廖明媚，王成志，肖平，趙勁風(fēng)，潘一峰

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410008；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖南 長沙 410008）

慢性鉛中毒一種職業(yè)病和流行病，現(xiàn)代城市化和工業(yè)化對環(huán)境的污染，使人們血鉛水平普遍偏高[1]。鉛能對人體神經(jīng)、造血、消化、泌尿等系統(tǒng)造成不同程度的損害，能通過血腦屏障，鉛超標(biāo)嚴(yán)重影響兒童的智力發(fā)育[2]，使其學(xué)習(xí)和記憶能力下降。腸道是非職業(yè)性鉛暴露時(shí)鉛吸收的主要途徑。鉛入人體后，被吸收到血液循環(huán)中，主要貯積在骨組織中[3]，肝細(xì)胞對鉛具有主動通透作用，可從血漿中攝取鉛而排入膽汁，膽汁中的鉛含量可達(dá)血中的40～100倍。目前西醫(yī)傳統(tǒng)驅(qū)鉛方法是使用螯合劑如依地酸二鈉鈣等，但是其通過靜脈給藥特異性差，排鉛同時(shí)非特異性地排泄內(nèi)源性必需微量元素及維生素，干擾機(jī)體正常生理和生化功能，劑量大時(shí)對腎臟的重吸收功能有影響[4]。有研究表明[5]，碳酸鈣的除鉛效果隨其粒徑的減小而增強(qiáng)，納米碳酸鈣的除鉛效果與口服除鉛藥物二巰基丁二酸的效果基本相同，且不增加腎臟負(fù)擔(dān)[6]，但未改性的納米碳酸鈣具有很強(qiáng)的表面極性，表面能較高，較多納米碳酸鈣粒子聚集在一起形成團(tuán)聚體[7]，影響其在有機(jī)體中的相容性和分散性，導(dǎo)致驅(qū)鉛效果降低。本文利用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）和聚丙烯酸鈉（polyacrylate sodium,PAAS）對球形納米碳酸鈣進(jìn)行表面改性，以提高驅(qū)鉛效率。可進(jìn)一步制成口服制劑，直接定位十二指腸緩釋置換排鉛，阻斷鉛腸肝循環(huán)，不增加腎臟負(fù)擔(dān)而完成除鉛過程。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 納米碳酸鈣（山西芮城華新納米材料有限公司），無水碳酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠），無水氯化鈣（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA；國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），十二水合磷酸氫二鈉、PEG（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），PAAS（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），恒溫磁力攪拌器（HI-3，金壇市醫(yī)療儀器廠），真空干燥箱（DZF型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），納米粒度與電位分析儀（英國Malvern 儀器公司），超速冷凍離心機(jī)（德國Heraeus公司），超聲波破碎儀（美國Fisher Scientific公司），Tecnai G2 Spirit TWIN透射電鏡（美國FEI公司），S-3400N掃描電子顯微鏡（日本株式會社日立高新技術(shù)公司），D/MAX-3A型X射線衍射儀（日本理學(xué)公司），Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀（美國Thermo Electron Scientific公司），AA320型原子吸收分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司分析儀器總廠）。

1.2 方法

1.2.1 微米碳酸鈣制備 在2 mol/L Na2CO3溶液25 ml中攪拌下加入2 mol/L CaCl2溶液25 ml，充分反應(yīng)30 min后，離心收集沉淀，雙蒸水洗滌3次，無水乙醇洗滌3次，干燥后即可得到微米碳酸鈣粉末。

1.2.2 改性納米碳酸鈣制備 在2 mol/L Na2CO3溶液25 ml中加入EDTA（2%，w/w-Na2CO3）和Na2HPO4（2%，w/w-Na2CO3），反應(yīng)10 min；再將2 mol/L的含有PEG4000（1%，w/w-CaCl2）的CaCl2溶液25 ml緩慢滴加到上述Na2CO3混合溶液中，充分反應(yīng)30 min后，加入PAAS溶液（1%，w/w-CaCl2）50 ml，間斷超聲10 min；室溫靜置72 h，離心收集沉淀，雙蒸水洗滌3次，無水乙醇洗滌3次，干燥后即可得到改性納米碳酸鈣粉末。

1.2.3 配制模擬十二指腸液 取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 ml使溶解，用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋成1 000 ml，即得模擬十二指腸液。

