薛瑞萍 蔣霞敏 韓慶喜 張聰穎

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 寧波 315211)

微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用越來越重要, 不但可以作為餌料生物, 提高水產(chǎn)動物幼體的成活率[1]; 而且可以調(diào)節(jié)水質(zhì), 消除氮磷, 抑制病害發(fā)生[2]。溫度、鹽度、光照是影響海洋微藻生長和代謝的重要生態(tài)因子, 直接影響細(xì)胞內(nèi)的光合電子傳遞、代謝途徑調(diào)控、特異性酶反應(yīng)和細(xì)胞的通透性等, 是影響藻細(xì)胞生長、油脂積累和脂肪酸組成的重要因素。大量研究表明改變微藻的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)周期, 不但會影響微藻生長速率, 還會影響海洋微藻的油脂含量以及脂肪酸組成, 特別是PUFA、EPA和DHA的含量, 而且兩者往往不同步, 所以很多學(xué)者提出“分級培養(yǎng)”或“二次培養(yǎng)”[3—6]。

STR01是一種扭鞘藻(Streptothecasp.), 是本實驗室從象山港海區(qū)新分離的一株生長快、不易老化和污染、耐高溫的浮游硅藻。該藻隸屬于硅藻門、中心綱、盒形硅藻目、真彎藻科、扭鞘藻屬。該藻殼面呈橢圓形, 殼環(huán)面長方形, 殼長22—38 μm,殼寬12—19 μm, 色素體黃褐色片狀。初步試驗表明是一種理想的貝類育苗餌料。但有關(guān)該藻的生態(tài)習(xí)性及培養(yǎng)方法迄今為止未見報道。為此, 本文通過單因子和正交試驗進(jìn)行了溫度、鹽度、光照強度對該藻的生長、總脂和脂肪酸組成影響的研究,以期為扭鞘藻的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

STR01藻種保藏于寧波大學(xué)餌料生物培養(yǎng)室,實驗藥品均為分析純; 培養(yǎng)用水為象山港海域天然海水, 經(jīng)沙濾、暗沉淀、脫脂棉過濾、燒開, 涼冷后使用; 培養(yǎng)液采用寧波大學(xué)#3母液配方[4]。藻種置于GXZ智能型光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)中活化和擴大, 培養(yǎng)靜置不充氣, 每天定時搖藻 2 次, 早晚各1次。培養(yǎng)條件: 溫度 (25±1)℃, 光照 60 μmol/(m2·s), 光暗周期(L∶D) 12∶12。

1.2 實驗方法

溫度試驗設(shè)置溫度梯度10、15、20、25、30和35℃, 培養(yǎng)容器為消毒的1000 mL三角燒瓶, 各6平行。每瓶加培養(yǎng)液900 mL(寧波大學(xué)3#培養(yǎng)液配方), 接種100 mL, 其他培養(yǎng)條件: 光照強度60 μmol/(m2·s), 光周期(L∶D) 12∶12, 鹽度25, pH 8.10, 所有試驗瓶均放在GXZ智能型光照培養(yǎng)箱,培養(yǎng)時間7d。接種后計數(shù)N0, 7d后計數(shù)Nt, 采用離心機(Centrifuge 5430 R)藻液離心(6000 r/min)收集藻, 存放并冷凍干燥(-80℃, FD5-3T, Gold-SIM), 測定總脂和脂肪酸。

光照強度試驗設(shè)置光照強度梯度40、60、80、100和120 μmol/(m2·s), 各6平行。培養(yǎng)條件: 溫度25℃, 光周期(L∶D) 12∶12, 鹽度25, pH 8.1,其他條件同上。

鹽度試驗鹽度梯度設(shè)置為10、15、20、25、30和35, 各6平行。培養(yǎng)條件: 光照強度60 μmol/(m2·s), 光周期(L∶D) 12∶12, 溫度25℃, pH 8.1。其他條件同上。

溫、光、鹽正交試驗本試驗采用溫度(A)、光照強度(B)和鹽度(C)三因素三水平正交試驗(表1), 其他培養(yǎng)條件: 光周期(L∶D) 12∶12, pH 8.1, 其他條件同上。

表1 正交試驗參數(shù)因數(shù)水平表Tab. 1 The orthogonal test parameter-factor level

1.3 總脂含量及脂肪酸的測定

總脂的抽取及測定采用改良Bligh-Dyer方法[7, 8]。取一定體積藻液, 6000 r/min離心10min, 再用消毒淡水清洗2—3次, 冷凍干燥保存(FD5-3T,Gold-SIM)。將干燥的藻泥用研缽研碎后, 采用氯仿∶甲醇提取法, 得出總脂含量。

