周文俊 鄭 立 韓笑天 鄭明剛 張魁英 高 偉 崔志松

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基于尼羅紅染色分析金藻總脂動(dòng)態(tài)積累

周文俊1鄭 立1韓笑天2鄭明剛1張魁英1高 偉1崔志松1

(1. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心, 青島 266061; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266060)

通過尼羅紅熒光染色對(duì)一株富油微藻金藻sp.CCMM5001建立和完善了一種方便快捷且能準(zhǔn)確定量金藻油脂含量的方法, 利用該方法探索了不同培養(yǎng)條件對(duì)金藻生長(zhǎng)和總脂積累的影響。結(jié)果表明: 經(jīng)尼羅紅染色后, 金藻的單細(xì)胞熒光強(qiáng)度與其總脂含量呈良好的線性關(guān)系; 金藻最適生長(zhǎng)的氮濃度、光照強(qiáng)度和溫度分別為1323 μmol/L、148.0 μmol/(m2·s)、25℃; 最適總脂積累的氮濃度、光照強(qiáng)度和溫度分別為441 μmol/L、92.5 μmol/(m2·s)、15℃; 優(yōu)化培養(yǎng)條件并采用兩階段培養(yǎng)法后總脂含量和油脂產(chǎn)率都有大幅提高, 可分別高達(dá)63.3%和22 mg/(L·d)。

金藻; 尼羅紅; 總脂; 熒光強(qiáng)度; 生長(zhǎng)曲線

近年來(lái), 生物柴油因其來(lái)源廣泛、燃燒性能高、對(duì)環(huán)境污染低以及可再生等優(yōu)點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)。目前國(guó)際上主要以大豆、油菜籽、蓖麻籽、棕櫚種子以及動(dòng)物脂肪等為原料生產(chǎn)生物柴油[1—3], 但這些原料尚不能滿足當(dāng)前經(jīng)濟(jì)發(fā)展對(duì)生物柴油的需求, 同時(shí)因其與糧食作物爭(zhēng)用耕地而可能導(dǎo)致世界糧食供應(yīng)問題[4], 對(duì)此, 科研人員提出用高油脂含量的微藻來(lái)替代傳統(tǒng)油料作物生產(chǎn)生物柴油[4—6]。以微藻為原料生產(chǎn)的生物柴油具有清潔環(huán)保、燃燒性能好以及可再生等優(yōu)點(diǎn), 一些微藻如[7]、sp.[8]、[9]、[10]和[11]等已被報(bào)道可以高效地生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物柴油。盡管如此, 這類適合應(yīng)用于生產(chǎn)生物柴油的微藻種類還很有限, 而如何快速有效地從大量的微藻種類中篩選高油脂含量的藻種, 并根據(jù)其油脂積累特點(diǎn)優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得最高的油脂產(chǎn)率一直是微藻生物柴油研究需要解決的難題。傳統(tǒng)的油脂提取方法要預(yù)先收集足量的藻體并進(jìn)行凍干、研磨、反復(fù)萃取、離心以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等一系列繁瑣的步驟[12], 這不僅耗時(shí)耗力, 并且需要使用大量三氯甲烷和甲醇等化學(xué)試劑。因此, 亟待建立和完善一種方便快捷且能準(zhǔn)確定量檢測(cè)微藻油脂含量的方法。

尼羅紅是一種具有較強(qiáng)熒光特性的疏水性染料,它可與脂類物質(zhì)結(jié)合, 在特定波長(zhǎng)的激發(fā)下發(fā)出強(qiáng)烈的橙黃色或紅色熒光, 但在水溶劑中, 其熒光性完全淬滅。目前, 尼羅紅已被廣泛應(yīng)用于對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、浮游動(dòng)物、酵母菌以及微藻等的油脂進(jìn)行定性觀察和原位檢測(cè)[13—16]。研究發(fā)現(xiàn), 激發(fā)波長(zhǎng)和散射波長(zhǎng)分別為450—500 nm和>528 nm時(shí), 經(jīng)尼羅紅染色的微藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度(Fluorescence intensity, FI)與細(xì)胞內(nèi)油脂(中性脂)含量顯著相關(guān)[17—19]。因此, 可通過即時(shí)測(cè)定熒光強(qiáng)度的大小來(lái)原位檢測(cè)微藻的油脂含量, 從而了解其油脂積累規(guī)律并確定最佳培養(yǎng)條件和收獲周期。與傳統(tǒng)的油脂含量測(cè)定方法相比, 尼羅紅法操作簡(jiǎn)單, 所需微藻生物量小, 并且允許同時(shí)處理大批量的樣品。但研究也表明, 并非所有微藻都可被尼羅紅染色, 所以該方法只能針對(duì)合適的藻種開展油脂含量的測(cè)定研究。