1.2.4 模擬腸液中鉛離子濃度的測定 精密稱量定量醋酸鉛固體分別加入至100 ml模擬腸液中，使鉛離子的終濃度為500 μg/L。精密稱取納米碳酸鈣、改性納米碳酸鈣、微米碳酸鈣各40 mg分別加入到上述含不同鉛離子濃度的模擬腸液中，37℃恒溫水浴，低速攪拌（100 r/min），按一定時(shí)間間隔，精密抽取2 ml溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液用原子吸收光譜儀測定鉛離子濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 制備的改性納米碳酸鈣的結(jié)構(gòu)表征

所制備的改性納米碳酸鈣用粒徑與電位分析、掃描電鏡（scanning electron microscope,SEM）、透射電鏡（transmission electron microscope,TEM）、X射線粉末衍射法（X-ray powder diffractometry,XRD）、紅外光譜（infra-red,IR）分析等表征手段對其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行檢測。粒徑與電位分析顯示制備的改性納米碳酸鈣平均粒徑（91.28±10.2）nm，平均電位為（-28.8±6.43）mV（見圖 1）。

掃描電鏡和透射電鏡顯示改性納米碳酸鈣顆粒為單分散狀態(tài)，顆粒形態(tài)為球形，顆粒分散均勻，不產(chǎn)生團(tuán)聚效應(yīng)（見圖2）。利用紅外光譜結(jié)合掃描電鏡和XRD同時(shí)表征不同晶型的碳酸鈣，根據(jù)未知物紅外光譜中吸收峰的強(qiáng)度、位置和形狀，推斷該未知物的結(jié)構(gòu)，鑒定不同的晶型。

圖1 改性納米碳酸鈣電位檢測結(jié)果

圖2 改性納米碳酸鈣圖 （×500 nm）

紅外光譜出現(xiàn)的特征吸收峰為1 436.73、1 084.40、876.97及745.01 cm分別對應(yīng)碳酸鈣中C-O反對稱伸縮振動、CO3的對稱伸縮、CO32-面外變形振動和O-C-O的面內(nèi)變形振動。其不僅在1 084.40、876.97出現(xiàn)方解石碳酸鈣的特征吸收峰，還在745.01出現(xiàn)球霰石的特征吸收峰。見圖3。

XRD顯示制備的改性納米碳酸鈣混合物中有方解石（104）的衍射峰和球霰石（110）的衍射峰，說明PEG有利于加強(qiáng)球霰石碳酸鈣的穩(wěn)定性（見圖4）。C-O反對稱伸縮振動吸收峰出現(xiàn)在1 490.01和1 436.73 cm，而沒有PAAS和PEG存在時(shí)生成的碳酸鈣的在1 421 cm，相比較而言出現(xiàn)位移，且吸收峰變寬，這也是因?yàn)镻AAS和PEG存在時(shí)碳酸鈣晶體出現(xiàn)晶格畸變，而導(dǎo)致C-O反對稱伸縮振動出現(xiàn)藍(lán)移。PAAS和PEG對碳酸鈣晶體的成核與生長有調(diào)控作用，兩者更有利于球霰石碳酸鈣粒子的穩(wěn)定性。

2.2 3組碳酸鈣在模擬十二指腸液中的除鉛效果

在模擬十二指腸液中檢測改性納米碳酸鈣、納米碳酸鈣和微米碳酸鈣的除鉛效果，處理1、2、3、4 h后的鉛離子濃度比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的除鉛效果有差異（F=26.08，P=0.000）；②3組碳酸鈣除鉛效果有差異（F=11.16，P=0.028）；③變化趨勢無差異（F=1.19，P=0.337）。見附表。

與微米碳酸鈣比較，改性納米碳酸鈣粒徑小，分散好，比表面積大，起效快，效果更明顯，4 h能將鉛離子濃度降至30 μg/L以下，除鉛效果更優(yōu)于未改性納米碳酸鈣（t=3.603，P=0.023）。見圖5。

圖3 改性納米碳酸鈣的紅外光譜

附表 3組各時(shí)間的體外除鉛效果比較 （μg/L，±s）

附表 3組各時(shí)間的體外除鉛效果比較 （μg/L，±s）

組別 1 h 2 h 3 h 4 h改性納米碳酸鈣 282.6±12.5 115.0±10.0 63.3±7.5 21.0±4.0納米碳酸鈣 315.2±18.7 132.6±13.5 82.9±9.1 36.0±5.5微米碳酸鈣 389.3±21.0 311.6±22.6 276.0±24.4 257.2±18.0

