷、瘡腫腫毒、傳染性肝炎、肝硬化腹水、腎炎水腫及跌打損傷等[2]。同時，現代藥理研究結果證明，半枝蓮具有良好的抗腫瘤活性，常配伍其他中藥治療鼻咽癌、肝癌、胃癌、直腸癌、食道癌及肺癌等惡性腫瘤[3]。半枝蓮含有多種化學成分，如黃酮類化合物、二萜類化合物、甾體生物堿和多糖等，其主要生理活性物質為黃酮類和二萜類化合物[4]。近年來，大部分學者對半枝蓮的多糖、黃酮類成分及提取物進行了抗腫瘤相關研究，或重點考察了中藥成分的配伍和性味歸經；在湯劑的藥效研究中主要考慮藥材中有效成分的溶出、煎煮過程中活性成分的復合作用和藥性的變化[5-7]。但迄今尚無研究關注湯劑中存在著的大量粒徑分布，即從納米尺度一直延伸至微米范圍的不溶固態(tài)微粒，更未考慮這些微粒對于湯劑藥效所起的作用和貢獻。本研究通過比較半枝蓮湯劑和去除納米顆粒的湯劑對肝癌細胞的體內外抑制作用，考察藥效與湯劑納米顆粒的關系，為破解湯劑中內在的納米科技原理、中藥現代化研究和中藥制劑的開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 藥品與試劑

半枝蓮飲片(惠州泛生中藥飲片有限公司，批號：20161202)；1640培養(yǎng)液、標準胎牛血清(Hyclone，賽默飛世爾生物制品北京有限公司，批號：Lot.No.20151201)；噻唑藍(MTT，美國Sigma公司，批號：M2319)；二甲亞砜(DMSO，國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20151203)；胰蛋白酶(美國Gibico公司，批號：3840006)；半枝蓮水提液(SEB，0.5 g/ml)，實驗室自制；去納米顆粒的半枝蓮水提液(SEB-RN)，實驗室自制；注射用環(huán)磷酰胺(CTX，山西普德藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.2 g/瓶，批準文號：國藥準字H14023686，批號：201609070)。

1.2 儀器

酶聯(lián)免疫分析儀(瑞士TeCan公司)；96孔培養(yǎng)板(丹麥Nune公司)；SW-CJ-VS1超凈工作臺(無錫易純凈化設備有限公司)；YP50001型電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；Thermo Scientific酶標儀(RT-2100C，深圳雷杜電子有限公司)；UV-2202PCS紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；十萬分之一分析天平(天津市華儀盛達實驗儀器有限公司)；BC-J160S型CO2培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；XD-202倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)。

1.3 實驗動物及瘤株

SPF級昆明種小鼠7周齡，雌雄各半，體質量18～21 g，由嘉應學院醫(yī)學動物實驗中心院提供；試驗期間飼以該中心提供的飼料，自由飲水；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～22 ℃，濕度50%～60%(動物合格證號：51007)。實驗瘤株：腹水型肝癌H22細胞株，由嘉應學院醫(yī)學院實驗動物中心提供并保存；人肝癌SMMC-7721細胞株，由嘉應學院醫(yī)學院病理實驗室提供并傳代保種。

2 方法

2.1 半枝蓮提取物的制備

2.1.1 SEB：半枝蓮藥材500 g，粉碎后于提取罐中加水提取，提取溫度為90～100 ℃，提取2次，第1次加入10倍體積的蒸餾水，第2次加入8倍體積蒸餾水，每次提取2 h，將提取液過濾后濃縮至含生藥1 g/ml的溶液。用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于4 ℃冰箱保存，待用[8-9]。

2.1.2 SEB-RN：取“2.1.1”項下方法制得的SEB，以3 000 r/min離心20 min，取上層清液繼續(xù)以5 000 r/min離心，取上層清液用超濾膜過濾制得。

2.2 體外細胞生長抑制試驗

2.2.1 人源肝癌細胞培養(yǎng)：將人肝癌細胞SMMC-7721接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分數為5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，用5 g/L胰蛋白酶消化傳代[10]。

