鄒開(kāi)力，唐永祥，周明，李建，胡碩

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 PE中心，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

前列腺癌是老年男性常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率都很高。在美國(guó)，老年男性的健康受到前列腺癌的嚴(yán)重威脅，其發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的首位。根據(jù)美國(guó)最新數(shù)據(jù)顯示，2016年美國(guó)前列腺癌新發(fā)病例以及死亡人數(shù)分別為180 890人和26 120人，占男性癌癥死亡率的第2位[1]。在歐洲，其死亡率也位居癌癥死亡率的第3位。在中國(guó)，隨著老齡化時(shí)代的到來(lái)、飲食習(xí)慣的變化，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，增長(zhǎng)速度超過(guò)歐美。在前列腺癌診治過(guò)程中，如何早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，以及對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行準(zhǔn)確的分期、分級(jí)判斷對(duì)于治療方案制定和預(yù)后及時(shí)評(píng)估都有著重要的意義。由于前列腺癌的腫瘤異質(zhì)性，超聲和MRI等常規(guī)的影像檢查方法不能對(duì)疾病的分期尤其治療后復(fù)發(fā)再分期進(jìn)行有效地評(píng)估[2-3]。近年來(lái)，隨著分子影像技術(shù)不斷發(fā)展，針對(duì)腫瘤特異性生物靶點(diǎn)和代謝途徑的特點(diǎn)，進(jìn)行精準(zhǔn)診斷和臨床分期，受到研究者和臨床專(zhuān)家的的重視和認(rèn)可。神經(jīng)降壓素（Neurotensin,NT）是一種由13個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，有降壓、鎮(zhèn)痛、刺激垂體腺分泌激素、降低體溫、調(diào)節(jié)情緒、調(diào)節(jié)胃腸等功能。近年的研究表明[4]，NT在多種腫瘤組織和細(xì)胞中有高表達(dá)，NT及其主要受體NTR1介導(dǎo)的信號(hào)途徑對(duì)于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程有明顯的促進(jìn)作用。NT有3種受體，神經(jīng)降壓素受體1（NTR1）、神經(jīng)降壓素受體2（NTR2）和神經(jīng)降壓素受體3（NTR3），其中NTR1被證明在前列腺癌高表達(dá)，而在相應(yīng)正常前列腺組織中則很少表達(dá)[5-6]，此外，NT通過(guò)NTR1發(fā)揮其促腫瘤增殖作用，且3種受體中NTR1與配體NT的親和力最強(qiáng)。本研究制備一種靶向NTR1的新型PET分子顯像劑18FNT，用前列腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)和荷瘤裸鼠生物分布實(shí)驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證其對(duì)NTR1的靶向性，為今后的前列腺癌個(gè)體化靶向在體顯像及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人前列腺癌細(xì)胞系PC3細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，裸鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)公司。

1.2 設(shè)備與試劑

1.2.1 設(shè)備 Qilin回旋加速器（美國(guó)通用電氣公司），F(xiàn)astlab FN型正電子藥物合成模塊（美國(guó)通用電氣公司），1260型高效液相色譜儀、Biocan Flow Count放射性檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司），Bioscan system 2000型薄層色譜掃描儀（美國(guó)Bioscan公司），HH6603型γ放射免疫分析儀（北京核海高技術(shù)有限公司），EX125DZH型電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）。

1.2.2 試劑和材料 NT（前體）（美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)惠贈(zèng)），乙腈（美國(guó)TEDIA公司），QMA（Sep Pak Light）、C18（Sep Pak Plus）（ 美 國(guó) Waters公 司 ），色譜柱[德國(guó)MN公司VP NUCLEOSIL 100-7-C18（5μm，16×250mm）]，Millex GS 0.22μm 除菌過(guò)濾器（美國(guó)Millipore公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.118F-NT的制備 取300μg前體NT用1ml乙腈溶解，加入500μl pH=4的醋酸緩沖液和30μl 2mmol氯化鋁AlCl3后轉(zhuǎn)移到模塊反應(yīng)管中。18F-（700mCi）經(jīng)0.3ml 0.9%氯化鈉NaCl溶液淋洗到反應(yīng)管后80℃反應(yīng)10 min，隨后體系經(jīng)HPLC純化（30%乙腈）并收集產(chǎn)品峰至中轉(zhuǎn)瓶，最后再經(jīng)固相萃取得最終無(wú)色澄清產(chǎn)品注射液（60mCi）。

