王敏 江濤

摘 要：目的 探討細(xì)胞DNA定量分析在不明原因胸水診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集本院2015年9月～2016年3月122例胸腔積液患者抽取胸水，標(biāo)本制片后分別經(jīng)巴氏染色行脫落細(xì)胞學(xué)檢查，F(xiàn)eulgen染色后行細(xì)胞DNA定量分析。結(jié)果 122例胸腔積液中有56例惡性胸腔積液，66例良性胸腔積液。細(xì)胞學(xué)檢測惡性胸水敏感度為82.14%，特異性為98.48%，陽性預(yù)測值97.87%，陰性預(yù)測值86.67%。細(xì)胞DNA定量分析檢測惡性胸水敏感度為80.36%，特異度為90.91%，陽性預(yù)測值88.24%，陰性預(yù)測值84.51%。兩種方法診斷結(jié)果一致性一般（Kappa=0.473，P<0.001），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.0）。結(jié)論 DNA定量分析檢測是一種較敏感而特異的肺癌的篩查技術(shù)，DNA異倍體有望作為良惡性胸水診斷有價(jià)值的標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：胸腔積液；細(xì)胞學(xué)檢查；細(xì)胞DNA定量分析

中圖分類號：R450 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.06.021

文章編號：1006-1959（2018）06-0066-04

Quantitative Analysis of DNA for Diagnosis of Pleural Effusion

WANG Min，JIANG Tao

（Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Abstract：Objective To evaluate the value of DNA quantitative analysis in the diagnosis of unexplained hydrothorax.Methods A total of 122 patients with pleural effusion were collected from our hospital in September 2015～March 2016.After taking the tablets， they were stained by PAP staining and cytological examination.After Feulgen staining， cell DNA was quantitatively analyzed.Results There were 56 cases of malignant pleural effusion and 66 cases of benign pleural effusion in 122 cases of pleural effusion.The sensitivity of malignant pleural effusion was 82.14%，the specificity was 98.48%，the positive predictive value was 97.87%，and the negative predictive value was 86.67%.The sensitivity of DNA in malignant pleural effusion was 80.36%，the specificity was 90.91%，the positive predictive value was 88.24%，and the negative predictive value was 84.51%.The results of the two methods were consistent（Kappa=0.473， P<0.001），and the difference was not statistically significant（P=1.0）.Conclusion DNA quantitative analysis is a sensitive and specific screening technology for lung cancer.DNA aneuploidy is expected to be a valuable marker for the diagnosis of benign and malignant pleural effusion.

Key words：Pleural effusion；Cytological examination；Quantitative analysis of cell DNA

近年來，肺癌已成為全球最主要的癌癥死亡原因，其總患病率為130.2/10萬[1]。惡性胸腔積液為肺癌常見的并發(fā)癥之一，約57%的肺癌患者在初診時(shí)已發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。故胸腔積液的良惡性鑒別在臨床上具有協(xié)助疾病診斷、指導(dǎo)治療的意義。目前臨床上鑒別良惡性胸腔積液常依靠胸水細(xì)胞學(xué)檢查，其主要依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行定性診斷，但該檢查對高度增生的間皮細(xì)胞、增生性間皮細(xì)胞，腫瘤的間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞的鑒別診斷較為困難[3]。目前采用液基細(xì)胞學(xué)檢查（liquid-based cytology，LBC）行脫落細(xì)胞學(xué)檢查，較傳統(tǒng)涂片在病理學(xué)診斷陽性率有所提高[4]。本研究應(yīng)用DNA定量分析（DNA image cytometry，DNA-ICM）檢測胸腔積液中的細(xì)胞異倍體，并與脫落細(xì)胞學(xué)結(jié)果相對比，以探討該檢測方法在良惡性胸腔積液中的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集本院2015年9月～2016年3月胸腔積液標(biāo)本122例，其中男77例，女45例，年齡22～95歲，所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查并結(jié)合臨床診斷明確。全部患者胸腔積液均同時(shí)行脫落細(xì)胞學(xué)檢查和細(xì)胞DNA定量檢測。

1.2方法 每例胸腔積液留取標(biāo)本50 ml，離心涂片，根據(jù)不同檢測方法制片。

1.2.1 DNA定量分析 標(biāo)本中加入肝素抗凝，將標(biāo)本靜止30 min，棄去大部分上清液，取底層沉淀物高速離心后，留取沉淀物涂片，涂片經(jīng)Feulgen染色后再經(jīng)全自動細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（由廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司提供）進(jìn)行掃描處理。對每張玻片上所有細(xì)胞核進(jìn)行掃描測定，標(biāo)準(zhǔn)對照細(xì)胞為同張玻片上的正常細(xì)胞，并檢測細(xì)胞核DNA含量。分析結(jié)果：采用DI（DNA Index，DNA指數(shù)）判定，正常細(xì)胞DI等于1，病變細(xì)胞DI≥2.5，1

