李濤 許瑾 吳華蓮 王銘 向文洲

（1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣州 510301；2. 中國科學(xué)院廣州能源研究所 中國科學(xué)院可再生能源與天然氣水合物重點實驗室，廣州 510640；3. 貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴陽550025）

許多門類的微藻在逆境條件下可以大量積累油脂，近10年來，利用微藻油脂生產(chǎn)生物柴油的研究受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注［1-2］。目前科學(xué)家普遍認為微藻生物柴油前景廣闊，但現(xiàn)階段與石化柴油相比缺乏市場競爭力。因此，越來越多的科研工作者將關(guān)注點轉(zhuǎn)向微藻油脂的高值化利用，如食品原料、飼料添加劑及化妝品原料等。微藻油脂可以進行高值化開發(fā)的依據(jù)源于其特殊的脂肪酸組成，微藻可以合成多種具有活性的多不飽和脂肪酸（PUFAs），如α-亞麻酸（C18∶3，ALA），它們在預(yù)防心血管疾病、抗癌、促進大腦發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮了重要作用［3-4］。

微藻合成的脂類主要有儲藏性脂（主要是中性脂類）和膜脂（糖脂和磷脂）兩種，PUFAs主要以脂質(zhì)的形式存在于藻細胞內(nèi)。膜脂是細胞結(jié)構(gòu)性脂類，含量相對穩(wěn)定，約占干重的10%；儲藏性脂是產(chǎn)油微藻在逆境條件下大量積累的脂類，是細胞能量和碳源的主要儲藏形式，可占干重的60%以上［5］。從油脂開發(fā)角度分析，儲藏性脂相對膜脂更具有優(yōu)勢，原因包括：（1）儲藏性脂含量相對于膜脂更高，細胞經(jīng)過誘導(dǎo)處理后，儲藏性脂含量可達到膜脂的3-7倍［6］；（2）儲藏性脂的流動性好、色澤純凈（橙黃色或淺黃色），而膜脂流動性差、常與葉綠素等混合，色澤暗黑，限制了膜脂產(chǎn)品的開發(fā)［7］。因此，微藻油脂高值化開發(fā)應(yīng)該篩選PUFAs更多分布于儲藏性脂類中的藻株，或者通過代謝調(diào)控的方式，使微藻合成的PUFAs更多用于儲藏性脂類合成。

微藻合成的脂酰CoA主要有兩種去向：一是，通過“Kennedy途徑”合成儲藏性脂類；二是，通過“原核途徑”和“真核途徑”合成膜脂［8］。目前對產(chǎn)油微藻如何分配脂酰CoA用于儲藏性脂類和膜脂合成的機制尚不清楚。但已有研究表明，PUFAs在不同脂類分子間的分布受到嚴格調(diào)控。首先，微藻遺傳特性影響PUFAs的分布，Reis等［9］發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）有84%的二十碳五烯酸（C20：5，EPA）存在于糖脂中，而僅有11%的EPA存在于TAGs（三酰甘油脂）中。Khozin-Goldberg等［10］發(fā)現(xiàn)紫球藻（Porphyridium cruentum）可以積累占總脂肪酸47%的EPA，但分布在TAGs中的EPA，僅占2%。Pal等［11］研究表明擬微綠球藻（Nannochloropsissp.）的EPA在TAGs中分布較低。其次，培養(yǎng)條件對PUFAs的分布存在影響。Lu等［12］報道鹽度可以影響不同雪衣藻（Chlamydomonas nivalis）不同脂類分子的比例；?ezanka等［13］報道氮磷饑餓可以影響Trachydiscus minutus的EPA在不同脂類分子之間的分配。第三，細胞生長狀態(tài)影響PUFAs的分布，Tonon等［14］報道眼點擬微綠球藻（Nannochloropsis oculata）、三角褐指藻（P.tricornutum）、假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）和巴夫藻（Pavlova lutheri）的脂肪酸分布不僅受藻種背景影響，而且培養(yǎng)周期對其影響也較大。闡明微藻PUFAs的分布規(guī)律，提高PUFAs在中性脂中的比例，對于微藻油脂的高值化開發(fā)具有重要的指導(dǎo)作用。