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期的培育和研究發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)室篩選的一株金藻sp.CCMM5001細(xì)胞內(nèi)含有豐富的油脂資源, 其總脂含量可高達(dá)藻細(xì)胞干重的40%, 且適合制備生物柴油的C14-C18系脂肪酸含量為總脂肪酸含量的80%以上, 表現(xiàn)出作為一種生產(chǎn)生物柴油候選藻種的優(yōu)良特性, 但其油脂積累的動(dòng)態(tài)規(guī)律及具有最高油脂產(chǎn)率的最佳培養(yǎng)條件還需進(jìn)一步研究。值得一提的是該金藻無(wú)細(xì)胞壁, 極易被染色材料著色, 但利用尼羅紅對(duì)其進(jìn)行染色所開展的油脂含量的測(cè)定研究還未見報(bào)道。

本文擬通過尼羅紅染色法建立一種方便快捷且能準(zhǔn)確定量微藻油脂含量的方法, 并利用該方法探討不同氮濃度、光照強(qiáng)度和溫度培養(yǎng)條件下金藻的油脂動(dòng)態(tài)積累過程, 從而確定其生產(chǎn)油脂的最佳培養(yǎng)條件, 為進(jìn)一步對(duì)金藻進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物柴油奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 微藻來(lái)源及其培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)藻株金藻sp.CCMM5001由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供, 培養(yǎng)使用f/2培養(yǎng)液配方[20], 光照強(qiáng)度92.5 μmol/(m2·s), 光暗比16h︰8h, 溫度(25±1)℃。

1.2 儀器與試劑

多功能酶標(biāo)儀(Tecan Infinite M200)、倒置熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE TE2000-U)、氣相色譜-質(zhì)譜儀(Agilent GC7890A-MS5975C)。尼羅紅(Nile Red)購(gòu)自J & K Scientific公司, 以丙酮為溶劑配制成 0.1 g/L母液, 于–20℃避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

微藻的尼羅紅染色 用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定藻細(xì)胞密度, 取1 mL細(xì)胞密度約為1×106cells/mL的藻液于小試管中, 添加0.01 mL尼羅紅母液使其終濃度為1 mg/L, 振蕩混勻, 于20℃避光染色10min, 用倒置熒光顯微鏡(藍(lán)光激發(fā))觀察藻細(xì)胞內(nèi)被染色油脂; 取96孔板, 每孔加入200 μL染色藻液, 用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm時(shí)藻液在580 nm處的熒光強(qiáng)度, 并扣除未染色藻液在該波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度即為凈熒光值, 染色處理組和空白對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行, 重復(fù)測(cè)定3次。

單細(xì)胞熒光值和油脂含量關(guān)系的建立 在1.1培養(yǎng)條件下于不同生長(zhǎng)階段分別測(cè)定藻液熒光強(qiáng)度和細(xì)胞密度, 并離心收集藻體, 冷凍干燥至恒重, 取0.1 g干藻粉采用三氯甲烷-甲醇提取法測(cè)定總脂含量(%細(xì)胞干重)。將單細(xì)胞熒光強(qiáng)度和總脂含量進(jìn)行線性擬合獲得二者線性關(guān)系。

不同培養(yǎng)條件下油脂動(dòng)態(tài)積累的檢測(cè) 不同氮濃度(以硝酸鈉為氮源)、光照強(qiáng)度、溫度等培養(yǎng)條件列于表1中, 其他培養(yǎng)條件同1.1。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液按照10%的接種量分別接種到不同培養(yǎng)條件的f/2海水培養(yǎng)基中, 每隔一天測(cè)定藻細(xì)胞密度和熒光強(qiáng)度, 并由上述所得線性關(guān)系計(jì)算總脂含量。