1.2.2細(xì)胞學(xué)檢查 留取標(biāo)本行巴氏染色，制作3張細(xì)胞片，經(jīng)病理科醫(yī)生閱片后判定結(jié)果。診斷結(jié)果分為：①未見到癌細(xì)胞；②見到少許異型細(xì)胞；③見到重度不典型異型細(xì)胞；④可疑癌細(xì)胞；⑤見到癌細(xì)胞。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Stastistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)計(jì)算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。

2 結(jié)果

惡性胸腔積液56例，其中非小細(xì)胞肺癌33例包括腺癌29例 鱗癌3例，非小細(xì)胞肺癌未分型1例。小細(xì)胞肺癌8例，臨床診斷肺癌3例。其他組系統(tǒng)腫瘤12例，包括肝癌1例，乳腺癌3例，盆腔惡性腫瘤1例，食管癌1例，腹膜癌1例，血液系統(tǒng)惡性腫瘤2例，胰腺癌1例，腎癌1例，直腸癌1例。良性胸腔積液66例。細(xì)胞學(xué)檢查陰性者占61.48%（75/122），細(xì)胞學(xué)檢查陽性者占38.52%（47/122）。DNA檢查陽性者占41.80%（51/122），DNA檢查陰性者占58.20%（71/122），見表1和圖1。

2.1細(xì)胞DNA定量分析 以DI≥1作為陽性界值計(jì)算，122例胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查，56例惡性胸水中DI經(jīng)分析后診斷為陽性的有45例，66例良性胸水中60例DI值呈陰性。細(xì)胞DNA定量分析鑒別良惡性胸腔積液的敏感度為80.36%，特異度為90.91%，見表2。

2.2細(xì)胞學(xué)檢查 122例胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查，將見到少許異型細(xì)胞、重度不典型異型細(xì)胞、可疑癌細(xì)胞及癌細(xì)胞判定為陽性。56例惡性胸水檢出陽性46例；66例良性胸腔積液中細(xì)胞學(xué)檢查呈陽性1例，敏感度82.14%，特異性98.48%，見表2。

2.3 DNA定量檢測與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果比較 以活檢和臨床證實(shí)的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。在胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢查中，以不典型細(xì)胞、可疑癌細(xì)胞和癌細(xì)胞合計(jì)作為陽性細(xì)胞計(jì)算的脫落細(xì)胞學(xué)檢查的敏感度82.14%，特異性98.48%，陽性預(yù)測值97.87%，陰性預(yù)測值86.67%。細(xì)胞DNA定量分析檢測惡性胸水敏感度為80.36%，特異度為90.91%，陽性預(yù)測值88.24%，陰性預(yù)測值84.51%。將兩種檢測方法的靈敏度結(jié)果進(jìn)行配對卡方檢驗(yàn)（McNemar's test），敏感度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[診斷結(jié)果一致性一般（Kappa=0.473，P<0.001）； 差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.0）]。

3討論

目前，確診晚期肺癌的常見方法有細(xì)胞學(xué)檢查及通過有創(chuàng)檢查獲取病理組織。對于有胸腔積液但不能耐受相關(guān)有創(chuàng)操作檢查的患者，獲得組織標(biāo)本存在一定難度且有較高風(fēng)險(xiǎn)，故細(xì)胞學(xué)檢查在明確診斷時(shí)占較為重要的地位，但其結(jié)果受胸腔積液中細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)變化是否典型以及診斷醫(yī)師的主觀性判斷影響，而細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)是基于細(xì)胞核內(nèi)DNA含量數(shù)值的客觀判斷，可識別標(biāo)本中少數(shù)呈異倍體改變的細(xì)胞。DNA-ICM是目前較為成熟、客觀的檢測方法，通過分析細(xì)胞核內(nèi)DNA含量，希望能早期判斷細(xì)胞是否發(fā)生惡變。該方法已在宮頸癌、食管癌、乳腺癌等腫瘤中有較多研究[5-7]。且有研究表明，細(xì)胞DI值和異倍體細(xì)胞數(shù)的多少與細(xì)胞增殖、癌變程度及預(yù)后相關(guān)[7-9]。

正常細(xì)胞核內(nèi)含有23對染色體，并有固定數(shù)量的DNA含量。細(xì)胞分裂周期由G1期、S期、G2期、M期組成。處于不同分裂周期中細(xì)胞的DNA含量有所差別，故其DI值有所不同。細(xì)胞分裂周期過程中DI值波動在1～2，二倍體細(xì)胞DI值為1，四倍體細(xì)胞DI值為2。 正常情況下，人體中大多數(shù)細(xì)胞為二倍體細(xì)胞，少數(shù)為異倍體細(xì)胞。由于基因丟失、突變、異常擴(kuò)增或染色體移位、融合等導(dǎo)致細(xì)胞DNA含量增加，使細(xì)胞呈異倍體改變[10]。ICM-DNA定量分析系統(tǒng)結(jié)果評判結(jié)合了DI值與DNA定量分布兩指標(biāo)，DI值反映了細(xì)胞DNA平均含量的多少，具有較高精確度，而DNA定量分布在反應(yīng)多個(gè)細(xì)胞的增殖狀態(tài)及異倍體核型有較高靈敏度。