脂肪酸組成分析采用KOH甲醇水法[9,10]。總脂用5%—6%KOH-甲醇∶水(體積比為4∶1)皂化2h(60℃水浴), 2 mL氯仿: 正己烷(體積比1∶4)提取;后甲酯化, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸用正己烷(色譜純)到離心管中離心, 取上清液, 再進(jìn)行GL-MS分析。用6890N/5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀按照面積歸一化法計算各組分的相對百分含量。

1.4 統(tǒng)計與數(shù)據(jù)處理

平均相對生長速率計算公式為:K=(lnNtlnN0) /t(式中,N0為初始細(xì)胞數(shù)目、Nt為培養(yǎng)7d后的細(xì)胞數(shù)、t為培養(yǎng)時間)。得出的實驗數(shù)據(jù)用平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示, 單因素方差分析(ANOVA)和多元方差分析(MANOVA)以及Duncan多重比較分析(α=0.05)均用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件, 用2007版Excel進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果

2.1 溫度對STR01的生長、總脂含量及脂肪酸的影響

溫度對STR01生長和總脂含量的影響不同溫度對STR01的平均相對生長速率影響顯著(P＜0.05)。該藻在15—35℃內(nèi), 隨著溫度升高平均相對生長速率呈先上升后降低趨勢, 在30℃時該藻的平均相對生長速率最大(K值為0.682), 但25℃組與30℃組平均相對生長速率差異不顯著(P＞0.05), 溫度在10℃條件下, 培養(yǎng)7d大部分藻死亡分解, 藻液顏色變白。所以該藻適合的溫度是15—35℃, 最適溫度為25—30℃(圖1)。

圖1 溫度對STR01生長和總脂含量的影響Fig. 1 Effects of temperature on growth and total lipid content of STR01

在溫度10—35℃內(nèi), 溫度10℃時, 由于藻體死亡分解, 無法收集, 量不足無法完成總脂含量的測定。在15—35℃的溫度下, 溫度對該藻的總脂含量有影響顯著(P＜0.05), 隨著溫度升高, 該藻總脂含量先增加后減少, 其中25℃時總脂含量最高(17.23%),且顯著高于其他組(P＜0.05)(表2)。

溫度對STR01脂肪酸組成和含量的影響本試驗共測定出該藻含13種主要脂肪酸, 其中飽和脂肪酸(SFA) 4種, 單不飽和脂肪酸(MUFA) 2種, 多不飽和脂肪酸(PUFA) 7種。主要脂肪酸為C14∶0、C16∶1、 C16∶0、 C18∶0和C20∶4 (n-6)。試驗結(jié)果表明, 溫度對該藻PUFA、EPA含量影響顯著(P＜0.05), 在溫度15—30℃內(nèi), 該藻PUFA的含量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, PUFA的含量為19.01%—34.23%, 30℃時PUFA的含量最高(34.23%)。該藻的EPA和DHA含量極少, 在15—35℃條件下EPA含量為0.11%—1.11%, DHA含量為0.07%—2.16%。

表2 溫度對STR01的脂肪酸組成和含量的影響(%)Tab. 2 Effects of temperature on fatty acid composition and content in STR01 (%)

2.2 光照強度對STR01的生長、總脂含量及脂肪酸的影響

光照強度對STR01生長和總脂含量的影響不同的光照強度對STR01的平均相對生長速率影響顯著(P＜0.05)。該藻在40—120 μmol/(m2·s), 隨著光照強度的升高生長速率呈先上升后降低趨勢,60 μmol/(m2·s)時平均相對生長速率最大(K值0.630), 且顯著高于其他組。該藻生長的適合的光照強度是40—120 μmol/(m2·s), 最適光強為60 μmol/(m2·s)。

光照強度在60 μmol/(m2·s)時該藻的總脂含量顯著高于較其他組(P＜0.05), 此時含量最高(16.73%)?？傊堪凑諒母叩降偷呐判?0 μmol/(m2·s)(16.73%)＞40 μmol/(m2·s)(13.07%)≥100 μmol/(m2·s)(9.37%)＞80 μmol/(m2·s)(6.87%)＞120 μmol/(m2·s)(6.67%)(圖2)。

圖2 光照強度對STR01生長和總脂含量的影響Fig. 2 Effects of light intensity on growth and total lipid content of STR01