2.2.2 MTT法測細胞增殖抑制率：取處于對數生長期SMMC-772細胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%小牛血清的培養(yǎng)基配成濃度為5×104個/ml的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔200 μl。在37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，分別加入SEB、SEB-RN和CTX，使藥物質量濃度為5×105、5×105和50 μg/ml，各20 μl，為實驗組。模型組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液作為對照。每組設4個平行孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在24 h取出培養(yǎng)板，每孔加入2 mg/ml的MTT溶液200 μl，在37 ℃條件下繼續(xù)孵育4 h，離心，小心棄去上清液，并每孔加入200 μl的DMSO溶液，溶解沉淀顆粒，用振蕩器震蕩15 min混勻后，采用酶標儀在490 nm處測定吸光度(OD)，并計算抑制率。細胞抑制率=[(模型組OD值的平均值-實驗組OD值的平均值)/模型組OD值的平均值]×100%。

2.3 體內抗腫瘤抑制試驗

2.3.1 建立H22荷瘤小鼠模型：無菌抽取傳代第7日的H22腹水型昆明種小鼠的腹水，以無菌0.9%氯化鈉溶液按1∶3稀釋，制成腫瘤細胞懸液，經臺盼藍染色，鏡檢腫瘤細胞存活率>95%，調整細胞濃度為1×107/ml。于每只小鼠右前腋皮下注射0.2 ml細胞懸液(約2×106個細胞)，制成荷瘤小鼠肝癌模型[10]。

2.3.2 動物分組及給藥：取肝癌荷瘤小鼠60只，稱質量，隨機分為4組，每組15只。第1組為CTX組，腹腔注射CTX 20 mg/kg，1日1次，連續(xù)給藥14 d，次日頸椎脫臼處死；第2組為模型組，每日灌胃給予0.9%氯化鈉溶液0.4 ml，1日1次，連續(xù)14 d，次日頸椎脫臼處死；第3組為SEB組，每日灌胃給予SEB 5 g/kg，連續(xù)給藥14 d，次日頸椎脫臼處死；第4組為SEB-RN組，每日灌胃給予SEB-RN 5 g/kg，連續(xù)給藥14 d，次日頸椎脫臼處死[8]；將四組小鼠處死后，剝離瘤塊，用濾紙吸凈其腫瘤組織的液體，精密稱瘤質量，計算腫瘤抑制率。同時分離胸腺、脾臟組織，精密稱質量，計算胸腺指數、脾臟指數。腫瘤抑制率(%)=(模型組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%。臟器指數(mg/g)=臟器質量(mg)/體質量(g)。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 體外抑制作用比較

與模型組相比，CTX、SEB和SEB-RN均對SMMC-7721細胞的增殖有顯著抑制作用；與SEB-RN相比，SEB對SMMC-7721細胞的增殖抑制率明顯更高，見表1。

表1 體外抑制作用比較Tab 1 Comparison of inhibitory effects in

3.2 體內抑制作用比較

四組小鼠成功接種肉瘤后，第5日起模型組即可肉眼觀察到肉瘤，其余三組實體瘤生長并不明顯；隨著時間延長，模型組和CTX組小鼠逐漸出現運動減少、毛發(fā)枯燥及體質量下降等現象，而其他兩組正常。與模型組相比，CTX組、SEB組和SEB-RN組小鼠實體瘤的生長均得到了顯著抑制，表明SEB和SEB-RN均有一定的抗腫瘤作用；與SEB-RN組相比，SEB組小鼠腫瘤抑制率明顯更高，見表2。與模型組相比，CTX組小鼠胸腺、脾臟指數明顯更低，SEB組、SEB-RN組明顯更高，差異均有極顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明SEB和SEB-RN能提高機體免疫功能；SEB組小鼠胸腺、脾臟指數明顯高于SEB-RN組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 體內抑制作用比較Tab 2 Comparison of inhibitory effects in