表1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001的不同培養(yǎng)條件

油脂產(chǎn)率的計(jì)算與脂肪酸組成的分析 取100 mL藻液, 抽濾于事先稱重的0.45 μm濾膜上, 冷凍干燥后稱重, 并根據(jù)上述步驟中所得相應(yīng)的總脂含量進(jìn)行計(jì)算即可獲得油脂產(chǎn)率。將干藻粉用三氯甲烷-甲醇溶液進(jìn)行提取, 經(jīng)過皂化和甲酯化處理后用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行脂肪酸組成分析, 色譜柱型號(hào)為HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜條件: 載氣為氦氣, 流速為1 mL/min, 進(jìn)樣口溫度280℃, 傳輸線溫度為280℃; 升溫程序?yàn)? 初溫50℃, 保持2min, 以6℃/min升到300℃, 保持15min; 不分流進(jìn)樣, 進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件: 離子源為EI, 倍增器電壓1200V, 離子源溫度為230℃, 四級(jí)桿溫度150℃, Scan方式檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行, 取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Mean±SD)。用OriginPro 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 微藻尼羅紅染色鏡檢結(jié)果與單細(xì)胞熒光值-總脂含量線性關(guān)系

將染色后的藻液用藍(lán)光激發(fā)于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察(圖1), 藻細(xì)胞整體呈紅色, 細(xì)胞內(nèi)被染色油脂體呈明亮的黃色。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn), 藻細(xì)胞內(nèi)油脂體的大小和數(shù)目隨藻液所處生長(zhǎng)階段的不同而有所差異。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞其油脂體形狀較小, 直徑約為0.5 μm, 且數(shù)目較少。進(jìn)入穩(wěn)定期后油脂體逐漸變大, 直徑可達(dá)1 μm左右, 數(shù)目亦有所增加。

圖1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001經(jīng)尼羅紅染色后的熒光顯微鏡鏡檢圖

由以上觀察結(jié)果可知, 金藻在不同的生長(zhǎng)階段其油脂含量有所不同, 經(jīng)尼羅紅染色后的熒光強(qiáng)度也隨之發(fā)生變化。為確定總脂含量與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系, 用三氯甲烷-甲醇提取法測(cè)定不同生長(zhǎng)階段微藻的總脂含量, 并將其與相應(yīng)的單細(xì)胞熒光值進(jìn)行線性擬合, 可獲得如圖2所示線性擬合圖(2= 0.9572), 油脂含量與單細(xì)胞熒光強(qiáng)度具有良好的線性相關(guān)性, 單細(xì)胞熒光值隨著油脂含量的增加而增大。

2.2 在不同培養(yǎng)條件下微藻生長(zhǎng)曲線與總脂動(dòng)態(tài)積累

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同氮濃度、光照強(qiáng)度以及溫度培養(yǎng)條件下金藻的生長(zhǎng)曲線以及不同生長(zhǎng)階段尼羅紅染色的單細(xì)胞熒光強(qiáng)度, 并根據(jù)2.1中所得線性關(guān)系, 獲得了微藻總脂的動(dòng)態(tài)積累過程。

在不同氮濃度培養(yǎng)條件下, 金藻的生長(zhǎng)狀況和總脂動(dòng)態(tài)積累過程均受顯著影響。當(dāng)?shù)獫舛取?323 μmol/L時(shí), 藻細(xì)胞密度隨著氮濃度的增加而增大, 并在1323 μmol/L培養(yǎng)11d時(shí)獲得最大藻密度2.7×107cells/mL; 當(dāng)?shù)獫舛壤^續(xù)增加到1764 μmol/L時(shí), 藻細(xì)胞密度大幅降低(圖3A)。微藻總脂主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期以及穩(wěn)定期積累, 隨著氮濃度從 441 μmol/L增加到1764 μmol/L, 總脂含量逐漸降低, 在培養(yǎng)13d時(shí)882 μmol/L的氮濃度可獲得最高總脂含量51.2%; 另外, 不同氮濃度的總脂主要積累期隨氮濃度的增加而依次有所延后, 即隨著藻密度的增加, 氮逐漸被消耗到較低水平時(shí)總脂開始積累(圖3B)。

圖2 單細(xì)胞熒光值與總脂含量的線性關(guān)系(R2 = 0.9572)