光照強度對STR01脂肪酸組成和含量的影響由表3所示, 不同光照強度對該藻PUFA影響顯著(P＜ 0.05), 低光照[40 μmol/(m2·s)]時PUFA含量最高(34.29%)。PUFA中主要是C20∶4 (n-6)的含量,光照[80 μmol/(m2·s)]時達(dá)18.20%。該藻的EPA和DHA含量不高, 各組差異顯著(P＜ 0.05)。光照強度為20 μmol/(m2·s)該藻EPA最高(2.88%), 光照強度為80 μmol/(m2·s)該藻DHA最高(2.23%)。

2.3 鹽度對STR01的生長、總脂含量及脂肪酸的影響

鹽度對STR01生長的影響不同的鹽度對STR01的平均相對生長速率影響顯著(P＜0.05)。在鹽度10—35, 隨著鹽度的升高STR01平均相對生長速率呈先上升后降低趨勢, 鹽度25時平均相對生長速率最高(K為0.634), 鹽度為10時扭鞘藻的數(shù)量幾乎沒有增加(圖3)。該藻生長的適合鹽度范圍是10—35, 最適鹽度為25。

鹽度對STR01的總脂含量影響顯著(P＜ 0.05)。在鹽度10—35, 隨著鹽度的升高, 該藻總脂含量呈先增加后減少趨勢, 鹽度30時最高(13.66%), 且顯著高于其他組(圖3)。

圖3 鹽度對STR01生長和總脂含量的影響Fig. 3 Effects of salinity on growth and total lipid content of STR01

表3 光照強度對STR01的脂肪酸組成和含量的影響Tab. 3 Effects of light intensity on fatty acid composition and content in STR01 (%)

鹽度對STR01脂肪酸組成和含量的影響鹽度對STR01的脂肪酸組成及含量影響顯著(P＜ 0.05)。鹽度10—35 時PUFA的含量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 鹽度25時PUFA的含量最高(43.42%)。PUFA中主要是C20∶4 (n-6)的含量, 鹽度25時達(dá)27.20%。在鹽度10—35 條件下EPA含量為1.06%—9.80%, DHA含量為1.92%—2.66%。在鹽度25、30、35時EPA含量大幅度增加, 分別達(dá)9.80%、9.16%和7.25%, 特別是鹽度25時, EPA含量高達(dá)9.80%(表4)。

2.4 溫光鹽正交試驗對STR01生長、總脂及脂肪酸的影響

溫光鹽正交試驗對STR01生長和總脂的影響采用溫度(A)、光照強度(B)、鹽度(C)進(jìn)行正交試驗, 結(jié)果藻細(xì)胞生長和總脂含量見表5。生長最優(yōu)組合為: A3B2C2, 即溫度30℃、光照強度60 μmol/(m2·s)、鹽度25, 該組合時平均相對生長速率最大(K值達(dá)0.756); 總脂含量積累的最優(yōu)組合為A3B2C1即溫度30℃、光照強度60μmol/(m2·s)、鹽度20, 總脂含量可達(dá)20.00%。

影響STR01生長的正交因素主次為A＞C＞B,3因素中溫度對STR01平均相對生長速率影響最大(表6), 在置信區(qū)間95%的情況下, 得出3個因素對平均相對生長速率影響的顯著性排序為FA＞FC＞FB,即溫、光、鹽對該藻平均相對生長速率的可靠性影響的大小順序為A＞C＞B, 與方差分析的結(jié)果一致(表7)。溫度和鹽度對該藻生長速率的影響有高度顯著差異(P=0.000); 光照強度對STR01平均相對生長速率有顯著差異(P=0.012); 溫度和鹽度有交互作用, 且交互作用極度顯著(P=0.000); 溫度、光照強度和鹽度這三者的交互作用顯著(P=0.001)。

表4 鹽度對STR01的脂肪酸組成和含量的影響Tab. 4 Effects of salinity on fatty acid composition and content in STR01 (%)

表5 STR01生長速率和總脂正交試驗設(shè)計Tab. 5 Orthogonal test design of the relative growth ratio and total lipid combination of STR01

同樣影響STR01總脂正交因素主次為B＞A＞C,即光照強度對總脂含量的影響最大(表8、表9)。溫度和光照強度對該藻總脂含量影響高度顯著(P=0.000), 鹽度對該藻總脂含量影響有顯著差異(P=0.002)。溫度和光照、光照和鹽度之間有交互作用(P=0.000); 溫、光、鹽三者有交互作用(P=0.000)。

