蒙傳任，林稚鳳，邢紅宇

（1.海南省海口市第四人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，海南 ?？?571100；2.海南省中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，海南 海口 570311）

細(xì)菌能黏附于物體表面，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)將自身包裹，形成生物膜。生物膜狀態(tài)下的細(xì)菌具有更強(qiáng)的生存能力，能抵抗環(huán)境中的各種不利因素[1]。此外，生物膜還能抑制抗生素的滲透作用，極大的增加了細(xì)菌的耐藥性[2]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）被認(rèn)為是能導(dǎo)致人體生物膜相關(guān)感染的最具危害性的病原菌，常導(dǎo)致一系列疾病，如：尿路感染、腎臟感染和肺囊性纖維化等[3]。近年來，隨著P.aeruginosa耐藥性的增高，傳統(tǒng)抗生素往往難以根除已形成的生物膜，因此，從自然界中發(fā)掘新的抗菌藥物已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

牡荊素（Vitexin,Vite）是一種分離自牡荊屬植物的一種多酚類化合物，具有一定的抑制細(xì)菌生物膜形成的能力。然而，單獨(dú)使用Vite并不能達(dá)到最佳抗生物膜效果[4]。因此，本研究詣在探討Vite與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合使用對(duì)P.aeruginosa生物膜的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與培養(yǎng)條件P.aeruginosa標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1購買自美國ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株保存庫，于-80℃冰箱保存，使用前室溫解凍，并在血瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線接種，過夜培養(yǎng)后調(diào)取單個(gè)菌落劃線接種傳2代以獲得相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)的菌株。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 TSB肉湯和Muller-HintonⅡ（MH Ⅱ）肉湯均購自美國BD公司，Vite、頭孢他啶（CAZ）、環(huán)丙沙星（CIP）、左旋氧氟沙星（OFLX）和慶大霉素（GEN）均購自美國Sigma公司，結(jié)晶紫顆粒購自天津市化學(xué)試劑一廠，96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板和多功能酶標(biāo)儀等設(shè)備均由海南省?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感實(shí)驗(yàn) 用MH Ⅱ肉湯倍比稀釋各抗生素儲(chǔ)備液后分別加入100 μl至96孔板中的各孔，作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)分別設(shè)置陰性對(duì)照組（未加抗生素僅加培養(yǎng)基和細(xì)菌）和對(duì)照組（僅加培養(yǎng)基）。挑取血瓊脂平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)的單個(gè)菌落，用生理鹽水調(diào)為0.5麥?zhǔn)蠞岫?，再用MH Ⅱ肉湯按1∶20進(jìn)行稀釋，分別向加了抗生素的各孔中加入10 μl已稀釋好的菌懸液，使最終實(shí)驗(yàn)菌濃度約為5×105CFU/ml。置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育16 h，讀取結(jié)果。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）終點(diǎn)即為肉眼所見能完全抑制細(xì)菌生長的抗菌藥物的最高稀釋度[5]。

1.2.2 浮游菌生長曲線的繪制 PAO1于血瓊脂平板過夜培養(yǎng)后，調(diào)取單個(gè)菌落，用生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?組分別加入系列已配備好的用LB肉湯稀釋的Vite溶液中（62.5、125.0、250.0 μg/ml），于37℃恒溫?fù)u床180 r/min搖菌培養(yǎng)，每隔8 h，各吸取200 μl菌懸液于96孔板中，測(cè)量600 nm處的吸光密度值，連續(xù)監(jiān)測(cè)24 h，繪制時(shí)間-生長曲線。

1.2.3 生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn) 用LB肉湯倍比稀釋Vite母液至實(shí)驗(yàn)濃度（1 000.00～15.63 μg/ml），分別加入198 μl至96孔板中的各孔，備用。PAO1于血瓊脂平板培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，調(diào)取單個(gè)菌落于裝有LB肉湯的離心管中過夜搖菌培養(yǎng)，用生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)為約1麥?zhǔn)蠞岫?。再分別加2 μl菌懸液于備用的96孔板中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置孵育24 h后，棄去浮游菌，用生理鹽水輕洗2遍，再分別加入200 μl 0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，棄去未與板壁細(xì)菌結(jié)合的結(jié)晶紫溶液，并用生理鹽水輕洗3遍后，分別加入200 μl無水乙醇，以溶解與細(xì)菌結(jié)合的結(jié)晶紫，并于570 nm處進(jìn)行比色[6]。

1.2.4 Vite與抗生素聯(lián)用對(duì)生物膜的影響 用LB肉湯分別稀釋Vite和各抗生素母液至實(shí)驗(yàn)濃度，使Vite與抗生素混合后Vite的終濃度為31.25 μg/ml，而CIP、GEN、CAZ和OFLX的終濃度分別為0.25、0.50、0.25和1.00 μg/ml。其余部分同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphePad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組獨(dú)立樣本的差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析，若方差齊則兩兩間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vite對(duì)PAO1浮游菌生長的影響

不同濃度Vite與陰性對(duì)照組比較，250.0 μg/ml的Vite能部分抑制PAO1浮游菌的生長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=168.800，P=0.000）。實(shí)驗(yàn)組Vite作用16和24 h可分別使細(xì)菌的生長量（OD600nm）從（0.35±0.01）和（0.49±0.02）減少到（0.17±0.03）和（0.26±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.160和3.110，均P=0.000）。而當(dāng)Vite的濃度≤125.0 μg/ml時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)組PAO1的生長無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 Vite抑制PAO1生物膜的形成