光照強(qiáng)度對(duì)金藻的生長(zhǎng)有較大影響, 但對(duì)其總脂的積累影響較小。當(dāng)光照強(qiáng)度過低[37 μmol/(m2·s)]或過高[148 μmol/(m2·s)]時(shí)均不利于微藻的生長(zhǎng), 但隨著藻密度的增加, 藻液透光度降低, 此時(shí)高光照強(qiáng)度下的藻密度迅速增大并可獲得最大藻密度2.6×107cells/mL (圖4A)。光照強(qiáng)度對(duì)總脂的含量影響較小, 高光照強(qiáng)度時(shí)的油脂含量略低于中、低光照強(qiáng)度時(shí)的油脂含量(圖4B)。

溫度對(duì)金藻的生長(zhǎng)狀況和總脂動(dòng)態(tài)積累過程具有顯著影響。當(dāng)溫度過低(15℃)或過高(35℃)時(shí), 微藻生長(zhǎng)緩慢, 可獲得的最大藻細(xì)胞密度也遠(yuǎn)低于25℃培養(yǎng)條件下的藻密度2.4×107cells/mL (圖5A)。微藻總脂含量隨著溫度的升高逐漸降低, 當(dāng)溫度為15℃時(shí)總脂迅速積累, 并在培養(yǎng)7d時(shí)即可獲得最大的總脂含量50.8% (圖5B)。

由微藻總脂的積累趨勢(shì)可以看出, 不同培養(yǎng)條件下穩(wěn)定期的總脂含量均比對(duì)數(shù)期時(shí)有所增加, 但并未像尼羅紅染色鏡檢時(shí)油滴的數(shù)目和大小所增加的那樣大幅提高, 這可能是因?yàn)樵寮?xì)胞內(nèi)所含總脂除了以油滴形態(tài)存在外, 還以溶解態(tài)以及與膜結(jié)合的形式等存在。

圖3 不同氮濃度對(duì)金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長(zhǎng)曲線(A)和總脂積累(B)的影響

2.3 微藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化與結(jié)果檢測(cè)

由2.2中培養(yǎng)結(jié)果可知, 當(dāng)?shù)獫舛葹?323 μmol/L時(shí)金藻生長(zhǎng)最快, 收獲時(shí)藻密度最大, 但總脂含量并非最高; 培養(yǎng)初期以92.5 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度進(jìn)行培養(yǎng), 當(dāng)藻密度達(dá)到約1×107cells/mL時(shí)適度提高光照強(qiáng)度有利于收獲更高的藻生物量; 25℃培養(yǎng)時(shí)有利于微藻生長(zhǎng), 但總脂積累較緩慢, 15℃培養(yǎng)時(shí)總脂積累迅速且含量較高, 但生長(zhǎng)緩慢, 所以可先于25℃下培養(yǎng)一段時(shí)間獲得一定生物量之后再于15℃下培養(yǎng)5—7d使其總脂得到積累。

為盡可能收獲較高的生物量與總脂含量, 根據(jù)金藻在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特征和總脂積累特點(diǎn), 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩階段培養(yǎng)法對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)(表2)。