4 討論

半枝蓮是中醫(yī)臨床上治療惡性腫瘤的常用中藥，很多中醫(yī)處方和成藥中都含有該藥。近代藥理學研究結果表明，半枝蓮具有抗腫瘤、抗病原、抑菌、解熱及保肝等作用，在臨床上應用多年，對肝癌、肺癌、胃癌、直腸癌及鼻咽癌等均有一定的療效。無論是在抑制或殺傷腫瘤細胞方面，還是術后減輕放化療不良反應、改善癥狀和體征及提高生活質量等方面，該藥均發(fā)揮了重要的作用?！冻Ｓ貌菟幹委熓謨浴份d有，該藥“治食道癌、胃癌、子宮癌”。半枝蓮具有資源豐富、價格低廉等優(yōu)點。近年來，隨著提取工藝的不斷提高，半枝蓮的成分也逐漸明確。黃酮類化合物是半枝蓮的次生代謝產物，具有很強的清除自由基的能力，可降低血脂，抑制血小板凝聚、細胞凋亡，同時還有抗病毒、抗腫瘤及抗突變等活性[11]。二萜類化合物也是半枝蓮的主要化學成分，文獻報道，二萜類生物堿具有一定的細胞毒性，能有效抑制多種腫瘤細胞的生長[12]。多糖是半枝蓮的另一類主要化學成分。楊姍姍[5]等采用Sevag法對半枝蓮多糖進行分離純化，并采用苯酚-硫酸法測定其含量，還發(fā)現半枝蓮多糖在體內對S180肉瘤的生長有一定的抑制作用，能夠增加免疫器官的質量。CTX作為臨床廣泛應用的抗腫瘤藥，常作為抗腫瘤試驗的陽性對照品，但其副作用較明顯，包括胃腸道反應、骨髓和免疫功能抑制等，故很少直接用于抗腫瘤治療[13-14]。

石銳[15]等將不同質量濃度的半枝蓮提取物作用于細胞K562，采用MTT法檢測其對K562細胞增殖情況的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測K562細胞上清液中血管內皮生長因子(VEGF)的濃度，采用聚合酶鏈式反應法檢測K562細胞中VEGF mRNA的表達水平，闡釋了其作用機制可能與降低K562細胞VEGF的濃度和下調VEGF mRNA的表達有關。李潔[16]等建立了肝癌H22小鼠血道轉移模型，探討半枝蓮對肝癌H22腫瘤細胞轉移的作用，結果顯示，半枝蓮可增強小鼠的免疫功能，減輕化療藥對其免疫器官的損害，同時能夠明顯降低小鼠肺質量、肺轉移灶數目及肺轉移瘤生長指數，表明半枝蓮對肝癌血道轉移確實有一定的抑制作用。

目前對半枝蓮抗腫瘤作用的研究較多，但很少有關于半枝蓮中藥湯劑中納米顆粒與藥理作用的研究。本研究通過建立人源肝癌細胞SMMC-7721模型和H22荷瘤小鼠動物模型，比較SEB和SEB-RN對肝癌細胞在體內外生長的抑制作用，重點觀察了其對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用、用藥前后小鼠

體質量變化、腫瘤抑制率、胸腺指數及脾臟指數等指標，初步探討SEB的抗腫瘤藥效與湯劑納米顆粒的依賴關系。結果表明，SEB和SEB-RN均具有良好體內外的抗腫瘤作用，體外抗腫瘤試驗中，SEB對SMMC-7721細胞的增殖抑制率明顯高于SEB-RN，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；體內抗腫瘤試驗中，SEB組小鼠的腫瘤抑制率、胸腺及脾臟指數明顯高于SEB-RN組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可推斷，上述結果和中藥藥效與湯劑納米顆粒的依賴關系有關，湯劑中的納米顆粒可促進中藥活性成分發(fā)揮藥理作用，但還需進一步深入研究。

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