本實驗室分離純化獲得了一株產(chǎn)油綠球藻（Chlorococcumsp.），通過前期研究發(fā)現(xiàn)，該藻具有生長速率快、油脂含量高、可以積累高含量的α-亞麻酸等特性，具有較高的開發(fā)潛力。本研究以產(chǎn)油綠球藻為研究對象，通過測定不同氮濃度條件下的生物質(zhì)濃度、總脂含量、脂類分級、脂肪酸分布等指標，研究其生長、脂類積累和脂肪酸分布規(guī)律，研究結(jié)果為高值化開發(fā)產(chǎn)油綠球藻油脂提供依據(jù)，同時為進一步深入開展產(chǎn)油微藻PUFAs分布調(diào)控規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 產(chǎn)油綠球藻由中國科學(xué)院南海海洋研究所海藻資源與生物技術(shù)實驗室分離并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)方法 微藻培養(yǎng)在光徑為3.0 cm、長度為60 cm、有效培養(yǎng)體積為320 mL的柱式光生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，熒光燈提供單側(cè)光源，培養(yǎng)光強為300 μmol photons/m2s（微摩爾 光量子/平方米 秒），連續(xù)鼓入二氧化碳加富的壓縮空氣提供碳源和攪拌（CO2∶Air，1∶99）。

1.2 方法

以BG-11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基［15］，設(shè)置3個硝酸鈉濃度組，分別為3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L，每個氮濃度處理組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，實驗周期為14 d。

將藻種接入硝酸鈉濃度為8.8 mmol/L的BG-11培養(yǎng)基中進行擴種培養(yǎng)，待藻細胞生長至對數(shù)期（7 d左右），離心收集藻細胞，用無氮的BG-11培養(yǎng)基反復(fù)沖洗2次，然后重懸浮于裝有不同氮濃度培養(yǎng)基的柱狀光生物反應(yīng)器中，初始接種OD750約為0.5，每2 d測定生物質(zhì)濃度，第0天、第5天、第10天、第12天、第14天離心收集藻細胞，凍干后測定總脂含量、脂類組成和脂肪酸分布。

1.2.1 生物質(zhì)濃度 每2 d取藻液V mL，將其過濾到預(yù)先烘好的混合纖維濾膜（重量為m1，g）上，將帶有藻細胞的濾膜置于80℃烘箱24 h，放置干燥器中冷卻至室溫后稱重（重量為m2，g）。

生物質(zhì)濃度（g/L）=1000×（m2- m1）/V

1.2.2 總脂含量測定 80 mg藻粉加入3 mL 10% 二甲亞砜-甲醇溶液，分別于50℃抽提30 min、冰浴抽提30 min后，離心收集上清液于預(yù)先烘干的玻璃小瓶中，藻渣加入乙醚/正己烷6 mL（1∶1，V∶V），冰浴抽提1 h，離心收集上清液至同一玻璃小瓶中，重復(fù)上述過程直到藻渣變白。在合并的抽提液中加入純水，使二甲亞砜-甲醇、水、乙醚、正己烷的比例為1∶1∶1∶1（V∶V），震蕩分相，移取有機相至另一小玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮氣吹至較小體積，將濃縮液轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重過的1.5 mL 塑料離心管中，用氮氣吹干至恒重，即得總脂含量［16］。

1.2.3 總脂產(chǎn)量的計算 總脂產(chǎn)量（g/L）=mt× Lt。其中：mt為收獲時微藻的生物質(zhì)濃度（g/L），Lt為收獲時微藻的總脂含量（% DW，%干重）。