對(duì)兩階段培養(yǎng)的金藻的藻密度和總脂含量進(jìn)行檢測(cè)(圖6), 將其與常規(guī)培養(yǎng)條件[氮濃度1323 μmol/L,光照強(qiáng)度92.5 μmol/(m2·s), 溫度25℃]下的金藻進(jìn)行比較, 可以看出: 由于溫度的降低, 第二階段微藻的生長(zhǎng)略有減緩, 但最終所能收獲的最大細(xì)胞密度亦可高達(dá)2.5×107cells/mL; 在第二階段, 總脂迅速積累, 培養(yǎng)11d時(shí)總脂含量可高達(dá)63.3%, 遠(yuǎn)高于常規(guī)培養(yǎng)時(shí)所能達(dá)到的最大總脂含量44.2%。將兩階段培養(yǎng)法所能獲得的最大油脂產(chǎn)率和其他不同培養(yǎng)條件下所能獲得的最大油脂產(chǎn)率進(jìn)行對(duì)比(圖7), 可以看出: 當(dāng)?shù)獫舛葹?82 μmol/L時(shí)可獲得最高油脂產(chǎn)率, 氮濃度繼續(xù)增大時(shí)油脂產(chǎn)率反而降低; 油脂產(chǎn)率隨光照強(qiáng)度的增大而增大, 當(dāng)光照強(qiáng)度≥92.5 μmol/(m2·s)時(shí)油脂產(chǎn)率不再明顯增大; 當(dāng)溫度為25℃時(shí)可獲得最高油脂產(chǎn)率, 溫度過高或過低都會(huì)降低油脂產(chǎn)率; 在未進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化前, 金藻的油脂產(chǎn)率普遍在15 mg/(L·d)左右, 經(jīng)過優(yōu)化并采用兩階段培養(yǎng)法后其油脂產(chǎn)率大幅提高45%以上, 可高達(dá)22 mg/(L·d)。為確定經(jīng)條件優(yōu)化后的金藻的油脂成分是否仍具有生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良特性, 實(shí)驗(yàn)利用GC-MS進(jìn)一步分析研究了其脂肪酸組成。結(jié)果顯示(表3), 相比常規(guī)培養(yǎng)時(shí)的脂肪酸組成, 優(yōu)化的兩階段培養(yǎng)法所含的C14:0、C16:0等飽和脂肪酸含量有所降低, C18:1等不飽和脂肪酸含量有所增加, C14-C18系脂肪酸含量并無(wú)明顯變化, 均可高達(dá)總脂肪酸的88%以上, 保持了其生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良特性。另外, 不飽和脂肪酸總含量的顯著提高也增加了金藻對(duì)保健品開發(fā)利用的附加產(chǎn)值。

圖4 不同光照強(qiáng)度對(duì)金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長(zhǎng)曲線(A)和總脂積累(B)的影響

圖5 不同溫度對(duì)金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長(zhǎng)曲線(A)和總脂積累(B)的影響

圖6 普通培養(yǎng)法和兩階段培養(yǎng)法對(duì)金藻Isochrysis sp.CCMM5001生長(zhǎng)曲線和總脂積累的影響對(duì)比

表2 金藻Isochrysis sp.CCMM5001兩階段培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件

3 討論

3.1 微藻的尼羅紅熒光染色

本實(shí)驗(yàn)利用尼羅紅對(duì)金藻進(jìn)行染色并測(cè)定其熒光強(qiáng)度, 發(fā)現(xiàn)該熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞內(nèi)總脂含量呈線性關(guān)系, 這與Alonzo和Mayzaud[13]對(duì)浮游動(dòng)物的脂類進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度與脂類濃度呈線性關(guān)系的結(jié)果類似。尼羅紅染色受諸多因素影響, 如尼羅紅濃度、染色時(shí)間以及藻細(xì)胞密度等[17]。Chen,.的研究結(jié)果表明, 尼羅紅的終濃度在0.25—2 mg/L之間時(shí), 染色效果較佳, 染色時(shí)間則以10min最佳[21]。本研究在之前進(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)藻株金藻的藻細(xì)胞密度在一定范圍內(nèi)(0—1.075×107cells/mL)與其熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系(2=0.9912), 當(dāng)藻密度大于1.075×107cells/mL時(shí)熒光強(qiáng)度逐漸降低(圖8)。并不是所有微藻都適用于尼羅紅染色, 因?yàn)榇蠖鄶?shù)微藻細(xì)胞具有細(xì)胞壁, 限制了尼羅紅進(jìn)入藻細(xì)胞與脂類結(jié)合產(chǎn)生熒光, 如Chen,.對(duì)勞氏角毛藻()、赫氏圓石藻()、寇氏隱甲藻()、微綠球藻(sp.)以及小球藻(sp.)等藻類進(jìn)行尼羅紅染色時(shí)發(fā)現(xiàn)具有細(xì)胞壁的藻細(xì)胞很難被有效染色, 而在經(jīng)過液氮研磨、高溫、甲醇、DMSO、丙酮、乙醇以及異丙醇等各種處理之后藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng), 其中以25%的DMSO處理效果最好[21]。本實(shí)驗(yàn)所用的金藻不具有細(xì)胞壁, 因此可以直接被尼羅紅染色。