圖4 改性納米碳酸鈣的XRD分析圖

圖5 3種碳酸鈣除鉛效果比較

3 討論

碳酸鈣價(jià)格低廉，來源廣泛，主要用于工業(yè)填充劑、食品膨松劑、飼料強(qiáng)化劑等，由于碳酸鈣是一種無毒且生物相容性良好的材料，因此在醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，如口服補(bǔ)鈣劑、制酸劑及酸中毒時(shí)的解毒劑等。納米級碳酸鈣的制備主要采用機(jī)械粉碎法、化學(xué)反應(yīng)沉淀法、碳化法制備，用于人體要求其pH固定，粒徑均勻分散好，所用原料對人體無害。

碳酸鈣屬ABO3型晶體，因堆積方式不同，以方解石型、文石型、球霰石型和非晶態(tài)等多種形式存在。其中方解石是熱力學(xué)上最穩(wěn)定的晶型，在沒有任何物質(zhì)的影響的自然條件下，最終總是生成方解石晶型[8]。方解石晶體除了常見的菱形六面體外，在有機(jī)質(zhì)存在下也能形成其他形態(tài)的方解石，有機(jī)質(zhì)參與結(jié)晶過程進(jìn)入碳酸鈣的晶胞，導(dǎo)致晶格的缺陷和畸變[9]，同時(shí)有機(jī)質(zhì)存在情況下可形成較為穩(wěn)定的球霰石晶型[10]。EDTA和可溶性無機(jī)磷酸鹽混合物可吸附在納米粒子表面，提高納米粒子的表面電荷，通過靜電排斥提高粒子的分散性[11]，混合物作為晶形調(diào)節(jié)劑可得到表面積較大的納米碳酸鈣。分散劑——PEG具有極性，可吸附在納米碳酸鈣的特定晶面上，有利于球霰石晶型的形成與穩(wěn)定[12]。PEG可在顆粒表面形成吸附層之間的位阻效應(yīng)，增加其在人體內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定性和緩釋性，但是分子量過大可使降低位阻效應(yīng)，增加漿液黏度。但是單用PEG所得的納米碳酸鈣電位絕對值小，隨著放置時(shí)間延長易產(chǎn)生團(tuán)聚。分散劑——PAAS可使納米粒子的平均粒徑減小，但是質(zhì)量過大時(shí)反而造成納米粒子分散穩(wěn)定性降低[13]，PAAS在納米碳酸鈣顆粒表面形成定向排列的單分子層吸附，降低表面能，提高靜電排斥，但是當(dāng)界面吸附達(dá)到飽和，PAAS通過碳?xì)滏I的疏水作用締合成膠團(tuán)，使得黏度上升。在納米碳酸鈣中添加這2種分散劑，既具有靜電穩(wěn)定又具有空間位阻效應(yīng)，增加電位絕對值，提高顆粒間的排斥力，使得納米碳酸鈣的分散性更好、穩(wěn)定性更強(qiáng)。為控制粒子粒徑與納米碳酸鈣的粉體比例，選用PEG和PAAS的質(zhì)量為氯化鈣質(zhì)量的1%，可以得到良好分散效果而不形成膠團(tuán)。

本文制備的改性納米碳酸鈣在模擬腸液中4 h左右能將鉛離子濃度降低至30 μg/L以下，與普通納米碳酸鈣驅(qū)鉛速率基本相同，也與徐幸民[5]、劉雨濤[6]等報(bào)道的非改性納米碳酸鈣驅(qū)鉛速率基本相同。由于納米碳酸鈣長時(shí)間放置容易沉淀、形成團(tuán)聚體，影響其驅(qū)鉛效率，將納米碳酸鈣經(jīng)過改性之后，提高其穩(wěn)定性，從而提高驅(qū)鉛效率。本文制備的改性納米碳酸鈣是在晶型調(diào)節(jié)劑和PAAS、PEG 2種分散劑存在下，由碳酸鈉與氯化鈣均質(zhì)攪拌，發(fā)生化學(xué)沉淀反應(yīng)制成，得到大小適宜、分散均勻、電位適中的球形納米粒。改性納米碳酸鈣粒徑大小合適，分布窄，不含有毒物質(zhì)和堿性物質(zhì)，適用于制成人體腸道除鉛的藥劑，定位十二指腸緩釋置換鉛離子，形成不被腸道分解和吸收的碳酸鉛，隨糞便排出體外，所置換出的鈣離子既能起到機(jī)體補(bǔ)鈣的需要，還可阻止鉛在腸道內(nèi)的滯留與吸收。

綜上所述，經(jīng)PEG和PAAS改性后的納米碳酸鈣性質(zhì)穩(wěn)定，無毒，可進(jìn)一步制成口服制劑應(yīng)用于人體腸道除鉛。

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