1.2.4 脂類分級 以一定體積的氯仿-甲醇（1∶1，V∶V）溶解總脂，利用硅膠層析柱（500 mg Sep-PakTMcartridge of silicagel，Waters）進行總脂分級。首先用10 mL的氯仿洗脫得到中性脂（主要為三酰甘油，Triacylglycerol，TAG），然后用10 mL丙酮洗脫得到粗糖脂（Glycolipids，GLs），最后用10 mL甲醇洗脫得到磷脂（Phospholipids，PLs），收集每一組份于小玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮氣吹至較小體積，將濃縮液轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重的1.5 mL 塑料離心管中，用氮氣吹干至恒重，得到不同脂類組分的重量［17］。

1.2.5 脂肪酸組成 秤取25 mg藻粉，加入2 mL 2%H2SO4無水甲醇：甲苯（90∶10，V∶V），同時加入25 μL 1%的C17∶0，充氬氣后，置于80℃的水浴加熱攪拌1.5 h，加入1 mL純水和正己烷震蕩分層，將上層有機相轉(zhuǎn)移到1.5 mL樣品瓶中，用氮氣吹干，再加入100 μL正己烷密封，利用氣相色譜進行脂肪酸含量的測定。氣相色譜測定條件為：DB-5毛細管柱（30 m × 0.25 mm），以高純氮氣為載氣；檢測器為FID檢測器；進樣口溫度260℃，程序升溫（60℃保留2 min→30℃/min升溫至120℃→1.5℃/min升溫至 250℃保留 2 min）［16］。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 本研究中所有圖表所示的平均值和標準偏差均由3個生物學(xué)重復(fù)和3個測定重復(fù)計算獲得；利用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析（Analysis of Variance，ANOVA）；采用S-N-K方法對不同處理組進行多重比較；樣品均值之間的差異用最小顯著性差異（Least Significant Difference，LSD）進行分析，置信度為0.05。

2 結(jié)果

2.1 氮濃度對產(chǎn)油綠球藻生長的影響

產(chǎn)油綠球藻在3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三種氮濃度培養(yǎng)條件下，生物質(zhì)濃度隨時間的變化曲線如圖1所示，產(chǎn)油綠球藻生物質(zhì)濃度的時相變化呈現(xiàn)延滯期（0-2 d）、對數(shù)期（2-10 d）、平臺期（10-14 d）3個階段。在延滯期（0-2 d）和對數(shù)期前期（2-4 d），3個氮濃度處理組生物質(zhì)濃度的變化無明顯差異（P>0.05）。從第4天起，3個氮濃度組的生物質(zhì)濃度出現(xiàn)顯著差異（P<0.01），5.9 mmol/L氮濃度組的生物質(zhì)濃度增長最快，其次為3.5 mmol/L氮濃度組，最慢為17.6 mmol/L氮濃度組，至培養(yǎng)結(jié)束時，5.9 mmol/L氮濃度組、3.5 mmol/L氮濃度組和17.6 mmol/L氮濃度組的生物質(zhì)濃度分別為5.94 g/L、5.85 g/L和4.73 g/L。此外，培養(yǎng)結(jié)束時，不同氮濃度組藻液顏色出現(xiàn)明顯不同，3.5 mmol/L氮濃度組為橙黃色，5.9 mmol/L氮濃度組為橙色略帶綠色，而17.6 mmol/L氮濃度組為黃綠色，藻液顏色的不同表示藻細胞色素組成和含量的差異，色素與細胞光合作用存在直接相關(guān)，從而間接反映微藻生物質(zhì)的積累情況。

圖1 不同氮濃度條件下產(chǎn)油綠球藻（Chlorococcum sp.）生物質(zhì)濃度的時相變化

2.2 氮濃度對產(chǎn)油綠球藻總脂積累的影響

產(chǎn)油綠球藻在3種氮濃度條件下總脂含量隨時間的變化關(guān)系如圖2所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，3個氮濃度組的總脂含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，總脂積累最快的階段為第5至第10天。但3個氮濃度組總脂的積累速率存在明顯差異（P<0.01），總脂積累最快的組為3.5 mmol/L氮濃度組；其次為5.9 mmol/L氮濃度組，最慢為17.6 mmol/L氮濃度組，至培養(yǎng)結(jié)束，3.5 mmol/L氮濃度組的總脂含量達到43.5% DW，中氮組達到42.2% DW，17.6 mmol/L氮濃度組僅有30.3% DW。上述結(jié)果說明低氮濃度更有利于微藻油脂的積累。