圖7 不同培養(yǎng)條件下金藻Isochrysis sp.CCMM5001的油脂產(chǎn)率

表3 普通培養(yǎng)法和兩階段培養(yǎng)法對(duì)金藻Isochrysis sp.CCMM5001主要脂肪酸組成的影響對(duì)比

圖8 金藻Isochrysis sp.CCMM5001藻細(xì)胞密度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

以往尼羅紅對(duì)微藻染色的研究只限于通過熒光強(qiáng)度的大小來(lái)定性或粗略地描述脂類的相對(duì)含量[17—19, 22], 而未見對(duì)其絕對(duì)含量進(jìn)行研究的報(bào)道。本論文在建立單細(xì)胞熒光值與總脂含量線性關(guān)系的基礎(chǔ)上, 通過簡(jiǎn)單的計(jì)算即可獲得微藻在不同培養(yǎng)條件下不同生長(zhǎng)階段時(shí)總脂的絕對(duì)含量, 與傳統(tǒng)的測(cè)定絕對(duì)含量的化學(xué)提取法相比, 該方法操作簡(jiǎn)單、所需樣品量少(化學(xué)提取法需0.2 g干藻粉), 并可即時(shí)監(jiān)測(cè)總脂的動(dòng)態(tài)積累過程, 另外, 多功能酶標(biāo)儀和96孔板在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用也使得同時(shí)處理大批量的樣品變得快速可行。

3.2 微藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)研究了不同氮濃度、光照強(qiáng)度以及溫度培養(yǎng)條件下金藻的生長(zhǎng)狀況和總脂動(dòng)態(tài)積累過程, 并優(yōu)化了培養(yǎng)條件使其具有最高的油脂產(chǎn)率。研究結(jié)果表明, 金藻的細(xì)胞密度在一定的氮濃度范圍內(nèi)隨氮濃度的增加而提高, 這與王學(xué)魁等和尹翠玲等的研究結(jié)果一致[23, 24]; 當(dāng)?shù)獫舛壤^續(xù)增加時(shí)細(xì)胞密度反而降低, 這可能是由于氮的增加改變了培養(yǎng)液的N/P比, 從而限制了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。光照強(qiáng)度對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為光照過強(qiáng)或過弱都將限制微藻的生長(zhǎng), 但隨著藻密度的增加藻液透光性降低, 適當(dāng)增大光照強(qiáng)度更有利于微藻生長(zhǎng)。溫度是另一個(gè)影響微藻生長(zhǎng)的重要因素, 一般而言, 低溫時(shí)微藻生命活動(dòng)不活躍, 生長(zhǎng)遲緩, 溫度較高時(shí)則生長(zhǎng)旺盛, 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳生長(zhǎng)溫度為25℃。

不同培養(yǎng)條件對(duì)金藻總脂的積累也有明顯的影響。王學(xué)魁等認(rèn)為金藻的總脂含量隨氮濃度的增加而提高[23], 但本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其相反, 這可能是氮缺乏導(dǎo)致其他代謝路徑的改變, 從而促進(jìn)了細(xì)胞脂質(zhì)的合成[25]。孫利芹和楊林濤報(bào)道稱金藻在高光照條件下總脂含量會(huì)相對(duì)提高[26], 但本研究結(jié)果顯示高光照強(qiáng)度[148 μmol/(m2·s)]條件下反而不利用總脂的積累, 這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)后期高光照強(qiáng)度條件下的微藻仍處于活躍分裂狀態(tài), 蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)的含量相對(duì)較高, 而作為儲(chǔ)能物質(zhì)的脂類含量則相對(duì)較低。溫度對(duì)微藻總脂積累的影響表現(xiàn)為: 低溫有利于總脂尤其是不飽和脂肪酸的積累, 而高溫時(shí)總脂含量則相對(duì)較低[27—29], 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳總脂積累溫度為15℃。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 微藻最佳生長(zhǎng)條件與最佳總脂積累條件并不相符。為了獲取較高的油脂產(chǎn)出, 本實(shí)驗(yàn)首次采用兩階段培養(yǎng)法對(duì)金藻sp.CCMM5001進(jìn)行培養(yǎng), 即先在最適生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)一段時(shí)間以獲得較大生物量然后調(diào)節(jié)至最適總脂積累條件以獲得較高的總脂含量, 從而大幅提高了其油脂產(chǎn)率。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用尼羅紅染色法研究發(fā)現(xiàn)了金藻sp.CCMM5001的單細(xì)胞熒光強(qiáng)度與其總脂含量具有良好的線性關(guān)系, 并通過該方法探索了不同培養(yǎng)條件對(duì)金藻生長(zhǎng)和總脂積累的影響。結(jié)果表明, 最適金藻sp.CCMM5001生長(zhǎng)和總脂積累的氮濃度、光照強(qiáng)度以及溫度分別為: 1323 μmol/L、148.0 μmol/(m2·s)、25℃和441 μmol/L、92.5 μmol/(m2·s)、15℃。采用兩階段培養(yǎng)法后總脂含量和油脂產(chǎn)率都大幅提高, 可分別高達(dá)63.3%和22 mg/(L·d)。