1.3.218F-NT的質(zhì)控 用pH試紙檢測(cè)18F-NT的pH值。取0.5ml稀釋后的產(chǎn)品溶液（0.2mCi）和0.5ml NT前體溶液分別置于不同的進(jìn)樣瓶中，用HPLC法分析產(chǎn)品純度，以0.1% TFA、30∶70（體積比）的乙腈∶水體系做流動(dòng)相為30%乙腈溶液。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人前列腺癌細(xì)胞PC3置于10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前以1×105個(gè)/孔將細(xì)胞種入12孔板中，每孔加2 ml RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn) 取培養(yǎng)PC3細(xì)胞的12孔板，每孔約含1×106個(gè)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，做PC3的18F-NT細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)。分3組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別為實(shí)驗(yàn)組、阻斷組和對(duì)照組（游離18F離子）。具體步驟如下：①培養(yǎng)板中的細(xì)胞去上清液，用PBS洗滌3次。②每孔加0.5 ml培養(yǎng)液，阻斷組加入濃度為1 000 μg/ml的NT 0.2 ml，其他兩組加0.2 ml PBS緩沖液，室溫25℃下孵育30 min。③實(shí)驗(yàn)組、阻斷組分別加入放射性活度濃度為0.185 MBq/ml的18F-NT 4 ml，對(duì)照組加入同等放射性活度濃度的游離18F 4 ml，每孔放射性活度0.74 MBq，室溫25℃下孵育60 min。④吸取上清液，用PBS緩沖液洗滌3次，以去除細(xì)胞外放射性物質(zhì)。洗滌完畢后，每孔加入1 mol/ml的NaOH 0.5 ml裂解細(xì)胞，將每孔物質(zhì)移入試管。⑤用γ計(jì)數(shù)儀讀取每管放射性計(jì)數(shù)值。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.5.1 復(fù)制動(dòng)物模型 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3（細(xì)胞消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度接近于1×107個(gè)/ml）接種0.2ml于裸鼠頸背部皮下，待腫瘤直徑0.8～1.0cm時(shí)用于生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn)。

1.5.218F-NT生物學(xué)分布 實(shí)驗(yàn)6只PC3荷瘤裸鼠，隨機(jī)分成兩組（每組3只），實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射0.2ml生理鹽水，阻斷組尾靜脈注射0.2ml的NT，30min后每只裸鼠尾靜脈注射濃度為37MBq/ml的18F-NT 0.2ml。1h后摘除眼球取血，用脫臼法處死小鼠。分離腫瘤、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、小腸、肌肉、骨、肺、腦等器官組織，分別稱(chēng)重，測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算%ID/g。

1.5.3 HE染色 將分離出的PC3腫瘤組織以及湘雅醫(yī)院病理科所取正常前列腺組織，用中性甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后切片，對(duì)切片行常規(guī)HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 18F-NT質(zhì)量控制及穩(wěn)定性

HPLC分析結(jié)果顯示，18F-NT的出峰時(shí)間為14 min，標(biāo)記率為8.6%，標(biāo)記后6 h放化純?nèi)愿哌_(dá)99%。

2.2 18F-NT細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

孵育1 h后，PC3細(xì)胞系1h18F-NT計(jì)數(shù)值：實(shí)驗(yàn)組（5825.00±1074.52）/min，阻斷組（1941.66±173.58）/min，對(duì)照組（170.33±56.59）/min。實(shí)驗(yàn)組是阻斷組的3倍，兩組間比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.227，P=0.003）。實(shí)驗(yàn)組約是對(duì)照組的34.34倍，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.102，P=0.001）。

2.3 18F-NT在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布

兩組在注射18F-NT后1 h的生物學(xué)分布顯示（見(jiàn)表1）：實(shí)驗(yàn)組、阻斷組的血液攝取值分別為（0.10±0.06）和（0.14±0.11）%ID/g，在兩組中均較低，說(shuō)明18F-NT在血液中清除快。腎臟攝取較高，實(shí)驗(yàn)組和阻斷組分別為（0.84±0.20）和（0.76±0.46）%ID/g，表明該標(biāo)志物主要經(jīng)腎臟排泄。實(shí)驗(yàn)組腫瘤和阻斷組移植瘤放射性攝取差異明顯，分別為（1.02±0.49）和（0.21±0.03）%ID/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.815，P=0.049）。18F-NT在其他各正常組織器官的分布均低于腫瘤（見(jiàn)圖1和表2）。表2中，腫瘤/腎臟的T/NT值為（1.29±0.83），因?yàn)榉派湫运幬飶哪I臟排出。腫瘤與其余各正常組織器官的比值T/NT均大于6，其中腫瘤/肌肉的T/NT為（6.97±1.44），說(shuō)明注射后1 h的放射性本底較低；腫瘤/腦的T/NT最高，為（38.27±19.9），說(shuō)明腦組織攝取最少。