圖2 不同氮濃度條件下產(chǎn)油綠球藻總脂含量的時相變化

總脂產(chǎn)量（Total lipid yield）是生物質(zhì)濃度（g/L）與總脂含量（% DW）的乘積，反映微藻油脂積累的能力。圖3為3種氮濃度處理組的總脂產(chǎn)量隨時間的變化關(guān)系，3種氮濃度處理組的總脂產(chǎn)量隨時間延長均表現(xiàn)為增加趨勢。至14 d培養(yǎng)結(jié)束，3.5 mmol/L氮濃度組和5.9 mmol/L氮濃度組分別取得了2.55 g/L和2.51 g/L的總脂產(chǎn)量（P>0.05），而17.6 mmol/L氮濃度組的總脂收獲量僅為1.43 g/L，遠低于3.5 mmol/L氮濃度組和5.9 mmol/L氮濃度組（P<0.01）。以上結(jié)果說明，培養(yǎng)過程中，過多的氮并不能獲得高的總脂產(chǎn)量，而適量的氮會取得更高的總脂產(chǎn)量。

2.3 氮濃度對產(chǎn)油綠球藻脂類組成的影響

微藻脂類可以分為中性脂、糖脂和磷脂3大類，在環(huán)境和營養(yǎng)適宜的條件下，微藻合成的脂肪酸主要用于糖脂和磷脂的合成，在逆境條件下，微藻合成的脂肪酸主要用于中性脂的合成，微藻響應(yīng)不同氮濃度，調(diào)整自身脂類組成以適應(yīng)環(huán)境。產(chǎn)油綠球藻在3種氮濃度條件下脂類組成的時相變化如圖4所示，培養(yǎng)前期，糖脂和磷脂占較大比例（占總脂的50%以上），隨著培養(yǎng)時間的延長，糖脂和磷脂的比例逐漸減少，而中性脂比例逐漸增加。3.5 mmol/L氮濃度組的中性脂積累速率明顯高于5.9 mmol/L氮濃度組和17.6 mmol/L氮濃度組，至培養(yǎng)結(jié)束，3.5 mmol/L氮濃度組的中性脂比例達到88.6%TL，5.9 mmol/L氮濃度組和17.6 mmol/L氮濃度組分別為86.3% TL和80.5% TL，以上結(jié)果說明，低氮濃度有利于中性脂的積累，而對膜脂的合成起抑制作用。

圖3 不同氮濃度條件下產(chǎn)油綠球藻總脂產(chǎn)量的時相變化

圖4 不同氮濃度條件下產(chǎn)油綠球藻脂類組成的時相變化

2.4 氮濃度對產(chǎn)油綠球藻脂肪酸分布的影響

利用氣相色譜儀測定了產(chǎn)油綠球藻的脂肪酸組成，其主要脂肪酸包括以下6種，它們分別為C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2 和C18∶3（ω-3）。隨后測定了上述6種脂肪酸在中性脂、糖脂和磷脂中的分布情況。結(jié)果表明，6種主要脂肪酸在中性脂、糖脂和磷脂中均有分布，但在中性脂、糖脂和磷脂中的比例各不相同。以培養(yǎng)第0天為例，C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1 和 C18∶2 在中性脂中的比例分別為52.6%、62.1%、52.0%、62.4%和53.7%，均超過50%以上，而C18∶3（ω-3）僅有33.9%分布于中性脂中。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，6種主要脂肪酸在中性脂和膜脂中的分布比例發(fā)生明顯變化，均呈現(xiàn)出在中性脂中比例增加，而在膜脂中比例減少的趨勢，至培養(yǎng)結(jié)束，低氮組C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2 和 C18∶3（ω-3）在中性脂中的比例分別提高到85.6%、90.8%、84.7%、95.2%、88.3%和86.5%。