122例不明原因胸腔積液，其中56例惡性胸水均經(jīng)病理診斷及隨訪明確，經(jīng)DNA檢測出陽性45例，細(xì)胞學(xué)檢查陽性46例，經(jīng)配對？字2檢驗(yàn)兩種檢測方法檢測結(jié)果一致，一致性一般。本試驗(yàn)結(jié)果示DNA-ICM對肺惡性胸腔積液的靈敏度（80.36%）與周箴[11]報(bào)道的DNA定量分析在惡性胸水診斷的靈敏度（77.8%）較一致。經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查為陽性的46例標(biāo)本中，DNA分析其中41例為陽性，這可能是由于部分腫瘤為二倍體腫瘤，其腫瘤細(xì)胞無異倍體出現(xiàn)，故DNA-ICM結(jié)果為陰性。56例惡性胸水中有6例細(xì)胞學(xué)檢查及DNA定量檢測均為陰性（3例為小細(xì)胞肺癌，2例為腺癌，1例為臨床診斷肺癌），存在一定的漏診率，考慮其漏診原因與以下原因相關(guān)：①小細(xì)胞肺癌引起胸腔積液原因常與腫瘤壓迫淋巴致淋巴回流障礙相關(guān)，而非腫瘤侵犯胸膜；②部分腫瘤患者合并有多種基礎(chǔ)疾病，如肝硬化、低蛋白血癥、心力衰竭，從而出現(xiàn)胸腔積液；③其胸腔積液中細(xì)胞數(shù)過少。56例惡性胸腔積液中有4例細(xì)胞學(xué)檢查呈陰性，但DNA定量結(jié)果為陽性?？紤]可能與細(xì)胞癌變時(shí)DNA的含量變化較細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化較早有關(guān)。

在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中，均可侵及胸膜引起惡性胸腔積液[12]。而不同來源的轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有著不同表現(xiàn)，故通過常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查診斷轉(zhuǎn)移性腫瘤存在一定難度。本試驗(yàn)中56例惡性胸水，其中肺外轉(zhuǎn)移性腫瘤占12例。肺外轉(zhuǎn)移腫瘤侵及胸膜的細(xì)胞學(xué)陽性率為50.00%（6/12），ICM-DNA陽性率為75.00%（9/12），提示ICM-DNA在肺外轉(zhuǎn)移性腫瘤檢出率上有所提高，該檢查方法對以胸腔積液為首發(fā)癥狀的肺外轉(zhuǎn)移腫瘤患者存在一定的指導(dǎo)意義。

本試驗(yàn)采用的細(xì)胞學(xué)檢查手段為液基細(xì)胞學(xué)，該制片方法具有簡單、易操作，可以去除標(biāo)本中干擾結(jié)果的紅細(xì)胞、黏液及炎細(xì)胞，以獲得較高質(zhì)量且數(shù)量足夠的細(xì)胞。同時(shí)因其制片為程序化，可重復(fù)性好，避免人為因素致細(xì)胞擠壓出現(xiàn)腫瘤假象影響檢查結(jié)果[13]。有研究示，LBC在肺癌胸腔積液中的檢出率優(yōu)于傳統(tǒng)涂片[14]。既往有多個(gè)研究[15，16]報(bào)道ICM-DNA在不明顯原因胸水中的陽性檢出率較傳統(tǒng)細(xì)胞涂片檢查高，但本試驗(yàn)結(jié)果表明，ICM-DNA與LBC兩種檢測方法檢測結(jié)果一致，可能與細(xì)胞學(xué)檢查方法改進(jìn)有關(guān)。

細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果受病理醫(yī)師主觀評價(jià)影響較大，而ICM-DNA較胸水細(xì)胞學(xué)檢查操作簡單，重復(fù)性好，受操作者影響因素較少，為一客觀評價(jià)指標(biāo)，靈敏度及特異度較高，DNA含量的測定為診斷惡性腫瘤提供了除細(xì)胞學(xué)形態(tài)以外的特有的生物學(xué)信息，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)的不足，提高不明胸腔積液的陽性檢出率。且有研究表明，細(xì)胞DNA定量檢測在痰液、纖維支氣管鏡刷片及支氣管肺泡灌洗液涂片等不同來源標(biāo)本診斷肺癌時(shí)敏感度均較高于細(xì)胞學(xué)檢查[17-19]。因而細(xì)胞DNA定量檢測有望成為惡性胸水診斷的標(biāo)志物。

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收稿日期：2018-3-5；修回日期：2018-3-21

編輯/成森