圖1 Vite對(duì)PAO1浮游菌生長的影響

當(dāng)Vite的濃度為31.25 μg/ml，能使實(shí)驗(yàn)組PAO1生物膜的形成量從100%減少到（80.00±4.62）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.428，P=0.002）。且隨著Vite的濃度增高，其抑制生物膜的能力不斷增強(qiáng)。當(dāng)Vite的濃度上升至1 000 μg/ml時(shí)，幾乎能完全抑制實(shí)驗(yàn)組PAO1生物膜的形成。而Vite的濃度≤125.0 μg/ml時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)組PAO1浮游菌的生長并無影響（見圖1），因此，Vite抑制PAO1生物膜形成的作用并非完全由其抑制浮游菌生長所導(dǎo)致。見圖2。

2.3 Vite與抗生素協(xié)同抑制PAO1生物膜的形成

圖2 Vite對(duì)PAO1生物膜的抑制作用

CAZ、CIP、GEN和OFLX的MIC值分別為0.5、0.5、2.0和8.0 μg/ml。對(duì)照組、CAZ組、Vite組、CAZ+Vite組的生物膜總量分別為（100.0±0.0）%、（99.9±3.3）%、（82.0±3.2）%、（39.4±5.3）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=199.00，P=0.000）；對(duì)照組、CIP組[（97.4±4.3）%]、Vite組、CIP+Vite組[（40.3±3.1）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=237.4，P=0.000）；對(duì)照組、GEN 組 [（98.9±3.9）%]、Vite組、GEN+Vite組[（23.3±4.1）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=422.70，P=0.000）；對(duì)照組、OFLX 組 [（87.3±5.2）%]、Vite 組、OFLX+Vite組[（50.2±3.1）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=61.04，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，Vite組較對(duì)照組降低（P＜0.05）；各聯(lián)合組較對(duì)照組和Vite組降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Vite與抗生素聯(lián)用對(duì)PAO1生物膜形成的影響

3 討論

近年來，細(xì)菌生物膜的感染率不斷增加，隨著而來的高耐藥率給臨床診療帶來極大的不便。傳統(tǒng)的抗生素往往難以完全根除體內(nèi)的生物膜，而傳統(tǒng)抗生素與新型抗生物膜藥物聯(lián)合應(yīng)用已成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究通過96孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法半定量分析，探討Vite的抑制標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1生物膜的能力，并進(jìn)一步探討其與抗生素CAZ、GEN、CIP和OFLX的聯(lián)合應(yīng)用效果。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Vite濃度≥31.25μg/ml時(shí)能抑制PAO1生物膜的形成，且隨著濃度增高，抑膜能力增強(qiáng)，有明顯的劑量依賴性。且當(dāng)Vite與抗生素聯(lián)用時(shí)，有明顯的協(xié)同抑制PAO1生物膜形成的作用。Vite是一種提取自牡荊屬的多酚類化合物。有研究表明，Vite還具有抵抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的作用[7]。然而，其具體機(jī)制還未明確。多酚類化合物具有細(xì)菌群體密度感應(yīng)（quorum sensing,QS）系統(tǒng)抑制劑的作用。QS系統(tǒng)是細(xì)菌間進(jìn)行交流的信號(hào)系統(tǒng)，調(diào)控著生物膜的形成和分散。P.aeruginosa的QS主要包括2大系統(tǒng)，即：Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)。Las系統(tǒng)主要包括LasI/R雙組份系統(tǒng)，Rhl系統(tǒng)主要包括LasI/R系統(tǒng)。細(xì)菌相互聚集時(shí)，自身能分泌一些信號(hào)分子，當(dāng)這些信號(hào)分子濃度升高達(dá)到一定的閾值時(shí)，能與Las和Rhl系統(tǒng)的相應(yīng)受體結(jié)合，通過信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控下游生物膜相關(guān)基因的表達(dá)或抑制，進(jìn)而對(duì)生物膜的形成進(jìn)行調(diào)控[8]。多酚類化合物可對(duì)QS系統(tǒng)進(jìn)行干擾，抑制QS系統(tǒng)的正常調(diào)控功能[9]，從而抑制生物膜相關(guān)基因表達(dá)而抑制生物膜的形成。生物膜的形成主要還受到第二信使環(huán)鳥苷二磷酸（c-di-GMP）的調(diào)控。高濃度的c-di-GMP能促進(jìn)細(xì)菌黏附因子的表達(dá)，從而促進(jìn)菌體的附著與生物膜的形成。而低濃度的c-di-GMP可以增強(qiáng)菌體的運(yùn)動(dòng)能力及毒素的表達(dá)，而抑制生物膜的形成[10]。因此，Vite的作用機(jī)制有可能是通過抑制細(xì)菌體內(nèi)c-di-GMP的形成而發(fā)揮作用。

不合理使用抗生素，常使體內(nèi)殘存亞抑菌濃度劑量的藥物。這種亞抑菌濃度的抗生素長期存在時(shí)，不但不能有效殺滅細(xì)菌，反而還能促進(jìn)細(xì)菌的突變和耐藥性的增加。而生物膜的耐藥性比相應(yīng)的浮游菌要大，單一的抗生素使用往往難以根除生物膜。而Vite特有的抑制生物膜形成的作用使其與抗生素聯(lián)用時(shí)有協(xié)同抑制生物膜形成的作用，從而可以一定程度上抑制亞抑菌濃度抗生素帶來的副作用。

總而言之，Vite能抑制P.aeruginosa生物膜的形成，且當(dāng)其與抗生素CIP、CAZ、GEN和OFLX聯(lián)用使有協(xié)同作用。有望成為臨床治療細(xì)菌生物膜的一線用藥。

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