表1 瘤鼠體內(nèi)注射18F-NT后1 h體內(nèi)分布 （n=3，%ID/g，±s）

表1 瘤鼠體內(nèi)注射18F-NT后1 h體內(nèi)分布 （n=3，%ID/g，±s）

注：%ID/g經(jīng)時(shí)間衰減校正

組別 血液 心臟 肝臟 脾臟 腎臟實(shí)驗(yàn)組 0.10±0.06 0.10±0.10 0.06±0.007 0.05±0.01 0.84±0.20阻斷組 0.14±0.11 0.08±0.05 0.08±0.07 0.16±0.24 0.76±0.46 t值 -0.489 0.283 -0.642 -0.831 0.279 P值 0.650 0.791 0.556 0.453 0.794組別 肌肉 骨 腸 腦 肺 腫瘤實(shí)驗(yàn)組 0.15±0.07 0.16±0.14 0.18±0.069 0.03±0.019 0.13±0.03 1.02±0.49阻斷組 0.09±0.11 0.06±0.04 0.17±0.22 0.04±0.07 0.23±0.10 0.21±0.03 t值 0.71 1.241 0.083 -0.315 -1.584 2.815 P值 0.517 0.282 0.938 0.769 0.188 0.049

圖1 荷瘤鼠體內(nèi)注射18F-NT后1 h體內(nèi)分布經(jīng)時(shí)間衰減校正

表2 腫瘤與各正常器官組織對(duì)18F-NT攝取的比值

注：T/NT為實(shí)驗(yàn)組中腫瘤與各組織攝取18F-NT的比值

2.4 腫瘤HE染色

常規(guī)HE染色，正常人前列腺組織見(jiàn)圖2，PC3荷瘤鼠腫瘤組織見(jiàn)圖3。

圖2 正常人前列腺病理檢查結(jié)果 （HE×200）

圖3 裸鼠PC3腫瘤病理檢查結(jié)果 （HE×200）

3 討論

前列腺癌的診斷、分期，尤其是治療后生化復(fù)發(fā)的影像學(xué)證據(jù)，決定患者的治療方案，目前還沒(méi)有十分滿意的特異性診斷手段。研究表明[7]，NTR1在正常的前列腺細(xì)胞中不表達(dá)，而在前列腺癌中表達(dá)。SEHGAL等[8]研究表明，在缺乏雄激素的晚期前列腺癌中，NT/NTR能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。在TAYLOR等[9]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，隨著前列腺癌細(xì)胞致瘤潛力的增加，NTR1的表達(dá)也隨之增加。有學(xué)者[10]證實(shí)，在前列腺癌細(xì)胞系PC3有NTR1的過(guò)表達(dá)，SUTHERLAND等[11]研究也表明，NTR1在前列腺癌細(xì)胞系PC3有過(guò)度表達(dá)。因此NTR1有可能成為新型顯像靶點(diǎn)。本研究臨床常用的核素18F標(biāo)記與NRT1特異性結(jié)合的NT，制作完成正電子顯像劑，通過(guò)細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，PC3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組對(duì)18F-NT的攝取計(jì)數(shù)值為5 825/min，阻斷組的攝取計(jì)數(shù)值為1 941/min，對(duì)照組的攝取計(jì)數(shù)值為170/min，說(shuō)明前列腺癌PC3細(xì)胞對(duì)18F-NT有極強(qiáng)的攝取能力，且該攝取能力可被未標(biāo)記的NT有效阻斷，說(shuō)明NT與NTR1之間的結(jié)合是特異性的。

兩組荷瘤鼠在注射18F-NT后1 h，血液攝取值較低[實(shí)驗(yàn)組（0.10±0.06）%ID/g，阻斷組（0.14±0.11）%ID/g]，說(shuō)明18F-NT在血液中清除較快，血本底很低。心臟、肝臟、脾臟、肺、腸、腦等臟器的攝取值與血本底接近。腎臟藥物積聚較多[實(shí)驗(yàn)組（0.84±0.20）%ID/g，阻斷組（0.76±0.46）%ID/g]，說(shuō)明18F-NT主要通過(guò)腎臟排泄。兩組移植瘤中，阻斷組攝取值[（0.21±0.03）%ID/g]大大低于實(shí)驗(yàn)組[（1.05±0.46）%ID/g]，表明NT能有效阻斷組18F-NT的攝取，進(jìn)一步說(shuō)明18F-NT與NTR1之間的結(jié)合特異性。綜上所述，18F-NT對(duì)于前列腺癌將是一個(gè)理想的特異性靶向顯像劑，尤其可以作為雄激素非依賴(lài)型前列腺癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶的顯像診斷的一種新型分子探針。

本研究中，18F-NT制配步驟簡(jiǎn)單，放化純度高，體外穩(wěn)定性好。綜合細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)和荷瘤鼠生物分布實(shí)驗(yàn)分析，筆者認(rèn)為，18F-NT對(duì)NTR1有較好的特異性，在移植瘤中的攝取較高，其T/TN值較高，1 h后腫瘤攝取值甚至比腎臟還高，可為后續(xù)前列腺癌（包括非雄激素依賴(lài)前列腺癌轉(zhuǎn)移）的動(dòng)物PET顯像以及臨床PET顯像研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為遠(yuǎn)期的前列腺癌臨床分期與再分期以及治療方案制定與調(diào)整提供幫助。

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