[1] Felizardo P, Correia M J N, Raposo I,.Production of biodiesel from waste frying oils [J]., 2006, 26(5): 487—494

[2] Kulkarni M G, Dalai A K. Waste cooking oil-an economical source for biodiesel: A review [J]., 2006, 45(9): 2901—2913

[3] Song D H, Fu J J, Shi D J. Exploitation of oil-bearing microalgae for biodiesel [J]., 2008, 24(3): 341—348

[4] Schenk P M, Thomas-Hall S R, Stephens E,. Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production [J]., 2008, 1(1): 20—43

[5] Chisti Y. Biodiesel from microalgae [J]., 2007, 25(3): 294—306

[6] Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E,.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances [J]., 2008, 54(4): 621—639

[7] Miao X L, Wu Q Y. Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil [J]., 2006, 97(6): 841—846

[8] Hossain A B M S, Salleh A, Boyce A N,. Biodiesel fuel production from algae as renewable energy [J]., 2008, 4(3): 250—254

[9] Liu J, Huang J C, Fan K W,. Production potential ofas a feedstock for biodiesel [J]., 2010, 101(22): 8658—8663

[10] Razon L F, Tan R R. Net energy analysis of the production of biodiesel and biogas from the microalgae:and[J]., 2011, 88(10): 3507—3514

[11] Tang H Y, Abunasser N, Garcia M E D,. Potential of microalgae oil fromas a feedstock for biodiesel [J]., 2011, 88(10): 3324—3330

[12] Bligh E G, Dyer W J. A rapid method for total lipid extraction and purification [J]., 1959, 37(8): 911—917

[13] Alonzo F, Mayzaud P. Spectrofluorometric quantification of neutral and polar lipids in zooplankton using Nile red [J]., 1999, 67(3—4): 289—301

[14] Kimura K, Yamaoka M, Kamisaka Y. Rapid estimation of lipids in oleaginous fungi and yeasts using Nile red fluorescence [J]., 2004, 56(3): 331—338

[15] Genicot G, Leroy J L M R, Soom A V,. The use of a ?uorescent dye, Nile red, to evaluate the lipid content of single mammalian oocytes [J]., 2005, 63(4): 1181—1194

[16] Elsey D, Jameson D, Raleigh B,. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids [J]., 2007, 68(3): 639—642

[17] Cooksey K E, Guckert J B, Williams S A,. Fluorometric-determination of the neutral lipid-content of microalgal cells using nile red [J].,1987, 6(6): 333—345

[18] Lee S J, Yoon B D, Oh H M. Rapid method for the determination of lipid from the green alga[J]., 1998, 12(7): 553—556

[19] de la Jara A, Mendoza H, Martel A,. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate,[J]., 2003,15(5): 433—438

[20] Borowitzka M A, Borowitzka L J. Micro-algal Biotechnology [M]. Cambridge: Cambridge University Press.1988, 457—465

[21] Chen W, Zhang C W, Song L R,. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae [J]., 2009, 77(1): 41—47

[22] Wang J N, Yan X J, Zhou C X,. Screening of oil-producing microalgae and detecting dynamics of neutral lipid accumulation [J]., 2010, 26(6): 472—480 [王金娜, 嚴(yán)小軍, 周成旭, 等. 產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動(dòng)態(tài)積累過程的檢測(cè). 生物物理學(xué)報(bào), 2010, 26(6): 472—480]