溫光鹽正交試驗對STR01脂肪酸組成和含量的影響在試驗設(shè)定的組合下, PUFA含量最高時的組合為A2B2C1(溫度25℃、光照強度60 μmol/(m2·s)、鹽度20), 此時PUFA含量為35.37%, 該組合與組合為A2B3C1(溫度25℃、光照強度80 μmol/(m2·s)、鹽度20)無顯著性差異。PUFA中主要是C20∶4 (n-6)的含量, 組合為A2B2C1(溫度25℃、光照強度 60 μmol/(m2·s)、鹽度20)時C20∶4 (n-6)的含量最高為23.80%, 組合為A3B2C1(溫度30℃、光照強度60 μmol/(m2·s)、鹽度20)時含量最高為21.90%。該藻的EPA和DHA含量雖然極少, 但在A3B2C1(溫度30℃、光照強度60 μmol/(m2·s)、鹽度20)條件下該藻的EPA含量達(dá)到最高(2.91%)A2B2C1 (溫度25℃、光照強度60 μmol/(m2·s)、鹽度20)條件下該藻的DHA含量達(dá)到最高(2.56%)(表10)。

表6 生長速率極差分析Tab. 6 Range analyses of relative growth ratio

表7 生長速率方差分析Tab. 7 ANOVA of the relative growth ratio

表8 總脂含量極差分析Tab. 8 Range analyses of total lipid content

表10 正交試驗對扭鞘藻的脂肪酸組成和含量的影響Tab. 10 Effect of orthogonal test on fatty acid composition and content in STR01 (%)

續(xù)表10

3 討論

3.1 溫度對微藻的影響

溫度是影響微藻生長和代謝的重要環(huán)境因子之一[11]。溫度對海洋微藻的生長及發(fā)育等具有調(diào)節(jié)作用, 對營養(yǎng)物的吸收利用效率、酶的活性、及細(xì)胞分裂的周期等存在不同程度不同方式的影響[12]。正交試驗結(jié)果表明, 溫度對STR01平均相對生長速率影響最大, 單因子試驗表明: STR01生長的適溫為15—35℃, 最適溫度25—30℃ (0.679—0.682)。該藻在15—35℃內(nèi), 隨著溫度升高平均相對生長速率呈先上升后降低趨勢, 在30℃時該藻的平均相對生長速率最大(K值為0.682), 但25℃組與30℃組平均相對生長速率差異不顯著(P＞ 0.05), 溫度在10℃條件下, 培養(yǎng)7d大部分藻死亡分解, 藻液顏色變白。這一結(jié)果與金德祥等[13]研究扭鞘藻對溫度的適應(yīng)范圍是在10—30℃, 最適溫度是在20—25℃的試驗結(jié)果不一致, 可能由于其試驗環(huán)境、條件和藻種不同所致。不同海洋微藻對不同的溫度的適應(yīng)能力不同, 海鏈藻(Thalassiossirasp.)在溫度24—27℃時, 其生長則明顯受到抑制, 在30℃時則完全不能生長, 但在18—24℃溫度范圍內(nèi),海鏈藻具有較高的生長速率[14], 而牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)是一種耐高溫藻種, 其生長的最佳溫度為25—35℃。本試驗STR01在10℃以下完全不能生長, 在35℃時平均相對生長速率明顯降低。

有研究表明, 在極端低溫或高溫情況下, 微藻合成油脂的含量減少[15—17], STR01在低溫15℃和高溫35℃時總脂積累很少, 總脂含量也相差不大, 低溫和高溫對微藻的危害方式并不相同。Opute[16]認(rèn)為海洋微藻的油脂合成, 在極端溫度下微藻的油脂合成受限, 可能是由于合成脂肪相關(guān)的酶發(fā)生不可逆損傷。低溫對微藻的破壞是機械性, 而高溫對微藻的破壞是化學(xué)性, 大量的研究表明微藻對低溫的抵抗和忍耐性較強。不同藻種總脂含量積累的最適溫度不同, 本試驗總脂含量積累的最適溫度是25℃(總脂含量可達(dá)17.23%)。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的誘變株MP-2, 總脂積累的最適溫度是20℃[18]。硅藻的脂肪酸主要成分有C14∶0、C16∶1 (n-7)、C16∶0, 有些硅藻的富含EPA。扭鞘藻屬于硅藻, 本試驗表明其主要脂肪酸成分是C14∶0、C16∶1、C16∶0、C18∶0和C20∶4 (n-6), 其EPA含量不高。有研究表明海鏈藻低溫處理可明顯提高長鏈多不飽和脂肪酸含量, 但并不是其積累PUFAs的最佳溫度[11]。在本試驗的單因子試驗中,溫度20℃下, PUFA含量最高達(dá)34.23%, 在正交試驗中, 溫度為25℃時, PUFA積累較多, 而30℃該藻平均相對生長速率最高, 若要獲得較多的不飽和脂肪酸可考慮分步培養(yǎng)。