氮濃度對6種脂肪酸的分布具有一定影響，隨著氮濃度降低，C16∶0、C16∶1、C18∶1、C18∶2和C18∶3在中性脂中的比例顯著增加，而在膜脂中的比例逐漸減少，僅有C18∶0在中性脂和膜脂中的比例不受氮濃度影響。

3 討論

一些門類的微藻可以合成具有特殊生物學(xué)活性的PUFAs，是開發(fā)高值微藻油的理想原料［18］。微藻合成的脂類主要有儲藏性脂和膜脂兩種［2］，PUFAs存在于上述兩種脂類中。儲藏性脂具有流動性好、色澤清澈、含量高等特點，相對于膜脂應(yīng)用范圍更廣、開發(fā)優(yōu)勢更顯著［7］。因此，篩選PUFAs更多分布于儲藏性脂類中的藻株是微藻油高值化開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗室分離純化獲得了一株產(chǎn)油綠球藻，該藻具有生長速率快、生物量高、可積累高含量油脂和α-亞麻酸等特性，存在潛在的開發(fā)利用價值。本研究以該株產(chǎn)油綠球藻為對象，研究不同氮濃度對其生長、脂類積累和脂肪酸分布規(guī)律的影響，為高值微藻油的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

在諸多影響微藻油脂積累的因素中，氮元素對微藻油脂積累的影響最為明顯，大量研究表明，低氮限制可以提高微藻油脂含量，但對微藻正常分裂生長存在嚴重抑制［19］。本研究設(shè)置17.6 mmol/L、5.9 mmol/L和3.5 mmol/L三種氮濃度，其中，17.6mmol/L為正常BG-11培養(yǎng)基中硝酸鈉的濃度。前期研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)油綠球藻（Chlorococcumsp.）在17.6 mmol/L氮濃度條件下可以保持較快分裂速率，對藻細胞的正常生長并未產(chǎn)生抑制，因此設(shè)置17.6 mmol/L為氮充足組。而當濃度降低為5.9 mmol/L和3.5 mmol/L后，培養(yǎng)前期藻細胞數(shù)量有一定增加，但隨著氮元素的快速消耗，藻細胞很快進入氮限制狀態(tài)（4-6 d左右），細胞停止分裂并開始大量合成油脂，故設(shè)置5.9 mmol/L和3.5 mmol/L為氮限制組。此外，藻細胞在3.5 mmol/L氮濃度條件下較5.9 mmol/L更早進入氮限制狀態(tài)，因此，設(shè)置兩種氮限制處理組，深入探討不同低氮限制濃度對微藻脂類積累、脂類組成和脂肪酸分布的潛在影響。結(jié)果顯示，3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度條件下，微藻的生物質(zhì)濃度明顯高于17.6 mmol/L氮濃度組，這一結(jié)果與已有的文獻報道相矛盾［19-21］。從上述結(jié)果是否可以得出高氮濃度限制微藻正常生長這一結(jié)論，答案是否定的。藻細胞分裂情況顯示，中氮和低氮條件下，藻細胞分別在第4天和第6天已停止分裂，而高氮條件第12天仍然觀察到細胞分裂現(xiàn)象（研究結(jié)果未在本文中列出），說明高氮并未抑制微藻正常分裂生長?？傊e累情況顯示：3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度組的總脂積累速率明顯高于17.6 mmol/L氮濃度組。由此推測：微藻細胞在3.5

mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度條件下更早進入氮限制，氮限制抑制細胞正常分裂，但氮限制卻激活細胞能量和碳源的快速儲存途徑，使微藻生物質(zhì)快速積累，而在17.6 mmol/L氮濃度條件下，細胞將更多的能量和碳源用于其他非儲存型代謝活動，如細胞分裂等，并未用于儲藏物的快速積累。此外，觀察到培養(yǎng)過程中17.6 mmol/L氮濃度條件下藻液顏色始終比3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度組更綠，顏色綠表明葉綠素濃度高。葉綠素含量通常與光合效率呈正相關(guān)［22］，17.6 mmol/L氮濃度組的光合效率高于3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度組，但有趣的是17.6 mmol/L氮濃度組的生物質(zhì)積累量卻遠低于3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度組，這一結(jié)果同樣印證了前述推測“3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度組進入低氮限制后，在碳代謝和能量代謝途徑上可能存在較大的改變，使細胞為適應(yīng)逆境而進行能量和碳源的儲存”。本文作者在2016年發(fā)表的文章對這一現(xiàn)象進行了詳細的解釋，并提出通過初始氮調(diào)控的方式可以獲得更高油脂產(chǎn)量的培養(yǎng)模式［6］。

圖5 產(chǎn)油綠球藻主要脂肪酸在不同脂類中的分布

總脂產(chǎn)量是生物質(zhì)濃度與總脂含量的乘積，反映微藻油脂積累的實際能力［5］，本研究中3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度組分別取得了2.55 g/L和2.51 g/L的總脂產(chǎn)量，比17.6 mmol/L氮濃度組提高了78.3%和75.5%。深入比較發(fā)現(xiàn)3.5 mmol/L和5.9 mmol/L氮濃度組的生物質(zhì)濃度和總脂含量均高于17.6 mmol/L氮濃度組。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因是給予細胞少量的初始氮，微藻利用少量的氮源進行分裂和生長，達到一定的細胞密度，當培養(yǎng)基中氮源耗盡后，細胞進入氮限制狀態(tài)，開始大量合成儲藏性脂類，從而到收獲時達到較高的總脂產(chǎn)量（自然兩步法）。如果延長17.6 mmol/L氮濃度組的培養(yǎng)時間，是否也可以獲得更高的總脂產(chǎn)量？或者給予一個更加合適的氮濃度，是否可以將總脂產(chǎn)量得到更大幅度的提高，這部分優(yōu)化內(nèi)容本文作者將在后續(xù)的工作中開展。

微藻油脂組成對其下游開發(fā)應(yīng)用極為重要，膜脂通常與葉綠素混合，使油呈現(xiàn)黑褐色，將嚴重影響油的品質(zhì)，大幅增加微藻油脫色和精煉的成本［7］。因此，了解微藻脂類組成的變化規(guī)律，改變培養(yǎng)條件，使微藻通過自身的代謝調(diào)控，減少膜脂比例，增加中性脂比例，具有非常重要生產(chǎn)意義［23］。本研究結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，中性脂比例呈現(xiàn)增加的趨勢，低氮條件下的中性脂增速更快、比例更高。上述結(jié)果與已有研究結(jié)果一致。王金娜［24］報道假微型海鏈藻（T.pseudonana）、蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）和綠色巴夫藻（P.viridis）的中性脂在指數(shù)生長后期或平臺期開始大量積累。周芷薇［25］報道低氮可以大幅提到魏氏藻中性脂的比例。此外，藻細胞降解的膜脂可以為中性脂的合成提供碳源，以磷脂作為酯酰供體，通過磷脂：二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（PDAT）催化形成三酰甘油，以糖脂作為酯酰供體，通過半乳糖脂：半乳糖脂半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GGGT）催化單半乳糖甘油二酯中的半乳糖基轉(zhuǎn)移到單半乳糖甘油二酯或雙半乳糖甘油二酯上，在此過程中產(chǎn)生的二酰甘油是三酰甘油合成的前體［26-27］。葉綠體的類囊體膜是許多色素蛋白復(fù)合物的結(jié)合位點，如果膜脂大量降解，細胞光合固碳工廠將會停止工作，導(dǎo)致細胞最終衰亡。