[23] Wang X K, Wang Y S, Sun Z N,. Effects of NaNO3concentration on growth and fatty acids composition of[J]., 2006, 16(1): 61—63 [王學(xué)魁, 王云生, 孫之南, 等. NaNO3濃度對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及所含脂肪酸的影響. 生物技術(shù), 2006, 16(1): 61—63]

[24] Yin C L, Liang Y, Zhang Q F. Effects of nitrogen concentrations on chlorophyll fluorescence and growth in alga3011 and 8701 [J]., 2008, 27(1): 27—31 [尹翠玲, 梁英, 張秋豐. 氮濃度對(duì)球等鞭金藻3011和8701葉綠素?zé)晒馓匦约吧L(zhǎng)的影響. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(1): 27—31]

[25] Huang W C, Hu H H. Study on the salinity tolerance and oil accumulation in[J]., 2013, 37(2): 383—387 [黃偉超, 胡晗華. 微擬球藻屬對(duì)鹽度的耐受及其產(chǎn)油特性分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2013, 37(2): 383—387]

[26] Sun L Q, Yang L T. The effect of environment factors on composition and content of fatty acids ofcell [J]., 2006, 27(5): 11—13 [孫利芹, 楊林濤. 環(huán)境因子對(duì)球等鞭金藻脂肪酸含量和組成的影響. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(5): 11—13]

[27] Stadler T. Algal Biotechnology [M]. London: Elsevier Applied Science. 1988, 303—314

[28] de Oliveira M A C L, Monteiro M P C, Robbs P G,. Growth and chemical composition ofandbiomass at different temperatures [J]., 1999, 7(4): 261—275

[29] Jing H M, Zhai J, Zhang Y Y,. Influences of temperature on the growth and fatty acid composition in marine microalgae [J]., 2005, 26(6): 9—12 [蔣漢明, 翟靜, 張媛英, 等. 溫度對(duì)海洋微藻生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(6): 9—12]

Research on the dynamic accumulation of lipids insp. CCMM5001 based on the lipid analysis by Nile Red method

Zhou Wen-jun1, Zheng Li1, Han Xiao-tian2, Zheng Ming-gang1, Zhang Kui-ying1, Gao Wei1and Cui Zhi-song1

(1. Research Center for Marine Ecology, the First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China; 2. Key Laboratory of Marine Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266060, China)

Some species of microalgae are considered as an ideal resource for biodiesel production because they contain high level of lipids. The traditional method to quantify the lipids level includes the solvent extraction and gravimetric determination based on a chloroform-methanol-water system. This method has the disadvantage of being time consuming and inefficient. Here we used Nile Red, a lipid-soluble fluorescent probe, to establish a novel method to determinate the level of lipids in microalgae rapidly and accurately. We applied the Nile Red method to investigate the dynamic accumulation of lipids insp.CCMM5001 under different culture conditions. The results showed that there was a linear correlation between the lipids level and the cellular fluorescence of stained microalgal cells, therefore the former can be accurately indicated by the latter. Low nitrogen concentrations and low temperatures were suitable for accumulating of lipids. The level of lipids was reduced if the illumination intensity was overly high or low. On one hand the optimal conditions for the growth were: N concentration at 1323 μmol/L, illumination intensity at 148.0 μmol/(m2·s), and the temperature at 25℃. On the other hand for the maximal accumulation of the lipids, the optimal values of the parameters above were 441 μmol/L, 92.5 μmol/(m2·s), and 15℃ respectively. The culture condition was optimized and a two-stage cultivation was carried out to increase both the level and the production rate of lipids, the former reaching a high concentration of 63.3% and the latter reaching 22 mg/(L·d).

sp; Nile red; Total lipicls; Fluoresence intensity; Growth Curve

2013-01-21;

2013-12-16

海洋公益性行業(yè)專項(xiàng)項(xiàng)目(200805039); 海洋可再生能源專項(xiàng)(GHME2001SW02); 國(guó)家自然科學(xué)基金(41076108, 41106148, 30870247); 山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2011GHY11533)資助

周文俊(1987—), 男, 甘肅武威人; 碩士; 主要從事海洋微藻生物燃料的研究。E-mail: 86zwj@163.com

鄭立, 副研究員, 博士; E-mail：zhengli@fio.org.cn

Q949.2; Q-33

A

1000-3207(2014)02-0312-08

10.7541/2014.45