3.2 光照強度對微藻的影響

光照影響微藻的生長速率和光合作用, 對細(xì)胞體內(nèi)生化成分產(chǎn)生影響, 光強和照射時間的長短影響微藻光合作用的效率[14,19]。光是影響海洋微藻生化成分種類和含量多少及其生長的最重要的因子之一, 有研究實驗結(jié)果表明超過一定的光照強度范圍, 微藻生長會受到抑制。本次試驗光照強度為60 μmol/(m2·s)時, STR01平均相對生長速率K值達(dá)到最大(0.630), 當(dāng)光照強度超過100 μmol/(m2·s)時,STR01的平均相對生長速率明顯降低, 說明高光強不利于該藻的生長。不同的藻種的生長適應(yīng)的光強不一樣, 如后棘藻(Ellipsoidionsp.)在光強較高下生長速率高, 其適宜光強范圍為108.75—244.15 μmol/(m2·s), 光強低于71.12 μmol/(m2·s)時生長速率有所降低[20]。多方面的研究顯示, 浮游海洋微藻在變化的環(huán)境中生存和生長的, 其生理適應(yīng)是關(guān)鍵過程,水生浮游植物為了提高其不同環(huán)境中生存能力, 可以通過提高對環(huán)境因子的適應(yīng)能力來實現(xiàn), 特別是在資源能夠循環(huán)再生的情況下, 這種調(diào)節(jié)機制更加的明顯[21]。

正交試驗結(jié)果表明, 光照強度對STR01總脂含量的積累影響最大, 單因子試驗表明光照強度為60 μmol/(m2·s)時, STR01的總脂含量最高可達(dá)16.73%。單因子試驗結(jié)果表明, 隨著光照強度的升高, 總脂含量呈下降趨勢, 表明高光不利于STR01總脂的積累。國內(nèi)學(xué)者對微綠球藻[22]、后棘藻[19]、小球藻和三角褐指藻[23]的研究中也發(fā)現(xiàn)PUFA含量隨光強增加而呈下降趨勢。低光下兩種藻小新月菱形藻和等鞭金藻的脂肪含量多, 而高光下則相反[23]。低光照[20 μmol/(m2·s)]更有利于2 株曼氏骨條藻(Skeletonema munzelii)總脂及PUFA的積累[22],單因子光照強度試驗和正交試驗都結(jié)果表明光強[60 μmol/(m2·s)]有利于STR01的PUFA的積累, 單因子試驗結(jié)果表明, 隨著光照強度的升高, PUFA呈下降趨勢, 表明高光不利于STR01PUFA的積累。

3.3 鹽度對微藻的影響

本試驗結(jié)果表明, 適合STR01生長的鹽度為15—35, 最適生長鹽度為25(K值0.634)。鹽度影響藻類的滲透壓和營養(yǎng)鹽的吸收。當(dāng)微藻生活的鹽度環(huán)境發(fā)生改變時, 細(xì)胞的滲透壓受到影響也隨之改變, 過低或過高的鹽度均會對微藻造成傷害[24,25]。鹽度在 10 以下, STR01幾乎完全不能生長, 在鹽度15—35 時,K值呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。藻種不同,對鹽度的適應(yīng)力也不同, 亞歷山大藻(Alexandriumsp.)偏嗜較高鹽度環(huán)境, 在低鹽度下幾乎不能生長。蛋白核小球藻適鹽范圍比較廣, 在鹽度15—45范圍內(nèi)均可以快速生長。

不同藻種的在不同的鹽度下, 總脂含量的積累也不同, 本試驗STR01總脂含量積累的適宜鹽度范圍是10—35, 鹽度30時, 總脂含量最高(13.66%)。有研究表明高鹽有利于總脂的積累, 雖然高鹽下微藻的生長率不高。在高鹽度下微藻的生長需要更多能量, 藻細(xì)胞內(nèi)的儲存的脂肪的含量相應(yīng)增加[26,27]。