微藻合成的PUFAs可以分布于中性脂類中或膜脂中，判斷一株產(chǎn)油藻株是否具有高值化微藻油的開發(fā)潛力，需要分析其PUFAs在儲藏性脂類中或膜脂分布情況。大量研究表明，培養(yǎng)條件（溫度、光強、鹽度、氮元素及磷元素）對微藻的脂肪酸組成存在一定影響，那么培養(yǎng)條件是對PUFAs的分布是否也存在影響，Lu等［12］年報道鹽度可以影響雪衣藻（C.nivalis）不同脂類分子的比例；?ezanka 等［13］報道氮磷饑餓可以影響T.minutus影響EPA在不同脂類分子之間的分配。本研究所用藻株產(chǎn)油綠球藻的脂肪酸組成為 C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2和C18∶3（ω-3），隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，脂肪酸在中性脂中比例增加，而在膜脂中比例減少。此外，隨著氮濃度降低，上述6種脂肪酸在中性脂的比例也顯著增加，上述結(jié)果與中性脂的變化規(guī)律保持一致。推測：中性脂的快速合成，需要更多的脂肪酸作為供體，微藻調(diào)控合成的脂肪酸進入中性脂合成途徑，膜脂降解產(chǎn)生的脂肪酸也可能為中性脂的合成提供供體［26-27］。有研究報道這種分配調(diào)控機制可能與不同脂類在細胞中合成位點有關(guān)，中性脂的合成主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而膜脂的合成主要發(fā)生在葉綠體中［8］，當?shù)狈?dǎo)致葉綠體膜大量降解后，其上的脂類合成酶也會隨之分解，導(dǎo)致膜脂無法合成，脂肪酸轉(zhuǎn)而被分配至中性脂合成途徑［8］。產(chǎn)油綠球藻可以合成具有生物學(xué)活性的α-亞麻酸，本研究表明，在氮充足的條件下，α-亞麻酸分布在膜脂中，而在氮脅迫后，α-亞麻酸會更多的分布于中性脂中，中性脂含量增加，α-亞麻酸的含量會相應(yīng)增加，上述特性使該藻株具有高值化油脂開發(fā)潛力。此外，一些具有開發(fā)價值的多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）主要分布于膜脂上，如擬微綠球藻、三角褐指藻、紫球藻等［9-11］，如果闡明EPA的分布調(diào)控機制，在后續(xù)的工作中利用基因改造或者定向誘導(dǎo)的方式，使EPA傾向于分布于儲藏性脂類中，這對于EPA微藻油開發(fā)具有非常重要的價值。

4 結(jié)論

適宜氮濃度對于提高產(chǎn)油綠球藻總脂產(chǎn)量、中性脂的比例、多不飽和脂肪酸分布具有重要作用。產(chǎn)油綠球藻積累的α-亞麻酸在低氮條件下傾向于分布在中性脂中，因此它是一株具有高值化微藻油開發(fā)價值的藻株。

［1］ Wijffels RH, Barbosa MJ. An outlook on microalgal biofuels［J］.Sci, 2010, 329（5993）：796-799.

［2］ Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E, et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production ：perspectives and advances［J］.Plant J, 2008, 54（4）：621-639.

［3］ Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, et al. Commercial applications of microalgae［J］. J Biosci Bioeng, 2006, 101（2）：87-96.

［4］ 李春穎, 仇雪梅. 海洋微藻脂肪酸組成的研究進展［J］. 生物技術(shù)通報, 2008（4）：63-65.

［5］ Rodolfi L, Chini Zittelli G, Bassi N, et al. Microalgae for oil：strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor［J］. Biotechnol Bioeng, 2009, 102（1）：100-112.

［6］ Li T, Xu J, Gao B, et al. Morphology, growth, biochemical composition and photosynthetic performance ofChlorella vulgaris（Trebouxiophyceae）under low and high nitrogen supplies［J］.Algal Research, 2016, 16：481-491.

［7］ Li T, Xu J, Wu H, et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock［J］. Marine Drugs, 2016, 14（9）：162-181.

［8］ Heldt HW. Plant Biochemistry 3th edition［M］. San Diego：Elsevier Academic Press, 2005.

［9］ Reis A, Gouveia L, Veloso V, et al. Eicosapentaenoic acid-rich biomass production by the microalgaPhaeodactylum tricornutumin a continuous-flow reactorv［J］. Bioresource Technol, 1996, 55（1）：83-88.

［10］ Khozin-Goldberg I, Yu H Z, Adlerstein D, et al. Triacylglycerols of the red microalgaPorphyridium cruentumcan contribute to the biosynthesis of eukaryotic galactolipids［J］. Lipids, 2000, 35（8）：881-889.

［11］ Pal D, Khozin-Goldberg I, Cohen Z, et al. The effect of light,salinity, and nitrogen availability on lipid production byNannochloropsissp. ［J］. Apply Microbiol Biotechnol, 2011, 90（4）：1429-1441.

［12］ Lu N, Wei D, Chen F, et al. Lipidomic profiling and discovery of lipid biomarkers in snow algaChlamydomonas nivalisunder salt stress［J］. Eur J Lipid Sci Technol, 2012, 114（3）：253-265.

［13］ ?ezanka T, Lukavsky J, Nedbalová L, et al. Effect of nitrogen and phosphorus starvation on the polyunsaturated triacylglycerol composition, including positional isomer distribution, in the algaTrachydiscus minutus［J］. Phytochemistry, 2011, 72（18）：2342-2351.

［14］ Tonon T, Harvey D, Larson T R, et al. Long chain polyunsaturated fatty acid production and partitioning to triacylglycerols in four microalgae［J］. Phytochemistry, 2002, 61（1）：15-24.

［15］ Andersen R A. Algal culturing techniques［M］. London：Elsevier Academic Press, 2005.

［16］ Khozin-Goldberg I, Shrestha P, Cohen Z. Mobilization of arachidonyl moieties from triacylglycerols into chloroplastic lipids following recovery from nitrogen starvation of the microalgaParietochloris incise［J］. BBA-Mol Cell Biol Lipids, 2005, 1738（1-3）：63-71.

［17］ Christie WW. Lipid analysis：Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids［M］. Oxford：Pergamon Press,1982.

［18］ Lang I, Hodac L, Friedl T, et al. Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae：a comprehensive analysis ofmore than 2000 strains from the SAG culture collection［J］. BMC Plant Biology, 2011, 11（1）：124-140.

［19］ Breuer G, Lamers PP, Martens DE, et al. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains［J］. Bioresource Technol, 2012, 124：217-226.

［20］ Dean AP, Sigee DC, Estrada B, et al. Using FTIR spectroscopy for rapid determination of lipid accumulation in response to nitrogen limitation in freshwater microalgae［J］. Bioresource Technol,2010, 101：4499-4507.

［21］ Adams C, Godfrey V, Wahlen B, et al. Understanding precision nitrogen stress to optimize the growth and lipid content tradeoff in oleaginous green microalgae［J］. Bioresource Technol, 2013,131：188-194.

［22］ 韓博平, 韓志國, 付祥. 藻類光合作用機理與模型［M］. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社, 2003.

［23］ 姜悅, 陳峰. 利用海洋微藻培養(yǎng)生產(chǎn) ω-3 多不飽和脂肪酸［J］.海洋科學(xué), 1997, 21（6）：18-20.

［24］ 王金娜, 嚴小軍, 周成旭, 等. 產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積累過程的檢測［J］. 生物物理學(xué)報, 2010, 26（6）：472-480.

［25］ 周芷薇, 高保燕, 雷學(xué)青, 等. 低氮脅迫對兩種魏氏藻生長和油脂積累的影響［J］. 可再生能源, 2015, 33（5）：777-783.

［26］ Yoon K, Han D, Li Y, et al. Phospholipid：Diacylglycerolacyltransferase is a multifunctional enzyme involved in membrane lipid turnover and degradation while synthesizing triacylglycerol in the unicellular green microalgaChlamydomonas reinhardtii［J］.Plant Cell, 2012, 24（9）：3708-3724.

［27］ Benning C, Ohta H. Three enzyme systems for galactoglycerolipid biosynthesis are coordinately regulated in plants［J］. J Biol Chem, 2005, 280（4）：2397-2400.